CN105331668A - 一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法 - Google Patents
一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105331668A CN105331668A CN201510704177.4A CN201510704177A CN105331668A CN 105331668 A CN105331668 A CN 105331668A CN 201510704177 A CN201510704177 A CN 201510704177A CN 105331668 A CN105331668 A CN 105331668A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- radix notoginseng
- notoginseng total
- total arasaponins
- ginsenoside
- substratum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- FBFMBWCLBGQEBU-RXMALORBSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[[(3s,5r,6s,8r,9r,10r,12r,13r,14r,17s)-3,12-dihydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-17-[(2s)-6-methyl-2-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhept-5-en-2-yl]-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecah Chemical compound O([C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(C[C@@H]([C@H]4C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)C)(C)CC1)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O FBFMBWCLBGQEBU-RXMALORBSA-N 0.000 title claims abstract description 40
- FBFMBWCLBGQEBU-GYMUUCMZSA-N 20-gluco-ginsenoside-Rf Natural products O([C@](CC/C=C(\C)/C)(C)[C@@H]1[C@H]2[C@H](O)C[C@H]3[C@](C)([C@]2(C)CC1)C[C@H](O[C@@H]1[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@H]1C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]31C)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 FBFMBWCLBGQEBU-GYMUUCMZSA-N 0.000 title claims abstract description 40
- HYPFYJBWSTXDAS-UHFFFAOYSA-N Ginsenoside Rd Natural products CC(=CCCC(C)(OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O)C2CCC3(C)C4CCC5C(C)(C)C(CCC5(C)C4CC(O)C23C)OC6OC(CO)C(O)C(O)C6OC7OC(CO)C(O)C(O)C7O)C HYPFYJBWSTXDAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 40
- UOJAEODBOCLNBU-UHFFFAOYSA-N vinaginsenoside R4 Natural products C1CC(C2(CC(O)C3C(C)(C)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O UOJAEODBOCLNBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 40
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 title abstract description 8
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000180649 Panax notoginseng Species 0.000 claims description 68
- 235000003143 Panax notoginseng Nutrition 0.000 claims description 68
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 30
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 20
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 20
- 241000221955 Chaetomium Species 0.000 claims description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 14
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 12
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 9
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 7
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 7
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 5
- 238000009834 vaporization Methods 0.000 claims description 5
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 3
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- FVIZARNDLVOMSU-IRFFNABBSA-N ginsenoside C-K Chemical compound O([C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(CC[C@H]4C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)C)(C)CC1)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O FVIZARNDLVOMSU-IRFFNABBSA-N 0.000 abstract 1
- 150000007949 saponins Chemical group 0.000 description 17
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 15
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 14
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 14
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 14
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 9
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 8
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 8
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 229930182494 ginsenoside Natural products 0.000 description 7
- 229940089161 ginsenoside Drugs 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 description 3
- 235000003181 Panax pseudoginseng Nutrition 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002009 diols Chemical group 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 244000062748 Eupatorium adenophorum Species 0.000 description 1
- 235000002956 Gynostemma pentaphyllum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006509 Gynostemma pentaphyllum Species 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
本发明公开了一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法,本方法采用锥毛壳属植物内生菌<i>Coniochaeta</i><i></i>sp.EA-9或其分泌粗酶液对三七总皂苷进行生物转化,制得人参皂苷Rd和C-K;本发明方法操作简单、转化特异性强、反应条件温和,微生物次级代谢产物少,提取发酵产物简单;转化率高,可用于人参皂苷Rd的大量制备,实现人参皂苷Rd的产业化。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物转化三七总皂苷获得人参皂苷Rd的方法,该方法采用一种微生物分泌的酶类物质作为媒介来修饰总皂苷骨架结构中的糖苷键支链的方式,获得人参皂苷Rd。
背景技术
人参皂苷Rd是二醇型人参皂苷,具有广泛的生物活性,对心脑血管、抗肿瘤、神经和免疫系统等方面作用独特,如作为一种新型钙离子拮抗剂,可特异性阻断受体依赖的钙离子通道,阻断钙离子内流致使神经细胞死亡。因其结构复杂,化学合成尚不可行,需从三七、人参、绞股蓝等植物中提取获得,但因植物中含量较低,且植物资源有限,为此,利用有限的人参二醇型人参皂苷获得大量人参皂苷Rd方法更为可行简便。目前,常用的生物转化三七总皂苷获得人参皂苷Rd的方法多采用微生物发酵或提取微生物粗酶法对皂苷骨架支链结构进行糖水解,获得皂苷结构的改变。微生物发酵法的菌株来源相对复杂,且筛选具有活性或高活性的菌株相对难度大、筛选成功率低、通常选择几百株菌才可筛选出几株有皂苷转化活性的菌株,一般转化率不是很高且转化过程及转化产物种类(包括发酵微生物的自身次级代谢产物)相对复杂;提取微生物粗酶法,转化特异性高,条件温和,无需微生物发酵所需的培养基,产物目标性明确且不会产生微生物自身的次级代谢产物,但是由于酶的蛋白质属性,且从微生物中提取分离纯化有皂苷转化活性的酶难度大,且纯化后的酶需要溶解在缓冲液中保持酶活力,同时酶回收较困难等一系列问题。所以获得一种高皂苷转化活性,特异性强,次生产物少的菌株发酵方法对于获得工业化生产皂苷Rd十分重要。
发明内容
为了提高皂苷Rd的含量,解决微生物发酵法转化三七总皂苷获得人参皂苷Rd的转化率低的不足,本发明提出了一种微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法,该方法操作简单,转化特异性强,微生物次级代谢产物少,提取发酵产物简单;该方法为工业化生产人参皂苷Rd提供了一种简便方法,可将三七总皂苷中的人参皂苷Rd含量进一步提高。
本发明方法的具体操作如下:
(1)采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9;锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9已于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCCNO.11392;
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9菌进行活化培养,培养基采用PDB培养基或马丁氏培养基,将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中,每瓶含100ml已灭菌培养基,接菌过程在无菌环境进行;灭菌条件:121℃,20~30min。置于22~29℃,摇床培养3~5d,转速设置在110~180r·min-1;
培养基配制:
PDB培养基:取新鲜市售马铃薯200g,切成3~5mm见方小块,加水1000ml加热微沸30~50min,用4层纱布过滤,补足水至1L,然后添加葡萄糖20g,混匀分装灭菌备用;
马丁氏培养基:KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O0.5g,蛋白胨5.0g,葡萄糖10g,加水定容1L。
(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养,接种量为质量百分比0.02%~10%,摇床培养2~5d;
(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:4~1:10的比例,用体积百分比浓度为70%~75%的乙醇溶液溶解三七总皂苷,可适当采用超声法加快三七总皂苷粉末的溶解,为降低因底物三七总皂苷添加时引入的乙醇对培养基中菌株的破坏,可控制皂苷与乙醇溶液质量比,浸泡三七总皂苷10~30min后,在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)培养结束后的菌液中,底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.02%~1%,高浓度底物会对菌株生长产生抑制作用,不利于微生物的生长,会降低发酵过程中酶的浓度,使转化率降低,然后放置摇床继续培养6~12d;
(4)发酵结束后,采用超声法破碎菌丝团,超声10~30min,然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体,然后可适当浓缩发酵后抽滤液,发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取3~4次,合并上层正丁醇相,采用减压蒸发浓缩,即得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷。
本发明转化过程亦可采用该菌的粗酶进行催化转化,将步骤(2)接种后扩大培养5~8d,待菌丝体布满培养基时,采用离心法(5000~12000r·min-1)分离菌丝体与培养基,取上清液用醇沉法分离出粗酶,然后10000~12000r·min-1离心分离获得粗酶沉淀,最后按步骤(3)添加三七总皂苷,然后轻轻震摇转化1~3d,即可转化获得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷。
本发明所述制备方法以三七总皂为反应物,利用Coniochaetasp.EA-9菌对三七总皂苷进行生物转化,所述三七总皂苷为五加科人参属植物三七主根粉碎经提取纯化获得,提取用体积百分比70%的乙醇或纯甲醇回流提取,滤过后浓缩过D101大孔吸附树脂,水洗脱至无色,再用70%乙醇洗脱干燥获得三七总皂苷。
本发明所述Coniochaetasp.EA-9是从植物紫茎泽兰中分离获得的锥毛壳属植物内生真菌;经活化后加入到PDB培养基中与三七总皂苷发酵进行生物转化。
本发明的有益效果是,与一般的微生物发酵法相比,转化效率高,转化特异性高,经HPLC分析得出,该菌株可高效特异性地转化三七总皂苷中的人参皂苷Rb1,使其水解脱去C-20位的1→6糖苷键转化为人参皂苷Rd。发酵结束后经HPLC检测发现三七总皂苷中无明显的人参皂苷Rb1峰,故推测三七总皂苷中人参皂苷Rb1全部转化为人参皂苷Rd,后经含量标定,发现该菌亦可继续将二醇型皂苷Rb1的C-3位的两个基水解脱去,获得人参皂苷C-K,以人参皂苷Rb1为基准,经计算最终得出有88.38%的人参皂苷Rb1转化获得人参皂苷Rd,另有约11.62%的Rb1经转化获得人参皂苷C-K;最终使人参皂苷Rd在三七总皂苷中的含量提高了22.52%,生成1.95%人参皂苷C-K。另采用粗酶方法,亦可完成该转化目标,转化率暂未测定,仅进行了HPLC定性分析。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明,但本发明保护范围不局限于所述内容,实施例中方法如无特殊说明,均为常规方法,使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1:本微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法按如下步骤进行:
(1)采用常规PDB培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9菌进行活化培养,培养基采用PDB培养基,将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中,每瓶含100ml已灭菌培养基,接菌过程在无菌环境进行;灭菌条件:121℃,30min。置于25℃,摇床培养5d,转速设置在150r·min-1;
培养基配制:
PDB培养基:取新鲜市售马铃薯200g,切成3~5mm见方小块,加水1000ml加热微沸30~50min,用4层纱布过滤,补足水至1L,然后添加葡萄糖20g,混匀分装灭菌备用;
(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养,接种量为质量百分比0.02%,摇床培养5d;
(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:4的比例,用体积百分比浓度为75%的乙醇溶液溶解三七总皂苷,浸泡三七总皂苷20min后,在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)培养结束后的菌液中,底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.05%,然后放置摇床继续培养12d;
(4)发酵结束后,采用超声法破碎菌丝团,超声10min,然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体,浓缩发酵后抽滤液,发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取3次,合并上层正丁醇相,采用减压蒸发浓缩,即得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷,最终人参皂苷Rd含量为30.35%,人参皂苷C-K含量为1.95%。
实施例2:本微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法按如下步骤进行:
(1)采用常规马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9菌进行活化培养,培养基采用马丁氏培养基,将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中,每瓶含100ml已灭菌培养基,接菌过程在无菌环境进行;灭菌条件:121℃,25min。置于22℃,摇床培养4d,转速设置在110r·min-1;
培养基配制:
马丁氏培养基:KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O0.5g,蛋白胨5.0g,葡萄糖10g,加水定容1L。
(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养,接种量为质量百分比2%,摇床培养3d;
(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:6的比例,用体积百分比浓度为70%的乙醇溶液溶解三七总皂苷,浸泡三七总皂苷10min后,在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)培养结束后的菌液中,底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.5%,然后放置摇床继续培养8d;
(4)发酵结束后,采用超声法破碎菌丝团,超声20min,然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体,浓缩发酵后抽滤液,发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取4次,合并上层正丁醇相,采用减压蒸发浓缩,即得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷,人参皂苷Rd含量为29.80%,人参皂苷C-K含量为1.89%。
实施例3:本微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法按如下步骤进行:
(1)采用常规马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9菌进行活化培养,培养基采用马丁氏培养基,将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中,每瓶含100ml已灭菌培养基,接菌过程在无菌环境进行;灭菌条件:121℃,20min。置于28℃,摇床培养3d,转速设置在180r·min-1;
培养基配制:
马丁氏培养基:KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O0.5g,蛋白胨5.0g,葡萄糖10g,加水定容1L。
(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养,接种量为质量百分比9%,摇床培养2d;
(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:10的比例,用体积百分比浓度为73%的乙醇溶液溶解三七总皂苷,浸泡三七总皂苷30min后,在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)培养结束后的菌液中,底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的1%,然后放置摇床继续培养8d;
(4)发酵结束后,采用超声法破碎菌丝团,超声30min,然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体,浓缩发酵后抽滤液,发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取4次,合并上层正丁醇相,采用减压蒸发浓缩,即得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷,人参皂苷Rd含量为31%,人参皂苷C-K含量为2.08%。
实施例4:本微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法按如下步骤进行:
(1)采用常规PDB培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9菌进行活化培养,培养基采用PDB培养基,将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中,每瓶含100ml已灭菌培养基,接菌过程在无菌环境进行;灭菌条件:121℃,30min;置于25℃,摇床培养5d,转速设置在150r·min-1;
培养基配制:
PDB培养基:取新鲜市售马铃薯200g,切成3~5mm见方小块,加水1000ml加热微沸30~50min,用4层纱布过滤,补足水至1L,然后添加葡萄糖20g,混匀分装灭菌备用;
(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养,接种量为质量百分比0.02%,摇床培养8d;待菌丝体布满培养基时,12000r·min-1离心,取上清液用醇沉法分离出粗酶,然后10000r·min-1离心分离获得粗酶沉淀,按1g粗酶添加磷酸缓冲液1L的比例,用pH6磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀,制得粗酶液;
(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:4的比例,用体积百分比浓度为75%的乙醇溶液溶解三七总皂苷,浸泡三七总皂苷20min后,在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)粗酶液中,底物三七总皂苷的添加量为酶液质量的0.05%,然后轻轻震摇转化1d;即可转化获得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷;人参皂苷Rd含量为28.30%,人参皂苷C-K含量为1.65%。
实施例5:本微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法按如下步骤进行:
(1)采用常规马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9菌进行活化培养,培养基采用马丁氏培养基,将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中,每瓶含100ml已灭菌培养基,接菌过程在无菌环境进行;灭菌条件:121℃,30min;置于25℃,摇床培养5d,转速设置在150r·min-1;
培养基配制:
马丁氏培养基:KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O0.5g,蛋白胨5.0g,葡萄糖10g,加水定容1L。
(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养,接种量为质量百分比5%,摇床培养6d;待菌丝体布满培养基时,6000r·min-1离心,取上清液用醇沉法分离出粗酶,然后12000r·min-1离心分离获得粗酶沉淀,按1g粗酶添加磷酸缓冲液0.8L的比例,用pH7磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀,制得粗酶液;
(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:8的比例,用体积百分比浓度为70%的乙醇溶液溶解三七总皂苷,浸泡三七总皂苷30min后,在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)粗酶液中,底物三七总皂苷的添加量为酶液质量的0.5%,然后轻轻震摇转化2d;即可转化获得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷;人参皂苷Rd含量为31.84%,人参皂苷C-K含量为2.14%。
Claims (2)
1.一种微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法,其特征在于按如下步骤进行:
(1)采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9;
(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养,接种量为质量百分比0.02%~10%,摇床培养2~5d;
(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:4~1:10的比例,用体积百分比浓度为70%~75%的乙醇溶液溶解三七总皂苷,浸泡10~30min后,在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)培养结束后的菌液中,继续摇床培养6~12d,其中三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.02%~1%;
(4)发酵培养结束后,采用超声法破碎菌丝团,超声时间10~30min,然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体,发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取3~4次,合并上层正丁醇相,减压蒸发浓缩,即得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷;
所述锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA-9在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.11392。
2.权利要求1所述的微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法,其特征在于:步骤(2)接种后扩大培养5~8d,5000~12000r·min-1离心,取上清液用醇沉法分离出粗酶,然后10000~12000r·min-1离心分离获得粗酶沉淀,按1g粗酶添加磷酸缓冲液0.1~2L的比例,用pH6.00~7.00磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀,最后按步骤(3)添加三七总皂苷,然后轻轻震摇转化1~3d,即可转化获得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510704177.4A CN105331668B (zh) | 2015-10-27 | 2015-10-27 | 一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510704177.4A CN105331668B (zh) | 2015-10-27 | 2015-10-27 | 一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105331668A true CN105331668A (zh) | 2016-02-17 |
CN105331668B CN105331668B (zh) | 2018-08-31 |
Family
ID=55282431
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510704177.4A Active CN105331668B (zh) | 2015-10-27 | 2015-10-27 | 一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105331668B (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106591142A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-04-26 | 昆明理工大学 | 一种炭角目菌植物内生菌及应用 |
CN109123281A (zh) * | 2018-08-10 | 2019-01-04 | 江苏参源康生物科技有限公司 | 一种人参皂苷饮液的制备方法 |
CN109468359A (zh) * | 2018-12-04 | 2019-03-15 | 长春中医药大学 | 一种人参皂苷Rk6的制备方法 |
CN110592142A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-20 | 山东萃茵生物科技有限公司 | 清洁型黄姜发酵工艺 |
CN110982869A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-10 | 昆明理工大学 | 一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法 |
CN113717860A (zh) * | 2021-07-07 | 2021-11-30 | 昆明理工大学 | 黄篮状菌在三七总皂苷转化为小极性人参皂苷中的应用 |
CN116731880A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-09-12 | 昆明理工大学 | 一种内生真菌多量毛霉及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002046152A2 (de) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Coniosetin und derivate davon, verfahren zur herstellung und verwendung derselben |
US7067303B1 (en) * | 2003-01-24 | 2006-06-27 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Culture containing biomass acid hydrolysate and Coniochaeta ligniaria fungus |
CN103099832A (zh) * | 2011-11-10 | 2013-05-15 | 冯淑琴 | 假丝酵母对三七的生物转化方法 |
CN104894204A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-09-09 | 金凤燮 | 微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法 |
-
2015
- 2015-10-27 CN CN201510704177.4A patent/CN105331668B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002046152A2 (de) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Coniosetin und derivate davon, verfahren zur herstellung und verwendung derselben |
US7067303B1 (en) * | 2003-01-24 | 2006-06-27 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Culture containing biomass acid hydrolysate and Coniochaeta ligniaria fungus |
CN103099832A (zh) * | 2011-11-10 | 2013-05-15 | 冯淑琴 | 假丝酵母对三七的生物转化方法 |
CN104894204A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-09-09 | 金凤燮 | 微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
陈重华等: "三七皂苷R_1、人参皂苷R_d对微循环及凝血作用的影响", 《华西医科大学学报》 * |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106591142A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-04-26 | 昆明理工大学 | 一种炭角目菌植物内生菌及应用 |
CN106591142B (zh) * | 2016-08-31 | 2020-10-02 | 昆明理工大学 | 一种炭角目菌植物内生菌及应用 |
CN109123281A (zh) * | 2018-08-10 | 2019-01-04 | 江苏参源康生物科技有限公司 | 一种人参皂苷饮液的制备方法 |
CN109468359A (zh) * | 2018-12-04 | 2019-03-15 | 长春中医药大学 | 一种人参皂苷Rk6的制备方法 |
CN110592142A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-20 | 山东萃茵生物科技有限公司 | 清洁型黄姜发酵工艺 |
CN110982869A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-10 | 昆明理工大学 | 一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法 |
CN110982869B (zh) * | 2019-12-19 | 2023-05-16 | 昆明理工大学 | 一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法 |
CN113717860A (zh) * | 2021-07-07 | 2021-11-30 | 昆明理工大学 | 黄篮状菌在三七总皂苷转化为小极性人参皂苷中的应用 |
CN113717860B (zh) * | 2021-07-07 | 2023-05-16 | 昆明理工大学 | 黄篮状菌在三七总皂苷转化为小极性人参皂苷中的应用 |
CN116731880A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-09-12 | 昆明理工大学 | 一种内生真菌多量毛霉及其应用 |
CN116731880B (zh) * | 2023-06-16 | 2024-04-26 | 昆明理工大学 | 一种内生真菌多量毛霉及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105331668B (zh) | 2018-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105331668A (zh) | 一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法 | |
CN102618594B (zh) | 一种提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法 | |
CN103060416B (zh) | 一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法 | |
CN101831471B (zh) | 利用食用、药用真菌发酵黄浆水生产多糖的方法 | |
CN103416223B (zh) | 一种提高北冬虫夏草发酵液中虫草素产量的方法 | |
CN104312928B (zh) | 一株产纤维素酶菌株及其应用 | |
CN101880700B (zh) | 一种提高灵芝多糖产量的液体发酵方法 | |
CN103266154A (zh) | 制备高活性茶皂甙的生物转化方法 | |
CN106047713A (zh) | 一株嗜松篮状菌菌株Li‑93及其应用 | |
CN103483040A (zh) | 冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基及其发酵生产方法 | |
CN102154427B (zh) | 一种利用微生物发酵提取茶皂素的方法 | |
CN103667082A (zh) | 一种蜜环菌浓缩液的制备方法 | |
CN105255745A (zh) | 一株产β-葡萄糖苷酶根霉及其发酵产酶方法 | |
CN103045487B (zh) | 一株生产柠檬酸的菌株及其发酵生产柠檬酸的方法 | |
CN103966112B (zh) | 多形汉逊酵母重组菌株及其在龙胆苦苷生物合成中的应用 | |
CN104087632B (zh) | 一种深层液态发酵生产桑黄胞外多糖的方法 | |
CN101928671A (zh) | 一种链格孢属菌及其发酵人参茎叶总皂苷制备人参皂苷Rg3的方法 | |
CN110982869B (zh) | 一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法 | |
CN104404016A (zh) | 一种生产柚苷酶的方法 | |
CN105294395A (zh) | 一种同步提取-组合柱层析-结晶纯化制备虫草酸、虫草素的方法 | |
CN106491661B (zh) | 一种鲜虫草原浆的提取方法 | |
CN106591142A (zh) | 一种炭角目菌植物内生菌及应用 | |
CN107893043A (zh) | 一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株及其应用 | |
CN103865803B (zh) | β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备京尼平和白藜芦醇中的应用 | |
CN106566848A (zh) | 一种利用角担菌合成缬草素的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |