CN102618594B - 一种提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法 - Google Patents

一种提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用扩张蛋白提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法，包括如下步骤：(1)将灵芝菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，得种子液；(2)将种子液接种于液体发酵培养基中，液体发酵培养3～5天，然后加入扩张蛋白溶液，然后继续培养5～7天，分离，得到灵芝菌丝体；(3)从灵芝菌丝体中提取黄酮类成分，得到总黄酮。本发明将植物扩张蛋白用于灵芝黄酮类成分的液体发酵生产，且优化了发酵工艺和提取方法，大幅度提高灵芝中总黄酮的产量，使每升发酵液产量达到760.1mg，具有很好的工业化应用前景。

Description

一种提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法
技术领域
本发明具体涉及一种利用扩张蛋白提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法，属于生物发酵工程技术领域。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)是担子菌纲多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganodelma)真菌赤芝Ganoderma.lucidum·karst和紫芝Ganoderma.japonicrn Lloyd的总称，具有扶正固本等功效，被《本经》称为上品。灵芝作为拥有数千年药用历史的中国传统珍贵药材，具备很高的药用价值，经过科研机构数十年的现代药理学研究证实，灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效，医学证明赤灵芝、紫芝、云芝药用价值最高。近年来，对灵芝属真菌的化学成分及临床研究颇多，其中黄酮类物质成分的功效是多方面的，是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，黄酮类物质阻止氧化的能力是维生素E的十几倍以上，可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以组成不同的黄酮苷类。黄酮类化合物作为保健产品首次引起国际医药界的注意是在廿世纪八十年代末。实验证明灵芝黄酮可以改善血液循环，降低胆固醇，改善心脑血管疾病的症状，还可以降低26％的血糖和39％的三元脂肪酸丙酯，稳定胶原质对糖尿病引起的视网膜病及毛细血管脆化有很好的作用。
目前，已从灵芝中分离出10多种黄酮类化合物，包括黄酮类、黄酮醇类和双氢黄酮类等。但是，灵芝黄酮类成分的产量成为抑制其应用的限制因素，在自然界中野生灵芝十分稀少，远不能满足人们的需要。采用灵芝液体发酵的方法生产灵芝药用活性成分因为具有生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。国内外主要是对灵芝菌丝体培养生产活性药用成分研究和工艺应用主要集中在发酵条件及产物提取分离等层面上，整体发酵水平不高。
如专利文献CN 1264743A(申请号00111953.2)公开了一种液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺。它采用微生物为灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss exFr.)Karst.的菌种，用液体好氧发酵法、液体好氧发酵-液体静置培养法或液体静置培养法进行生产，可以同时获得灵芝胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸，灵芝酸含量可达2.8毫克/100毫克，胞内和胞外多糖总量高达2.34克/升。该方法需要静置培养诱导合成产物的过程，发酵周期长，液体好氧发酵加上静置培养的总发酵时间需20天以上，生产效率低，还不能满足现代工业化发酵生产的需要。对灵芝黄酮成分的高产液体发酵和提取技术还未见文献报道，更加限制其工业化应用的发展。
扩张蛋白是近年在植物细胞壁中发现的一类新型蛋白，最先是从黄瓜下胚轴伸长区分离纯化得到，研究表明在燕麦胚芽鞘细胞壁、栝楼根尖细胞壁、番茄、烟草、拟南芥、水稻、棉纤维、玉米、大豆等细胞壁中也有扩张蛋白的存在，与促进其细胞生理生长，影响营养生长、形态发生、授粉受精、果实软化等生理生长过程有关。利用重组细胞壁实验研究证实了扩张蛋白具有诱导热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功能，推测其能够打断细胞壁多聚物之间的氢键进而诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛等生理活动，是植物生长过程中生理调控、细胞壁延伸的主要生理调节物质。但是，关于扩张蛋白的作用机制国内外均未有明确的定论，将扩张蛋白应用于灵芝的液体发酵生产，提高其黄酮类有效成分的产量国内外尚未见报道。
发明内容：
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用扩张蛋白提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法。
本发明技术方案如下：
一种提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法，包括如下步骤：
(1)将灵芝菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，得种子液；
(2)将步骤(1)制得种子液按5～10％体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25～30℃的条件下，液体发酵培养3～5天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.3～2.0mg/mL，然后继续培养5～7天，分离，得到灵芝菌丝体；
(3)从步骤(2)制得的灵芝菌丝体中提取黄酮类成分，得到总黄酮。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的PD液体发酵培养基，每升组分如下：
去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化培养条件为：摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，暗培养活化3～5天。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下：
乳糖20g，蔗糖20g，黄豆粉25g，蛋白胨2g，酵母浸膏1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，水定容至1000mL，pH 6.0。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0.5～2.0mg/mL；进一步优选0.75～1.75mg/mL。最优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为1.5mg/mL。
所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备，如采用McQueen-Mason等在McQueen-Mason S J，Durachko D M，Cosgrove D J.Two endogenous proteins that induce cellwall ext ension in plants.Plant Cell，1992，4：1425～1433中的记载的方法制备；也可以按照如下方法制备扩张蛋白溶液：
将大豆或黄瓜种子经0.05～0.15wt％HgCl2消毒4～6min，流水冲洗5～7h，然后，25～28℃暗培养4～6天；剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，置-20℃预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取44～50h，过滤，按0.3～0.5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置45～50h，4℃条件下25000g离心5～10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
上述扩张蛋白溶液制备方法中，所述匀浆缓冲液组分为：25mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，1.5mmol/L Na2S2O5，2mmol/L EDTA，0.1wt％Triton X-100，pH 7.0；所述提取液组分为：15mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，1.5mmol/L Na2S2O5，0.5mol/L NaCl，pH 6.0；所述酸性缓冲液配制是：将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，蒸馏水定容至1L。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的分离方法为：4℃15000r/min条件下离心分离10min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中灵芝菌丝体中提取黄酮类成分的方法，可参照(范小均等，超声波提取落羽杉叶总黄酮的工艺研究，甘肃农业科技，2008(11)：13～14)中所述方法，也可按如下步骤如下：
将步骤(2)制得的灵芝菌丝体65℃烘干，研成粉末，加入70～80％乙醇，60～70℃、40kHz功率200W条件下，超声提取3～5h，过滤，取滤液，滤渣重复上述超声提取、过滤步骤2～3次，合并滤液，即得黄酮类成分。
本发明同已有技术相比有如下优点：
1.本发明将植物扩张蛋白用于灵芝黄酮类成分的液体发酵生产，且优化了发酵工艺和提取方法，大幅度提高灵芝中总黄酮的产量，使每升发酵液产量达到760.1mg，提取的总黄酮可直接用于免疫力调节、抗肿瘤、降血糖等药物的制备，本发明的技术工艺和方法同样适用于发酵罐规模化生产，具有很好的工业化应用前景。
2.本发明所采用的灵芝菌丝体液体发酵工艺和提取方法简单，重复性好，无需静置培养等诱导合成产物的步骤，发酵周期短，效率高，同时利用天然产物作为生产原料，环保无毒，成本低。整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业化生产和应用推广。本发明灵芝发酵菌种同样适用于其它普通蛹虫草栽培品种。
3.本发明所述扩张蛋白可从大多数双子叶和单子叶植物及真菌等不同物种中提取，来源广泛，成本较低，制备方法也相对简单，可规模提取生产，对灵芝黄酮类活性物质的发酵生产具有很好的促进效果。
附图说明
图1是不同浓度的扩张蛋白溶液对灵芝菌丝体中总黄酮产量的影响曲线；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但本发明所保护范围不限于此。
原料及培养基
实施例中所述的灵芝菌种选用泰山赤灵芝(Ganoderma lucidum)，菌种编号为CGMCCNo.5.644；和信州灵芝(Ganoderma lucidum)菌种编号为CGMCC No.5.534。上述灵芝菌种均购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实施例中所述芦丁标准品购自济南盛伟生物科技有限公司，其它试剂均为常用市售产品。
实施例中所述的扩张蛋白溶液的制备步骤如下：
将大豆(Glycine max L.Merr.CV.M40；购自济南伟丽种业有限公司)或黄瓜(Cucumissativus L.CV.Jinnian No.6；购自济南伟丽种业有限公司)种子经0.1wt％HgCl2消毒5min，流水冲洗6h，然后，栽入湿蛭石中，27℃暗培养5d。剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，即生长区约100g，置-20℃冰箱预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，高速匀浆后，用70μm尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置2h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取48h，过滤，滤液按0.4g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置48h，4℃条件下25000g离心10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃条件下用截留分子量为3000Da的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋(购自北京博润莱特科技有限公司)透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液，置4℃下保存。其他未描述步骤可参照McQueen-Mason等在McQueen-Mason S J，Durachko D M，Cosgrove DJ.Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants.Plant Cell，1992，4：1425～1433中的描述进行。
上述匀浆缓冲液组分为：25mmol/L HERES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，1.5mmol/LNa2S2O5，2mmol/L EDTA，0.1wt％Triton X-100，pH 7.0；
上述提取液组分为：15mmol/LHERES，1.0mmol/LEDTA，1.5mmol/LNa2S2O5，0.5mol/LNaCl，pH 6.0；
所述酸性缓冲液每升按如下方法配制：
将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1L。
扩张蛋白溶液浓度的测定方法采用考马斯亮蓝法检测，具体可参照(《精编蛋白质科学实验指南》，ISBN：703018086，出版日期1900-1-1)中记载的考马斯亮蓝法进行操作，以牛血清白蛋白作标准曲线，经检测上述扩张蛋白溶液中扩张蛋白浓度为0.31g/mL。
实施例中所述PD液体发酵培养基，每升组分如下：
去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
实施例中所述的液体发酵培养基，每升组分如下：
乳糖20g，蔗糖20g，黄豆粉25g，蛋白胨2g，酵母浸膏1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，水定容至1000mL，pH 6.0。
实施例1：
一种提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法，包括如下步骤：
(1)将泰山赤灵芝(Ganoderma lucidum)菌种，菌种编号为CGMCC No.5.644，接种到PD液体发酵培养基中，摇床转速150r/min，温度28℃，暗培养活化3天，得种子液；
(2)将步骤(1)制得种子液按10％体积比接种于液体发酵培养基中，在温度30℃的条件下，液体发酵培养3天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.5mg/mL，然后继续培养7天，15000r/min条件下离心分离10min，得到灵芝菌丝体；
(3)将步骤(2)1L发酵液制得的灵芝菌丝体65℃烘干，研成粉末，制得菌丝粉末1314.7mg，取菌丝粉末100mg，加入2mL 70％乙醇，65℃、40kHz功率200W下，超声提取3h，过滤，滤液封口置4℃下冷藏保存，滤渣重复上述超声提取、过滤步骤3次，合并滤液，得到总黄酮。
总黄酮待测样品的制备
通过1L发酵液取制得的黄酮类成分，用体积浓度为70％的乙醇溶液定容至50mL，制得黄酮类成分待测样品。
总黄酮的测定
采用本领域常规的比色法测定方法(参照《生物化学实验方法和技术》，ISBN：978-7-03-010685-8，日期2009.7)：
(1)标准曲线的建立
精确称取芦丁标准品0.5g，置于25mL容量瓶中，用体积浓度30％的乙醇溶液溶解，稀释至刻度。精确量取10mL，置于100mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得2.0mg/mL的芦丁标准品溶液。精确量取0mL，1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，6mL，7mL标准品溶液，分别置于25mL的容量瓶中，加体积浓度30％的乙醇溶液补足至6mL，各加5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置5min，再各加10wt％硝酸铝溶液1mL，摇匀放置5min，再各加1wt％氢氧化钠溶液10mL，分别用体积浓度30％的乙醇溶液稀释至刻度。以标准液0mL管为空白对照，在波长510nm处测吸收度。以吸收度为横坐标，以总黄铜含量为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)总黄酮产量的检测
取制得的总黄酮待测样品0.5mL于25mL容量瓶中，加体积浓度30％的乙醇溶液补足至6mL，加5wt％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置5min，再加10wt％硝酸铝溶液1mL，摇匀放置5min，再加1wt％氢氧化钠溶液10mL，分别用体积浓度30％的乙醇溶液稀释至刻度，以只加6mL体积浓度30％的乙醇溶液稀释至刻度的样品作空白对照，在波长510nm处测吸收度。从标准曲线上对应计算获得待测样品中总黄酮含量为3.726mg，得到黄酮发酵液每升总黄酮含量为3.726×100＝372.6mg(测定值×100的倍数＝对应1L发酵液的总黄酮含量)。具体结果见图1。
实施例2：
如实施例1所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中，在温度30℃的条件下，液体发酵培养4天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为1.5mg/mL，然后继续培养6天。
从标准曲线上对应计算获得待测样品中总黄酮含量为7.601mg，即得到黄酮发酵液每升总黄酮含量为7.601×100＝760.1mg(测定值×100的倍数＝对应1L发酵液的总黄酮含量)。具体结果见图1。
实施例3：
如实施例1所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中，在温度30℃的条件下，液体发酵培养5天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为2.0mg/mL，然后继续培养5天。
经检测计算，
从标准曲线上对应计算获得待测样品中总黄酮含量为5.017mg，得到黄酮发酵液每升总黄酮含量为5.017×100＝501.7mg(测定值×100的倍数＝对应1L发酵液的总黄酮含量)。具体结果见图1。
实施例4：
如实施例1所述的方法，不同之处在于，所采用菌种为信州灵芝(Ganoderma lucidum)菌种编号为CGMCC No.5.534，且步骤(2)中，在温度30℃的条件下，液体发酵培养4天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为1.5mg/mL，然后继续培养6天。
从标准曲线上对应计算获得待测样品中总黄酮含量为6.955mg，得到黄酮发酵液每升总黄酮含量为6.955×100＝695.5mg(测定值×100的倍数＝对应1L发酵液的总黄酮含量)。
对比例1：
如实施例1所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中，不加入扩张蛋白溶液，在温度30℃的条件下，液体发酵培养10天。
从标准曲线上对应计算获得待测样品中总黄酮含量为1107mg，得到黄酮发酵液每升总黄酮含量为1.107×100＝110.7mg(测定值×100的倍数＝对应1L发酵液的总黄酮含量)。具体结果见图1。

Claims (2)

1.一种提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将灵芝菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，得种子液；
（2）将步骤（1）制得种子液按5～10 %体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25～30 ℃的条件下，液体发酵培养3～5天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.5～2.0 mg/mL，然后继续培养5～7天，分离，得到灵芝菌丝体；
（3）从步骤（2）制得的灵芝菌丝体中提取黄酮类成分，得到总黄酮；
所述步骤（2）中的液体发酵培养基，每升组分如下：
乳糖20 g，蔗糖20 g，黄豆粉25 g，蛋白胨2 g，酵母浸膏1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， KH2PO4 0.5 g，水定容至1000 mL，pH 6.0；
所述步骤（2）中的扩张蛋白溶液制备方法如下：
将大豆或黄瓜种子经0.05～0.15 wt% HgCl2消毒4～6 min，流水冲洗5～7 h，然后，25～28 ℃暗培养4～6天；剪取幼苗下胚轴顶端3～4 cm，置-20 ℃预冷0.5 h，加预冷至4 ℃的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70 μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3 h，得静置液；向静置液中加入提取液，4 ℃下提取44～50 h，过滤，按0.3～0.5 g/mL的添加量向滤液中缓慢添加（NH4）2SO4，添加（NH4）2SO4过程中不断搅拌，防止（NH4）2SO4局部过饱和，然后静置45～50 h， 4 ℃条件下25000 g离心5～10 min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4 ℃下分子量3000 Da的透析袋透析，透析液经20000 g离心10 min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液；
上述扩张蛋白溶液制备方法中，所述匀浆缓冲液组分为：25 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.5 mmol/L Na2S2O5，2 mmol/L EDTA，0.1 wt% Triton X-100，pH 7.0；
所述提取液组分为：15 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸，1.5 mmol/L Na2S2O5，0.5 mol/L NaCl，pH 6.0；
所述酸性缓冲液配制是：将2.05 g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1 L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的活化培养条件为：摇床转速100～180 r/min，温度25～30℃，暗培养活化3～5天。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，扩张蛋白的浓度为0.75～1.75mg/mL。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，扩张蛋白的浓度为1.5 mg/mL。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的分离方法为：4 ℃ 15000 r/min条件下离心分离10 min。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中灵芝菌丝体中提取黄酮类成分的方法按如下步骤如下：
将步骤（2）制得的灵芝菌丝体65 ℃烘干，研成粉末，加入70～80 %乙醇，60～70 ℃、40 kHz功率200 W条件下，超声提取3～5 h，过滤，取滤液，滤渣重复上述超声提取、过滤步骤2～3次，合并滤液，即得黄酮类成分。
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