CN105087522B - 一种真菌菌丝体液体深层发酵中产生的胞内酶的提取方法 - Google Patents

一种真菌菌丝体液体深层发酵中产生的胞内酶的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种真菌菌丝体液体深层发酵中产生的胞内酶的提取方法，该方法包括：取发酵液，分离得到菌丝体，菌丝体用水稀释后，依次进行打浆处理、超声破碎处理，得到粗酶液。本发明采用打浆处理和超声破碎处理结合的方法，获取真菌菌丝体液体深层发酵中产生的胞内酶的粗酶液，酶活损失少。本发明方法操作简单，方便可行，适用于多种真菌菌丝体液体深层发酵产酶的提取，如灵芝、香菇、灰树花等。

Description

一种真菌菌丝体液体深层发酵中产生的胞内酶的提取方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种真菌菌丝体液体深层发酵中产生的胞内酶的提取方法。
背景技术
灵芝是一种极其珍贵的药用真菌，具有多种生理功能和宝贵的药用价值。灵芝子实体中所含有的多种生物活性物质，如灵芝多糖、灵芝三萜以及多种酶类等，同时存在于液体培养的菌丝体中。
传统上，灵芝是通过野外采集或人工栽培获得，以子实体或孢子入药，但灵芝子实体形成周期长，所需劳动强度大。通过液体深层发酵培养可加速菌丝生成，缩短生长周期。液体深层发酵技术具有生产量大、占地少、周期短、产品质量稳定、容易控制等优点，并且，有些目前不能栽培的食用菌也可以通过液体深层发酵的方法生产菌丝体和其它代谢产物。
申请公布号为CN102488719A的发明专利申请文献公开了一种利用中药提取物提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，该方法在灵芝菌丝体液体发酵时，采用含中药提取物的培养基进行灵芝菌丝体液体发酵培养，具体包括：称取中药材，制备中药提取物；向PDA培养基中加入步骤1制备的中药提取物，制备含有中药提取物的PDA培养基；向步骤(2)制备的含有中药提取物的PDA培养基中接入灵芝菌种，菌种接种量为5～15％留在温度28～30℃，转速120～150r/min条件下，摇床培养7～10d。
研究表明，灵芝、香菇等担子菌具有较好的产β-葡萄糖苷酶活性，β-葡萄糖苷酶的特性是可水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-葡萄糖和相应的配基，所以广泛用于大豆异黄酮糖苷的转化。
另外，灵芝在发酵过程中会产生大量的菌丝，实验发现，在灵芝发酵过程中有一部分酶被释放到发酵液中，而还有一部分存在于灵芝菌丝体中，因此需要对灵芝菌丝体细胞进行破碎处理，使酶从细胞内释放出来，从而提高其酶的活力。
目前，细胞破碎的方式有很多，例如高压匀浆、研磨、反复冻融、超声破碎、渗透压冲击、酶溶、化学渗透等。但是，上述常规方法易造成破碎过程中酶活的损失，以及存在经济、安全等不利因素；
因此，有必要提供一种更为温和的提取方法，以改善上述问题。
发明内容
本发明提供了一种真菌菌丝体液体深层发酵中产生的胞内酶的提取方法，该方法操作简单，效果显著，酶活损失少，同时适用于各类真菌菌丝体发酵产酶的提取。
一种真菌菌丝体液体深层发酵中产生的胞内酶的提取方法，该方法包括：取发酵液，分离得到菌丝体，菌丝体用水稀释后，依次进行打浆处理、超声破碎处理，得到粗酶液。
上述分离菌丝体和发酵液的方法为抽滤，而非离心，因为可使固液分离得更为彻底，同时避免了菌丝体因离心升温而造成的酶活的损失。
上述打浆处理以及超声破碎处理均处于冰水浴中进行。菌丝体先经打浆处理，以打散并破碎菌丝球，再进行超声破碎处理，以破碎菌丝细胞。
作为优选，所述打浆处理的温度为-10～10℃，时间为0.5～1.0min。
作为优选，所述打浆处理的转速为20000～21000r/min。
更优选，打浆处理过程中，打浆处理过程中，打浆0.5～1.0min后间歇1～2min；进一步优选，打浆处理过程中，打浆1.0min后间歇1min。
作为优选，所述超声破碎处理的超声功率为180～220W。
作为优选，所述超声破碎处理的温度为-10～10℃，时间为5～10min。
更优选，超声破碎处理过程中，每超声破碎1～2min间歇1～2min，超声的次数为4～6次。
本发明所述的真菌为药用真菌或者食用真菌；具体指，灵芝、香菇或灰树花；更优选，所述的真菌为灵芝。
所述的胞内酶为β-葡萄糖苷酶。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用打浆处理和超声破碎处理结合的方法，获取真菌菌丝体液体深层发酵中产生的胞内酶的粗酶液，酶活损失少；
(2)本发明方法操作简单，方便可行，适用于多种真菌菌丝体液体深层发酵产酶的提取，如灵芝、香菇、灰树花等。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的方法。这些实施例仅用于说明本发明而不限制其范围。
(1)菌种培养方法
斜面菌种活化：将一代灵芝菌接种至斜面培养基上，放置28℃生化培养箱中培养至斜面长满菌丝体为止，一股6-8天。
种子制备：250mL三角瓶中装100mL液体种子培养基，用接种铲刮取法接入经活化的斜面灵芝两试管，放置28℃摇床中，摇床转速180r/min，培养7天，供实验作种子用。
菌种发酵：250mL三角瓶中装100mL发酵培养基，接种量为10％，摇床转速180r/min，培养温度28℃，培养时间5-10天。
(2)培养基
斜面培养基：PDA 4.5％、琼脂1.7％、KH2PO40.3％、MgSO40.15％、VB10.005％。
种子培养基：PDB 3.5％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.3％、KH2PO40.3％、MgSO40.15％、VB10.005％、pH5.5。
发酵培养基：22麦芽汁27％、豆粕粉6％、KH2PO40.3％、MgSO40.15％、VB10.005％。、pH5.5。
(3)酶活测定方法
本发明采用比色法，以对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物进行酶解，底物水解后释放出来的对硝基苯酚在400-420nm可见光范围内有特征吸收峰，可直接在400～420nm之间比色测定。
酶活定义：β-葡萄糖苷酶酶活力单位(U)定义为，在pH5.0，50℃反应条件下，一分钟时间内底物被水解释放出1μmol的pNP所需要的酶量。
实施例1
本实施例采用赤芝作为菌种，该菌种购于河南省科学院食用菌工程技术中心。
1、菌丝体与发酵液的分离
将赤芝按照上述菌种培养方法进行发酵培养，发酵8天后，进行抽滤，分离菌丝体和发酵液；其中，发酵液用比色法测定β-葡萄糖苷酶酶活，菌丝经无菌水多次洗涤后，进行β-葡萄糖苷酶的提取。
2、分离的菌丝体按照以下方法进行粗酶液的提取
(1)打浆处理
向步骤1提取出的菌丝体中加入蒸馏水，在冰浴(-10～10℃)中进行打浆处理(打浆时的转速为22000r/min)，每打浆1min间歇1min，打浆次数设置为1次、3次、5次、7次，得到粗酶液。
(2)反复冻融
该方法不进行菌丝体与发酵液的分离，将发酵后的菌液分别置于-20℃、-40℃和-80℃下冷冻8h，然后常温解冻1h，反复三次，得粗酶液。
(3)超声破碎
向步骤1提取出的菌丝体中加入蒸馏水，在冰浴(-10～10℃)中进行超声破碎，超声功率200W，每超声1min间歇1min，超声次数为1次、5次、10次、15次、20次，得粗酶液。
(4)升温自溶
该方法也不进行菌丝体与发酵液的分离，当菌种发酵至第6天时，将培养温度分别调到28℃、34℃、40℃、46℃，到第8天发酵结束，发酵液即为粗酶液。
(5)打浆处理+超声破碎
向步骤1提取出的菌丝体中加入蒸馏水，在冰浴(-10～10℃)中进行打浆处理(打浆时的转速为22000r/min)，打浆1min后，在冰浴(-10～10℃)中进行超声破碎，超声功率200W，每超声1min间歇1min，超声次数为5次、8次、10次，得粗酶液。
(6)打浆处理+反复冻融
向步骤1提取出的菌丝体中加入蒸馏水，在冰浴(-10～10℃)中进行打浆处理(打浆时的转速为22000r/min)，打浆1min后，置于-40℃下冷冻8h，然后常温解冻1h，反复三次，得粗酶液。
(7)打浆处理+超声破碎+反复冻融
向步骤1提取出的菌丝体中加入蒸馏水，在冰浴(-10～10℃)中进行打浆处理(打浆时的转速为22000r/min)，打浆1min后，在冰浴(-10～10℃)中进行超声破碎，超声功率200W，每超声1min间歇1min，超声次数为5次，置于-40℃下冷冻8h，然后常温解冻1h，反复三次，得粗酶液。
(8)反复冻融+打浆处理+超声破碎
该方法不进行菌丝体与发酵液的分离，将发酵后的菌液置于-40℃冷冻8h，然后常温解冻1h，反复三次，然后在冰浴(-10～10℃)中进行打浆处理(打浆时的转速为22000r/min)，打浆1min后，在冰浴(-10～10℃)中进行超声破碎，超声功率200W，每超声1min间歇1min，超声次数为5次，得粗酶液。
3、采用上文所述的酶活测定方法测定上述不同提取方法所得粗酶液的酶活，具体如表1所示；
表1 菌丝体采用不同提取方法所测得的总酶活的结果对比
从表1可知，采用方法(5)“打浆处理+超声破碎”的效果最佳；并且先打浆处理1min，再超声破碎10min时，测得的酶活最高，为3.22U/mL，比不经任何提取处理的酶活高2.19倍；此外，当先打浆处理1min，再超声破碎5min时，酶活就已经达到3.12U/mL，这与单一的超声破碎处理相比节省了一半的超声时间。
实施例2
本实施例采用灰树花作为菌种，该菌种来源于本实验室保存菌种。
1、菌丝体与发酵液的分离
将灰树花按照上述菌种培养方法进行发酵培养，发酵8天后，进行抽滤，分离菌丝体和发酵液；其中，发酵液用比色法测定β-葡萄糖苷酶酶活，菌丝经无菌水多次洗涤后，进行β-葡萄糖苷酶的提取。
2、分离的菌丝体按照以下方法进行粗酶液的提取
向步骤1提取出的菌丝体中加入蒸馏水，在冰浴(-10～10℃)中进行打浆处理(打浆时的转速为22000r/min)，打浆1min后，在冰浴(-10～10℃)中进行超声破碎，超声功率200W，每超声1min间歇1min，超声次数为5次，得粗酶液。
3、采用上文所述的酶活测定方法测定上述提取方法所得粗酶液的酶活，测得灰树花总酶活为1.87U/mL。不经提取处理的灰树花酶活为0.96U/mL，通过先打浆处理1min，再超声破碎5min使酶活提高了1.95倍。

Claims (3)

1.一种真菌菌丝体液体深层发酵中产生的胞内酶的提取方法，其特征在于，包括：取发酵液，分离得到菌丝体，菌丝体用水稀释后，依次进行打浆处理、超声破碎处理，得到粗酶液；
所述打浆处理的温度为-10~10℃，时间为0.5~1.0min；所述打浆处理的转速为20000~21000 r/min；
所述超声破碎处理的超声功率为180~220W；，所述超声破碎处理的温度为-10~10℃，时间为5~10min；
所述的真菌为灵芝、香菇或灰树花；所述的胞内酶为β-葡萄糖苷酶。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，打浆处理过程中，打浆0.5~1.0min后间歇1~2 min。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，超声破碎处理过程中，每超声破碎1~2min间歇1~2min，超声的次数为5次。
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