CN105733959A - 一种米曲霉菌株及其在浙江玫瑰醋发酵中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种米曲霉菌株及其在浙江玫瑰醋发酵中的应用，所述米曲霉菌株为米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG?6，已于2015年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2015764；所述米曲霉菌株在浙江玫瑰醋发酵中的应用，主要是应用米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG?6进行制曲、发酵；所述的制曲、发酵是利用米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG?6驯化菌株，并按照本领域常规的制曲原料和方法制备的曲料和发酵制备浙江玫瑰醋；本发明所述的米曲霉菌株生长快、产孢丰富；蛋白酶活力高且各酶组份活力平衡好，不产黄曲霉毒素，安全无害；试产实验结果证明由该菌株制备的曲料孢子着生好，颜色鲜绿，有种曲特有的香气，蛋白酶活性高；发酵制备的浙江玫瑰醋，风味好，质量好。

Description

一种米曲霉菌株及其在浙江玫瑰醋发酵中的应用
技术领域
本发明涉及一株米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株MG-6及其在浙江玫瑰醋发酵中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
浙江玫瑰醋是我国四大名醋之一，是以大米为原料，在浙江省地理环境下，利用自然界的微生物，经表面静置液态发酵法酿造而成的，不添加任何色素、酸味剂、甜味剂，具有玫瑰红色的酿造食醋。
目前在浙江玫瑰醋的生产过程中也存在影响产品品质的不稳定因素。如菌株酶系的活力及各组分的协调性对品质的影响，多关注淀粉酶活力大小而忽视其它酶系；由于浙江玫瑰醋发酵周期长、占地多、采用传统制作、机械化程度低，对参与糖化、酒精发酵和醋酸发酵的菌种关注和研究较多，以期提高浙江玫瑰醋的出品率来增加产量。酸味柔和是浙江玫瑰醋的产品特色，这是由氨基酸和有机酸、醇、醛、酯等风味物质共同作用的结果。浙江玫瑰醋地方标准对表示蛋白质、氨基酸、肽的全氮指标有含量要求，但对表示氨基酸的氨基酸态氮指标没有含量要求。因此最根本的解决方法是从菌种角度出发，通过驯化选育酶活性高且各组份活力平衡性好的菌株进行发酵，以提高浙江玫瑰醋氨基酸含量，提升浙江玫瑰醋产品品质。
发明内容
本发明的目的在于筛选出一株生长旺盛、产孢丰富、酶活性高且各组份活力平衡性好、安全优质米曲霉菌株，并将其应用在浙江玫瑰醋的发酵中；该米曲霉菌株不仅能提高原材料的利用率、产品出品率，而且能缩短生产周期、降低生产成本，提高浙江玫瑰醋的风味和品质，对于提高发酵调味品的质量和品质具有深远的意义。
本发明所提供的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG-6，根据对其平板菌落形态和分生孢子头形态特征观察、及ITS序列比对分析，鉴定该菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)，命名为米曲霉MG-6(Aspergillus oryzae MG-6)，该菌株已于2015年12月21日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015764，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
本发明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG-6，生长温度范围宽，在25-38℃范围内均生长良好，生长快；其中，30℃条件下产酶活性最高。
本发明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG-6，其形态学特征如下：
在马铃薯蔗糖培养基上：菌株MG-6生长较快，28℃7天直径可达76-80mm，基本布满整个平板，质地紧密呈絮状，菌落中央最先出现白色，培养2d左右菌落中央开始产生孢子并逐渐向外蔓延，颜色初为橄榄绿色，后逐渐呈黄绿色至绿色，无渗出液，菌落反面呈浅乳黄色(图1)。真菌湿室培养后，在微分干涉显微镜下观察该菌株自然状态下的生长情况，结果表明该菌株菌丝发达、透明、有隔膜、足细胞，分生孢子头初为球形，后呈辐射形，分生孢子梗有的生自基质，有的生于气生菌丝，壁粗糙，顶囊呈球形，产孢结构单层，分生孢子球形(图4)。
在察氏培养基上：菌株MG-6生长较缓慢，28℃7天直径可达50-60mm，质地丝绒状，菌落层厚，菌落初期为白色，随着菌落的生长，中心先形成黄绿色的孢子，后逐渐向外延伸，菌落生长紧密，具不规则的辐射状条纹，无渗出液，菌落反面呈淡红色(图2)。
在察氏酵母膏培养基上：菌株MG-6生长与在马铃薯蔗糖培养基上相似，28℃7天直径可达80-84mm，可布满整个平板，菌落层厚，中间向上凸起，质地丝绒状，生长致密，孢子形成较慢，呈淡黄绿色，菌落反面淡粉红色(图3)。
本发明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG-6，其ITS序列由558个碱基(bp)组成，基因序列如下：
GGGCTACGAGCGTAGGATCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA
浙江玫瑰醋发酵中的应用是指采用米曲霉菌株MG-6进行制曲、发酵；制得的种曲色泽鲜艳，孢子着生好，数量多，可达1.2*1010个/g干基；结块好；酶活力高且各组份活力平衡好。可有效地降解原料中的蛋白质和糖类，从而提高浙江玫瑰醋的风味和品质；对于提高发酵调味品的质量和品质具有深远的意义。
米曲霉是浙江玫瑰醋发酵中的优势菌株之一，在生产过程中，米曲霉所分泌的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等把原料中的蛋白质、淀粉、纤维素分别水解产生氨基酸、糖类等物质，因此，生产用菌株的酶系分布及活性对浙江玫瑰醋生产中原料氮利用率和风味起着决定性的作用。
本发明取得以下有益效果：
菌株(Aspergillus oryzae)MG-6生长温度范围宽，25-38℃范围内均生长良好；不产黄曲霉毒素，安全无害；制曲过程中生长速度快，产孢丰富，可缩短生产周期，提高生产效益。制得的种曲色泽鲜绿，孢子着生好，结块好，酶活力高且各组份活力平衡性好，可有效地降解原料中的蛋白质和糖类，从而提高浙江玫瑰醋的风味和品质。将本发明提供的米曲霉菌株运用于浙江玫瑰醋等发酵食品的生产中，对于降低生产成本、提高发酵调味品的质量和品质具有深远的意义。
附图说明
图1为菌株MG-6在马铃薯蔗糖培养基上的菌落形态图。
图2为菌株MG-6在察氏培养基上的菌落形态图。
图3为菌株MG-6在察氏酵母膏培养基上的菌落形态图。
图4为菌株MG-6在微分干涉显微镜下的分生孢子图。
图5为菌株MG-6的ITS序列系统发育树图。
具体实施方式
实施例1：米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG-6CCTCC NO.M 2015764的分离、鉴定与保藏。
一、米曲霉菌株的分离纯化。
1、材料准备：
样品来源：浙江五味和食品有限公司生产车间；
马铃薯蔗糖培养基：市购的马铃薯去皮后切成1cm2见方的小块，称取200g马铃薯块，加5-6倍水，文火煮沸半个小时，用八层纱布过滤后，加蔗糖20g，琼脂20g，定容至1000ml，121℃灭菌20min；
察氏培养基：蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，酵母浸提物5g，琼脂15-20g，定容至1000ml，121℃灭菌20min；
察氏酵母膏培养基：蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂15-20g，定容至1000ml，121℃灭菌20min；
小室培养：取干热灭菌的载玻片，在其上滴一小滴马铃薯蔗糖培养基，再在培养基上盖一个无菌盖玻片，使盖玻片与载玻片之间的距离刚好容纳单层菌株生长。制好的载玻片培养基置于无菌的含有20％甘油的平皿中，组成小室培养。
2、米曲霉菌株的分离：
取1g样品到10ml无菌生理盐水中，在涡旋振荡器上把孢子充分分散在水中制成孢子悬液，然后依次取1ml孢子悬液到9ml无菌水中，经梯度稀释，各个稀释梯度的孢子悬液均用涡旋振荡器分散均匀，各取200μl孢子悬液涂布于马铃薯蔗糖培养基上，每个稀释度做两个平行，28℃条件下恒温培养3天左右，得到不同的菌落；
挑取形态不同的菌落点接于马铃薯蔗糖培养基上，28℃条件下恒温培养，重复此步骤，直至分离出单菌落。
二、米曲霉菌株的形态学鉴定：
通过上述(步骤一)得到的单菌落分别点接于马铃薯蔗糖培养基、察氏培养基、察氏酵母膏培养基上，28℃条件下恒温培养；及小室培养；分离获得本发明所述米曲霉菌株MG-6菌种。
本发明所述米曲霉菌株MG-6的形态特征如下：
在马铃薯蔗糖培养基上：28℃培养7天，菌株ZW2-1菌落直径可达76-80mm，生长较快，菌落基本布满整个平板，质地紧密呈絮状。菌落中央最先出现白色菌丝，培养2天左右菌落中央开始产生孢子并逐渐向外蔓延，颜色初为橄榄绿色，后逐渐呈黄绿色至绿色，无渗出液，菌落反面呈浅乳黄色(图1)。
在察氏培养基上：28℃培养7天，菌株MG-6菌落直径可达50-60mm，菌株ZW2-1生长较缓慢，质地丝绒状，菌落层厚，菌落初期为白色，随着菌落的生长，中心先形成黄绿色的孢子，后逐渐向外延伸，菌落生长紧密，具不规则的辐射状条纹，无渗出液，菌落反面呈淡红色(图2)。
在察氏酵母膏培养基上：28℃培养7天，菌株MG-6直径可达80-84mm，可布满整个平板，菌落层厚，中间向上凸起，质地丝绒状，生长致密，孢子形成较慢，呈淡黄绿色，菌落反面淡粉红色(图3)。
真菌小室培养后，在微分干涉显微镜下观察该菌株自然状态下的生长情况，该菌株菌丝发达、透明、有隔膜、足细胞，分生孢子头初为球形，后呈辐射形，分生孢子梗有的生自基质，有的生于气生菌丝，壁粗糙，顶囊呈球形，产孢结构单层，分生孢子球形(图4)。
三、米曲霉菌株的分子生物学鉴定：
1、菌株基因组DNA提取。
菌体活化：挑取菌株成熟的孢子接种于马铃薯蔗糖液体培养基，28℃条件下，100rpm/min摇瓶培养30小时，可见有大量白色菌丝产生。
DNA提取：收集菌丝体，用无菌滤纸吸干水分，取适量吸干水分的菌丝体置于研钵中，加入液氮充分研磨成粉末，称取20㎎粉末于1.5mlEP管中，用OMEGA真菌试剂盒提取基因组DNA。
2、ITS序列PCR扩增：
采用通用引物ITS1和ITS4，PCR扩增菌株的ITS片段。PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer5μL，dNTP(2.5mM each)4μL，引物-ITS1(20μM)0.5μL，引物-ITS4(20μM)0.5μL，DNA模板3μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 36.5μL；
PCR反应条件：94℃预热5min，94℃50s，58℃50s，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min；
采用通过2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；上样量：PCR反应物5μL，loading Buffer1μL；电泳条件：70V，30min。将扩增出来的ITS片段送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
将测序结果与NCBI数据库进行网上Blast比对，采用邻接法(Neighbor-Joining)用MEGA6软件构建系统发育树(图5)。综合上述结果，鉴定菌株MG-6为Aspergillus oryzae。
四、米曲霉菌株的保藏：
该米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG-6，己于2015年12月21日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015764。
实施例2：
米曲霉菌株产酶稳定性测定：
将实施例1分离得到的生长快、产孢丰富的菌株接种于马铃薯蔗糖培养基上，30℃培养3天时，可见菌株表面长满孢子，培养成熟，然后将第一代菌株复接到该培养基上，30℃培养3天为一代，依次类推，可以获得不同传代次数的菌株。
马铃薯蔗糖培养基：市购的马铃薯去皮后切成1cm2见方的小块，称取200g马铃薯块，加5-6倍水，文火煮沸半个小时，用八层纱布过滤后，加蔗糖20g，琼脂20g，定容至1000ml，121℃灭菌20min。
将得到的各代菌株，接种于麸皮培养基上，摇匀后，30℃条件下恒温培养18小时左右，培养基已稍发白结饼时摇瓶一次，将结块摇碎，继续培养4个小时左右，菌丝大量生长又结块时进行第二次摇瓶，30℃条件下继续培养至72小时，米曲霉生长成熟，制成的种曲色泽鲜艳，孢子着生好，曲香浓厚。种曲孢子数稳定在1-3*1010个/g干基，酸性蛋白酶1200-1400活力单位，中性蛋白酶4800-5200活力单位，淀粉酶1100-1300活力单位，纤维素酶1000-1200活力单位。按国标方法未检出黄曲霉毒素。
麸皮培养基：麸皮80g，小麦粉20g，水80ml，0.1MPa灭菌30min。
实施例3：
生产成曲的试产：
1、按实施例2的制曲方法，菌株MG-6在30℃下培养72小时，制得三角瓶种曲。种曲，结块好，各种酶活力稳定且各组分酶活力平衡性好，而且种曲色泽鲜绿，孢子丰富2.5*1010个/g干基、着生好，有米曲霉固有的香味。按国标方法未检出黄曲霉毒素。
2、成曲曲料按麸皮:小麦粉＝8:2的比例混合均匀，加入70％水，充分搅拌均匀后，0.1MPa压力下高温蒸煮30分钟，待曲料冷却后，接入0.3％(原料重量计)接种量接入步骤1制得的种曲，31℃下采用通风制曲工艺。
3成曲制曲完成后，检测其酶活力和孢子数并进行感官评价。成曲孢子量大，孢子飞扬，孢子数可达1.2*1010个/g，色泽黄绿，曲香浓厚，结块好；其酶活力稳定、各组分酶活力平衡性好。根据国标方法，未检出黄曲霉毒素，菌株安全性高。而且菌株MG-6，生长温度范围宽，在25-38℃范围内均正常生长，生长快，孢子萌发快，制曲时间可缩短4-6小时，缩短制曲生产周期，减少耗能。
4、通风制曲结果表明米曲霉MG-6成曲，在成曲生产过程中无需特别处理，即在原来生产工艺的基础上，完全可以正常生产。
实施例4：浙江玫瑰醋发酵试产：
为了验证米曲霉菌株MG-6在浙江玫瑰醋发酵中的性能，对菌株MG-6进行发酵试产，发酵结束后，检测用MG-6驯化菌株成曲制备的浙江玫瑰醋的感官特征，理化指标及微生物指标。试产产品色泽呈玫瑰红色，有光泽，具有浙江玫瑰醋特有的醋香气，无其它不良气味，酸味柔和，稍有甜味，不涩，无异味，澄清，无悬浮物，无杂质；总酸(以乙酸计)5.36g/100mL，可溶性无盐固形物6.48g/100mL，氨基酸态氮(以氮计)0.108g/100mL，全氮(以氮计)0.219g/100mL，还原糖(以葡萄糖计)4.693g/100mL，菌落总数＜10cfu/mL，大肠菌群≤3MPN/100mL，符合浙江玫瑰醋地方标准的要求。
氨基酸态氮(以氮计)
实施例4 0.108
比较例4 0.057
为了验证米曲批次发酵结果表明MG-6驯化菌株成曲发酵的浙江玫瑰醋感官品质好，氨基酸态氮和全氮含量高，表明该驯化菌株适合用于浙江玫瑰醋发酵生产。菌种生产性能稳定。通过大量实验和实际生产，利用本发明所述米曲霉MG-6驯化菌株，按照本领域常规的制曲原料和方法制备的曲料和发酵制备的浙江玫瑰醋成品各指标都非常优良，符合浙江玫瑰醋地方标准的要求；而且该菌株生长快，制曲周期短，既能减少能耗又能提高原料利用率及产品的风味和质量，是一株性能优良的、适用于浙江玫瑰醋发酵生产的米曲霉菌种。所得产品无论是风味品质和产量都有显著提高；使用该菌株进行浙江玫瑰醋的发酵生产，符合现代工业的发展模式。

Claims (5)

1.一种米曲霉菌株，其特征在于所述的米曲霉菌株为米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG-6，已于2015年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2015764。
2.如权利要求1所述的米曲霉菌株，其特征在于所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG-6生长温度范围宽，在25—38℃范围内均生长良好且生长快，其中30℃条件下产酶活性最高。
3.一种如权利要求1或2所述米曲霉菌株在浙江玫瑰醋发酵中的应用，其特征在于所述的应用主要是应用米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG-6进行制曲、发酵。
4.如权利要求3所述米曲霉菌株在浙江玫瑰醋发酵中的应用，其特征在于所述的制曲、发酵是利用米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)MG-6驯化菌株，并按照本领域常规的制曲原料和方法制备的曲料和发酵制备浙江玫瑰醋。
5.如权利要求3或4所述米曲霉菌株在浙江玫瑰醋发酵中的应用，其特征在于所述的制曲，制得的种曲色泽鲜艳，孢子着生好，数量多，可达1.2*1010个/g干基；结块好；酶活力高且各组份活力平衡好。
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