CN104911107A - 米曲霉菌株及其在豆酱发酵中的应用 - Google Patents

米曲霉菌株及其在豆酱发酵中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）ZW2-1 CCTCC NO.M2014565及其在豆酱发酵中的应用。所述米曲霉菌株ZW2-1是从浙江五味和食品有限公司生产车间分离，经纯化培养得到。本发明所述的米曲霉菌株生长快、产孢丰富；蛋白酶活力高且各酶组份活力平衡好，低酪氨酸羧肽酶活性，不产黄曲霉毒素，安全无害。试产实验结果证明由该菌株制备的曲料孢子着生好，颜色鲜绿，有种曲特有的香气，蛋白酶活性高；发酵制备的豆酱，风味好，质量好，不产生“白点”。本发明的菌株将在豆酱发酵生产中在保证产品品质的同时，可有效防止“白点”的产生，具有广阔应用前景。

Description

米曲霉菌株及其在豆酱发酵中的应用
(一)技术领域：本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株米曲霉(Aspergillusoryzae)ZW2-1及其在豆酱发酵中的应用。
(二)背景技术：豆酱是我国传统的微生物发酵豆制品，以其独特的工艺，细腻的品质，丰富的营养，鲜香可口的风味而深受广大群众的喜爱，有良好的市场前景，因而提高豆酱的质量对人类的健康具有重要的意义。米曲霉是豆酱发酵中常用的菌株，在生产过程中，米曲霉所分泌的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等把原料中的蛋白质、淀粉、纤维素分别水解产生氨基酸、糖类等物质，因此，生产用菌株的酶系分布及活性对豆酱生产中原料氮利用率和风味起着决定性的作用。
目前在豆酱的生产过程中也存在影响产品品质的不稳定因素。如菌株酶系的活力及各组分的协调性对品质的影响，多关注蛋白酶活力大小而忽视其它酶系；“白点”问题是豆酱产品中最常见的负面感官因子，其虽不影响产品的风味与口感，但影响豆酱的感官品质和消费者的购买欲，对豆酱产品的销售不利。已有研究表明，添加乳化剂、抑菌剂，或控制发酵工艺条件、生产操作等措施可部分减轻“白点”的形成，但是也可能引入一些安全问题，费时费力且产品质量不容易控制。有研究表明，“白点”的形成是由酪氨酸结晶析出的，而酪氨酸羧肽酶是发酵过程中酪氨酸产生的关键酶。实际生产经验表明酪氨酸含量低于6.15mg/g干基时，豆酱成品中没有“白点”出现。因此最根本的解决方法是从菌种角度出发，通过驯化选育酪氨酸羧肽酶活性低的菌株进行发酵，以减少酪氨酸的生成，解决豆酱中存在的“白点”问题。本发明筛选出一株生长旺盛、产孢丰富、酶活性高且各组份活力平衡性好、酪氨酸羧肽酶活性低的、安全优质米曲霉菌株，其不仅能提高原材料的利用率、产品出品率，而且能缩短生产周期、降低生产成本，提高豆酱的风味和品质，解决“白点”的产生，对于提高发酵调味品的质量和品质具有深远的意义。
(三)发明内容：本发明的目的是提供一株适合优质豆酱生产的米曲霉菌株，提高提高原材料利用率，降低生产成本，提高豆酱的风味和品质，防止“白点”的产生。
本发明所提供的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZW2-1，根据对其平板菌落形态和分生孢子头形态特征观察，及ITS序列比对分析，鉴定该菌株为米曲霉(Aspergillusoryzae)，命名为米曲霉ZW2-1(Aspergillus oryzae ZW2-1)，该菌株已于2014年11月13日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014565，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
本发明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZW2-1，生长温度范围宽，在25-38℃范围内均生长良好，生长快。其中，30℃条件下产酶活性最高。
本发明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZW2-1，其形态学特征如下：
在马铃薯蔗糖培养基上：菌株ZW2-1生长较快，28℃7天直径可达76-80mm，基本布满整个平板，质地紧密呈絮状，菌落中央最先出现白色，培养2d左右菌落中央开始产生孢子并逐渐向外蔓延，颜色初为橄榄绿色，后逐渐呈黄绿色至绿色，无渗出液，菌落反面呈浅乳黄色(图1)。真菌湿室培养后，在微分干涉显微镜下观察该菌株自然状态下的生长情况，结果表明该菌株菌丝发达、透明、有隔膜、足细胞，分生孢子头初为球形，后呈辐射形，分生孢子梗有的生自基质，有的生于气生菌丝，壁粗糙，顶囊呈球形，产孢结构单层，分生孢子球形(图4)。
在察氏培养基上：菌株ZW2-1生长较缓慢，28℃7天直径可达50-60mm，质地丝绒状，菌落层厚，菌落初期为白色，随着菌落的生长，中心先形成黄绿色的孢子，后逐渐向外延伸，菌落生长紧密，具不规则的辐射状条纹，无渗出液，菌落反面呈淡红色(图2)。
在察氏酵母膏培养基上：菌株ZW2-1生长与在马铃薯蔗糖培养基上相似，28℃7天直径可达80-84mm，可布满整个平板，菌落层厚，中间向上凸起，质地丝绒状，生长致密，孢子形成较慢，呈淡黄绿色，菌落反面淡粉红色(图3)。
本发明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZW2-1，其ITS序列由558个碱基(bp)组成，基因序列如下：
GGGCTACGAGCGTAGGATCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA
应用米曲霉菌株ZW2-1进行制曲、发酵，制得的种曲色泽鲜艳，孢子着生好，数量多，可达9*1010个/g干基，结块好，酶活力高且各组份活力平衡好，可有效地降解原料中的蛋白质和糖类，从而提高酱类制品的风味和品质；酪氨酸羧肽酶活性低，豆酱发酵过程中酪氨酸产生量低，可避免由于酪氨酸含量高而结晶析出产生“白点”。在保证产品品质的同时，可有效防止“白点”的产生，对于提高发酵调味品的质量和品质具有深远的意义。
本发明取得以下有益效果：
菌株(Aspergillus oryzae)ZW2-1生长温度范围宽，25-38℃范围内均生长良好；不产黄曲霉毒素，安全无害；制曲过程中生长速度快，产孢丰富，可缩短生产周期，提高生产效益。制得的种曲色泽鲜绿，孢子着生好，结块好，酶活力高且各组份活力平衡性好，可有效地降解原料中的蛋白质和糖类，酪氨酸羧肽酶活性低，可在保证产品品质的同时，有效防止“白点”的产生，从而提高酱类制品的风味和品质。将本发明提供的米曲霉菌株运用于酱类等发酵食品的生产中，对于降低生产成本、提高发酵调味品的质量和品质具有深远的意义。
(四)附图说明：
图1为菌株ZW2-1在马铃薯蔗糖培养基上的菌落形态图
图2为菌株ZW2-1在察氏培养基上的菌落形态图
图3为菌株ZW2-1在察氏酵母膏培养基上的菌落形态图
图4为菌株ZW2-1在微分干涉显微镜下的分生孢子图
图5为菌株ZW2-1的ITS序列系统发育树图。
(五)具体实施方案：
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，培养基定容均为水。
实施例1
米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZW2-1 CCTCC NO.M 2014565的分离、鉴定与保藏
一、米曲霉菌株的分离纯化
1、材料准备
样品来源：浙江五味和食品有限公司生产车间。
马铃薯蔗糖培养基：市购的马铃薯去皮后切成1cm2见方的小块，称取200g马铃薯块，加5-6倍水，文火煮沸半个小时，用八层纱布过滤后，加蔗糖20g，琼脂20g，定容至1000ml，121℃灭菌20min。
察氏培养基：蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO40.01g，酵母浸提物5g，琼脂15-20g，定容至1000ml，121℃灭菌20min。
察氏酵母膏培养基：蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂15-20g，定容至1000ml，121℃灭菌20min。
小室培养：取干热灭菌的载玻片，在其上滴一小滴马铃薯蔗糖培养基，再在培养基上盖一个无菌盖玻片，使盖玻片与载玻片之间的距离刚好容纳单层菌株生长；制好的载玻片培养基置于无菌的含有20％甘油的平皿中，组成小室培养。
2、米曲霉菌株的分离
样品取1g到10ml无菌生理盐水中，在涡旋振荡器上把孢子充分分散在水中制成孢子悬液，然后依次取1ml孢子悬液到9ml无菌水中，经梯度稀释，各个稀释梯度的孢子悬液均用涡旋振荡器分散均匀，各取200μl孢子悬液涂布于马铃薯蔗糖培养基上，每个稀释度做两个平行，28℃条件下恒温培养3天左右，得到不同的菌落。
挑取形态不同的菌落点接于马铃薯蔗糖培养基上，28℃条件下恒温培养，重复此步骤，直至分离出单菌落。
二、米曲霉菌株的形态学鉴定
将步骤(一)中得到的单菌落分别点接于马铃薯蔗糖培养基、察氏培养基、察氏酵母膏培养基上，28℃条件下恒温培养；及小室培养。分离获得本发明所述米曲霉菌株ZW2-1菌种。
本发明所述米曲霉菌株ZW2-1的形态特征如下：
在马铃薯蔗糖培养基上：28℃培养7天，菌株ZW2-1菌落直径可达76-80mm，生长较快，菌落基本布满整个平板，质地紧密呈絮状。菌落中央最先出现白色菌丝，培养2天左右菌落中央开始产生孢子并逐渐向外蔓延，颜色初为橄榄绿色，后逐渐呈黄绿色至绿色，无渗出液，菌落反面呈浅乳黄色(图1)。
在察氏培养基上：28℃培养7天，菌株ZW2-1菌落直径可达50-60mm，菌株ZW2-1生长较缓慢，质地丝绒状，菌落层厚，菌落初期为白色，随着菌落的生长，中心先形成黄绿色的孢子，后逐渐向外延伸，菌落生长紧密，具不规则的辐射状条纹，无渗出液，菌落反面呈淡红色(图2)。
在察氏酵母膏培养基上：28℃培养7天，菌株ZW2-1直径可达80-84mm，可布满整个平板，菌落层厚，中间向上凸起，质地丝绒状，生长致密，孢子形成较慢，呈淡黄绿色，菌落反面淡粉红色(图3)。
真菌小室培养后，在微分干涉显微镜下观察该菌株自然状态下的生长情况，该菌株菌丝发达、透明、有隔膜、足细胞，分生孢子头初为球形，后呈辐射形，分生孢子梗有的生自基质，有的生于气生菌丝，壁粗糙，顶囊呈球形，产孢结构单层，分生孢子球形(图4)。
三、米曲霉菌株的分子生物学鉴定
1、菌株基因组DNA提取
菌体活化：挑取菌株成熟的孢子接种于马铃薯蔗糖液体培养基，28℃条件下，100rpm/min摇瓶培养30小时，可见有大量白色菌丝产生。
DNA提取：收集菌丝体，用无菌滤纸吸干水分，取适量吸干水分的菌丝体置于研钵中，加入液氮充分研磨成粉末，称取20㎎粉末于1.5mlEP管中，用OMEGA真菌试剂盒提取基因组DNA。
2、ITS序列PCR扩增
采用通用引物ITS1和ITS4，PCR扩增菌株的ITS片段。PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer 5μL，dNTP(2.5mM each)4μL，引物-ITS1(20μM)0.5μL，引物-ITS4(20μM)0.5μL，DNA模板3μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 36.5μL。
PCR反应条件：94℃预热5min，94℃50s，58℃50s，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min。
采用通过2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。上样量：PCR反应物5μL，loadingBuffer 1μL；电泳条件：70V，30min。将扩增出来的ITS片段送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
将测序结果与NCBI数据库进行网上Blast比对，采用邻接法(Neighbor-Joining)用MEGA6软件构建系统发育树(图5)。综合上述结果，鉴定菌株ZW2-1为Aspergillusoryzae。
四、米曲霉菌株的保藏
该米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZW2-1，己于2014年11月13日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014565。
实施例2
米曲霉菌株产酶稳定性测定
将实施例1分离得到的生长快、产孢丰富的菌株接种于添加酪氨酸的豆汁培养基上，30℃培养3天时，可见菌株表面长满孢子，培养成熟，然后将第一代菌株复接到该培养基上，30℃培养3天为一代，依次类推，可以获得不同传代次数的菌株。
添加酪氨酸的豆汁培养基：豆粕加5-6倍水，文火煮沸1小时，边煮沸边搅拌，然后用纱布过滤，每1000g豆粕制成5°Bé豆汁1000ml。豆汁1000ml，可溶性淀粉20g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，酪氨酸3g，琼脂20g，121℃灭菌20min。
将得到的各代菌株，接种于麸皮培养基上，充分摇匀后堆积于三角瓶的一角，30℃条件下恒温培养至18-20小时，有菌丝生长和白斑出现、微结块时摇瓶一次，充分摇碎后平摊于平底，继续培养6个小时左右，菌丝大量生长又结块时进行第二次摇瓶，30℃条件下继续培养至72小时，米曲霉生长成熟，制成的种曲色泽鲜艳，孢子着生好，曲香浓厚。种曲孢子数稳定在6-9*1010个/g干基，酸性蛋白酶980-1200活力单位，中性蛋白酶4300-5000活力单位，淀粉酶1000-1200活力单位，纤维素酶970-1022活力单位。按国标方法未检出黄曲霉毒素。
麸皮培养基：麸皮85g，豆粕15g，水95ml，121℃灭菌20min。
实施例3
生产成曲的试产
1、按实施例2的制曲方法，菌株ZW2-1在30℃下培养72小时，制得三角瓶种曲。种曲，结块好，各种酶活力稳定且各组分酶活力平衡性好，而且种曲色泽鲜绿，孢子丰富9*1010个/g干基、着生好，有米曲霉固有的香味。按国标方法未检出黄曲霉毒素。
2、成曲曲料按大豆:小麦粉＝7:3的比例混合均匀，加入80％水，充分搅拌均匀后，101.325kPa压力下高温蒸煮30分钟，待曲料冷却后，接入0.3％(原料重量计)接种量接入步骤1制得的种曲，31℃下采用通风制曲工艺。
3、成曲制曲完成后，检测其酶活力和孢子数并进行感官评价。成曲孢子量大，孢子飞扬，孢子数可达9.4*1010个/g，色泽黄绿，曲香浓厚，结块好；其酶活力稳定、各组分酶活力平衡性好。根据国标方法，未检出黄曲霉毒素，菌株安全性高。而且菌株ZW2-1，生长温度范围宽，在25-38℃范围内均正常生长，生长快，孢子萌发快，制曲时间可缩短4-6小时，缩短制曲生产周期，减少耗能。
4、通风制曲结果表明米曲霉ZW2-1成曲，在成曲生产过程中无需特别处理，即在原来生产工艺的基础上，完全可以正常生产。
实施例4
豆酱发酵试产
为了验证米曲霉菌株ZW2-1在豆酱发酵中的性能，对菌株ZW2-1进行制醪发酵试产，发酵结束后，检测用ZW2-1驯化菌株成曲制备的豆酱的感官特征，理化指标及微生物指标。豆酱色泽红棕色，酱香醇厚，风味好，滋味鲜美，稀稠适度，咸淡适中；氨基酸态氮≥0.6g/100g，总酸≤2g/100g，食盐含量≥12g/100g，大肠菌群数≤30MPN/100g，符合豆酱国家标准的要求。对豆酱成品货架期白点出现率进行统计，结果为未出现白点。
为了验证米曲批次制醪发酵结果表明ZW2-1驯化菌株成曲发酵的豆酱感官品质好，总氨基态氮含量高，酪氨酸含量均<6.15mg/g干基,豆酱成品中未出现“白点”，表明该驯化菌株适合用于豆酱发酵生产，而且可以解决豆酱成品中的“白点”问题。菌种生产性能稳定。
通过大量实验和实际生产，利用本发明所述米曲霉ZW2-1驯化菌株，按照本领域常规的制曲原料和方法制备的曲料和发酵制备的豆酱成品各指标都非常优良，符合黄豆酱国家标准的要求；而且该菌株生长快，制曲周期短，既能减少能耗又能提高原料利用率及产品的风味和质量，是一株性能优良的、适用于豆酱发酵生产的米曲霉菌种。所得产品可完全解决豆酱成品中的“白点”问题，无论是产品外观、还是产品风味品质和产量都有显著提高。使用该菌株进行豆酱的发酵生产，符合现代工业的发展模式。
本发明米曲霉菌株及其在豆酱发酵中的应用，所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae) ZW2-1，其ITS序列由558个碱基（bp）组成，基因序列如下：
GGGCTACGAGCGTAGGATCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGT
TGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCG
CCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCA
GTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG
CGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCG
CCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGC
TTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCA
CCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGC
TTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCT
GAACTTAAGCATATCAAA
 

Claims (2)

1.一种米曲霉菌株(Aspergillus oryzae) ZW2-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO. M 2014565。
2.根据权利要求1所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae) ZW2-1在生产发酵豆酱中的应用。
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