CN114350523A - 优质米曲霉组合菌剂及其在制备郫县豆瓣酱中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了优质米曲霉组合菌剂及其在制备郫县豆瓣酱中的应用，属于微生物技术领域。本发明从日本传统酿造曲精中筛选到了一株食品安全菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30008，所述菌株能够高中性蛋白酶活性水平、弥补强烈鲜味缺乏的不足，将其与同样方法筛选到的米曲霉LBM 30007及商用菌株米曲霉沪酿3.042混合后制备得到微生物菌剂，将此微生物菌剂应用于制备蚕豆曲、并进一步制备豆瓣酱中，能够使得鲜味氨基酸含量和中性蛋白酶活力显著提升，亮氨酸氨肽酶的活力也显著提升。有利于在蚕豆曲、酱油或豆瓣酱的制备中提升原料利用率及产品品质。

Description

优质米曲霉组合菌剂及其在制备郫县豆瓣酱中的应用
技术领域
本发明涉及优质米曲霉组合菌剂及其在制备郫县豆瓣酱中的应用，具体涉及一种米曲霉菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
郫县蚕豆酱(Pixian broad bean paste)因其鲜辣醇厚，瓣粒香脆、香气浓郁而被誉为“川菜之魂”，是四川最著名的调味品之一。仅2018年郫县豆瓣实现工业总产值49.16亿元，是一类具有重要工业价值的传统酿造发酵酱。其生产主要分为三个阶段：蚕豆制曲、加盐酱汁发酵和加辣椒后熟发酵。蚕豆曲的制备是郫县豆瓣生产的关键工序，曲的品质直接关系到曲霉的胞外酶系统。在发酵阶段，微生物生长繁殖产生的酶被用来将原料中存在的蛋白质、淀粉和其他成分分解成小分子物质，如多肽、游离氨基酸和糖类，这对郫县豆瓣的风味和颜色的形成起着至关重要的作用。因此，为使蛋白质和糖分更为彻底地分解，以提升发酵基质利用率和成品品质，蚕豆曲酶系丰富度和酶活力提升迫在眉睫。
米曲霉是蚕豆曲制作的关键微生物。它是一种广泛用于食品发酵的丝状真菌，在制曲阶段能产生包括淀粉酶和蛋白酶在内的丰富水解酶系。目前，郫县豆瓣制蚕豆曲时多直接采用商品化曲精，即米曲霉沪酿3.042，该菌株具有生长速度快，繁殖力强，蛋白酶活力高，孢子多，对环境的适应性强，易于培养等优点。但在制曲过程中该菌产生的蛋白酶是以中性蛋白酶和碱性蛋白酶为主，酸性蛋白酶活力比较低，当发酵进行到中后期，由于蛋白质的降解和有机酸的积累，醪液的pH值逐渐下降到4.5，抑制中性和碱性蛋白酶的活性，蛋白质水解几乎停止，导致全氮利用率和氨基酸生成率降低。
近年来，研究人员致力于在传统酿造酱产品制曲过程中应用菌种共培养方法，以提高发酵食品的品质。与纯培养相比，真菌共培养可能会正向影响酶混合物的产生，弥补单菌种所形成酶系单一的不足。而目前又没有很好的、能够应用于郫县豆瓣发酵的优质米曲霉组合菌剂。
发明内容
针对现有郫县豆瓣酱蚕豆曲制曲微生物米曲霉沪酿3.042酶系丰富度和酶活力有待提升的问题：
本发明提供了一株米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30008，于2021年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23816。
本发明提供了含有所述米曲霉LBM 30008的微生物菌剂。
在一种实施方式中，所述微生物菌剂中含有米曲霉LBM 30008，或同时含有权利要求1所述米曲霉LBM 30008、米曲霉LBM 30007和米曲霉3.042；所述米曲霉LBM 30007于2021年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23815。
在一种实施方式中，将所述米曲霉LBM 30008、米曲霉LBM 30007和米曲霉3.042分别培养3～5d，三菌孢子数比例为3:3:4进行混合，得到孢子总浓度为5×106～1×107个/mL的微生物菌剂。
本发明提供了一种制备蚕豆曲的方法，所述方法是利用所述菌剂制备蚕豆曲。
在一种实施方式中，将蚕豆瓣经烫瓣、浸泡后，将蚕豆瓣与小麦粉按照干蚕豆瓣：小麦粉质量比为100:30混匀，再按6.75×106个孢子/g干蚕豆加入米曲霉孢子，混合后在温度30℃、湿度90％培养20h，培养结束后，在温度28℃、湿度80％下培养至获得成曲。
在一种实施方式中，当曲料逐渐出现嫩黄绿色孢子后，即获得成曲。
本发明提供了一种制备豆瓣酱的方法，所述方法是利用所述制备蚕豆曲的方法制备得到的蚕豆曲制备豆瓣酱。
在一种实施方式中，将所述蚕豆曲、食盐、水按照干蚕豆：食盐：水＝100:38:75的质量比混合，在温度为28℃、湿度为70％条件下恒温恒湿培养30d，每2d翻动一次。
在一种实施方式中，将食盐加水调制成盐水，配制成浓度为190～200g/L的盐水，并保持盐水温度为50～60℃，剩余的食盐以干盐形式在加盐水时均匀加入曲料。
本发明提供了所述米曲霉LBM 30008、或所述微生物菌剂在制备蚕豆曲、豆瓣酱、酱油、食醋中的应用。
本发明的优点和效果：
本发明从日本传统酿造曲精中筛选到了一株食品安全菌株米曲霉(Aspergillusoryzae)LBM 30008，所述菌株能够高中性蛋白酶活性水平、弥补强烈鲜味缺乏的不足，将其与同样方法筛选到的米曲霉LBM 30007及商用菌株米曲霉沪酿3.042混合后制备得到微生物菌剂，将此微生物菌剂应用于制备蚕豆曲、并进一步制备豆瓣酱中，能够使得鲜味氨基酸含量和中性蛋白酶活力显著提升，亮氨酸氨肽酶的活力也显著提升。有利于在蚕豆曲、酱油或豆瓣酱的制备中提升原料利用率及产品品质。
生物材料保藏
本发明所提供的米曲霉LBM 30008，分类学命名为米曲霉Aspergillus oryzae，已于2021年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23816，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的米曲霉LBM 30007，分类学命名为米曲霉Aspergillus oryzae，已于2021年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23815，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30008电子显微镜下形态图。
图2为不同米曲霉菌剂制作郫县豆瓣蚕豆曲模拟发酵30d蚕豆醅表型。
具体实施方式
分离、纯化培养基(PDA培养基)：将200g洗净去皮的马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装后115℃，灭菌20分钟。
筛选培养基：称取5g脱脂奶粉，加入200mL无菌水溶解，另取10g琼脂粉于另一500mL三角瓶中，加水300mL，分别115℃灭菌30min。使用时在超净工作台混合，分别调pH至3.0、7.2，用以筛选高产酸性蛋白酶、中性蛋白酶的曲霉菌株。
(1)中性蛋白酶酶活检测方法：测定方法参照GB/T 28715-2012。1g大曲在40℃，pH7.2条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个中性蛋白酶活力单位(U/g)。
(2)酸性蛋白酶酶活检测方法：测定方法参照GB/T 28715-2012。1g大曲在40℃，pH3.0条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个酸性蛋白酶活力单位(U/g)。
(3)亮氨酸氨肽酶酶活检测方法：
①标准曲线的绘制：将对硝基苯胺(pNA)105℃烘干至恒重，用无水乙醇配制成20μg/mL的标准溶液。用无水乙醇制备系列稀释液，至终浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18和20μg/mL。向试管中分别加入体积为0.4mL上述稀释液，各依次加入6.0mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液，2mL 0.4mol/L三氯乙酸，0.4mL 26mmol/L的L－亮氨酸－pNA乙醇溶液。充分混合后于40℃保温5min。利用可见分光光度计在405nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线并求出斜率K。其中，横坐标为对硝基苯胺浓度(μg/mL)，纵坐标表示净OD值，去离子水为对照。
②酶液的制备：准确称取3g曲料充分研磨，用蒸馏水定容至100mL，于40℃水浴浸提1h，6层纱布过滤后即为待测酶液。
③样品测定：
a.向5mL EP管中加入1.5mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，并加入100μL经适当稀释的酶液。40℃保温10min使温度恒定。
b.加入26mmol/L的亮氨酸对硝基苯胺乙醇溶液100μL，迅速混匀，继续水浴10min。c.然后立即加入0.5mL 0.4mol/L三氯乙酸终止反应，继续置于水浴中保温5min。用可见分光光度计在405nm波长下测定吸光度。平行试验2次。
d.空白用灭活后的酶液。
④计算：
在40℃，pH 8.0条件下，每分钟水解亮氨酸对硝基苯胺生成1μg对硝基苯胺(pNA)所需的酶量定义为1个酶活力单位。
Figure BDA0003443725460000041
式中：
A——由样品测得吸光值，查得标准曲线得到相当的硝基苯胺浓度(μg/mL)；
V0——样品稀释后总体积(mL)；
m——样品质量(g)。
(3)蚕豆曲中各种氨基酸含量检测方法：取4g样品加入16mL超纯水中，震荡混匀后，冰浴超声30min；将超声后的液体4℃，8000×g，离心5min；然后取1mL上清液加入等体积的10％磺基水杨酸，4度静置4h以沉淀蛋白质，万转以上离心10min，取上清由日立氨基酸分析仪测定样品氨基酸含量。
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例1～4，对本发明进行具体描述。
实施例1：米曲霉LBM 30008的分离与筛选
(1)样品处理
称取0.5g日本传统酿造曲精于装有99mL无菌水且含有无菌玻璃珠的无菌三角瓶中，在30℃、200rpm的摇床振荡分散，制备样品悬浮液。
(2)分离纯化
吸取适量样品悬浮液血球计数板计数，获得菌体浓度。梯度稀释悬浮液，选取合适浓度涂布200μL于分离培养基，室温下静置5min，使菌液浸入培养基，而后置于30℃恒温培养箱中培养2d。根据米曲霉菌落形态特征，挑取米曲霉单菌落于纯化培养基，待长出单菌落后，继续挑取米曲霉单菌落纯化培养基，按此方式纯化3次后转接斜面培养基，4℃保存。
(3)高产蛋白酶菌株的筛选
待筛选菌株的孢子悬浮液的制备：用无菌接种环从保存的斜面刮取适量孢子并接种于PDA培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养3～5d，待产孢充分后，每个平板加入适量无菌水，用无菌涂布棒在菌丝表面轻轻刮拭，将孢子刮下。将收集到的孢子洗脱液摇匀，用Miracloth对洗脱液进行过滤，收集滤液，即获得孢子悬浮液，置于4℃保存。
高产蛋白酶菌株筛选：将孢子悬浮液摇匀后取适量用于血球计数，获得孢子悬液母液的浓度。将母液梯度稀释至孢子浓度为106个/mL，接种20μL于直径为150mm的筛选培养基，每平板8株，30℃恒温培养3d，挑选在pH3.0和pH7.2的筛选培养基中透明圈/菌落直径比均大的菌株。筛选时设置3个平行。
筛选得到一株高产酸性蛋白酶、中性蛋白酶的曲精分离株。
实施例2：菌种的鉴定
(1)形态学鉴定
在PDA培养基上菌落为橄榄黄色，丝绒状，具辐射状沟纹，边缘相对整齐；电子显微镜观察，产生球型、粗糙分生孢子，分生孢子头呈辐射状，分生孢梗茎粗糙，顶囊为球型，表面可育，产孢结构单层(图1)。
(2)分子生物学鉴定
试验方法：菌株培养→基因组提取→聚合酶链式反应(PCR)→琼脂糖凝胶电泳→测序→NCBI blast比对
1)基因组提取：
①吸取分生孢子悬浮液1.5ml，加入灭菌的2ml离心管中，12000rpm，4℃，离心2min，去除上清。
②加入1mL灭菌超纯水，重悬，混匀。12000rpm，4℃，离心2min，去除上清。
③重复步骤②。
④加入200μL超纯水后重悬菌体，加入0.3g玻璃珠、150μL氯仿、150μL苯酚，用封口膜封口，上下轻轻颠倒混匀6次。
⑤将离心管对称放于珠磨仪中，机械破碎30s。
⑥取出离心管，加入600μL超纯水，上下颠倒混匀6次。12000rpm，4℃，离心20min。
⑦用200μL移液枪轻轻吸取上清300μL～400μL，勿吸取沉淀。
⑧加入2倍体积预冷的无水乙醇，4℃静置2h后12000rpm，4℃，离心30min。
⑨立即倒掉上清，离心管至于真空离心浓缩仪中离心浓缩，至完全无溶剂。
⑩加入30-50μL超纯水溶解，测定DNA浓度，于-20℃保存。
2)PCR反应时，引物EF3与EF4用来扩增18S rDNA序列，引物ITS1和ITS4用来扩增全长ITS区域序列。
EF3：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'，SEQ ID NO.1，
EF4：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'，SEQ ID NO.2；
ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，SEQ ID NO.3，
ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，SEQ ID NO.4。
以提取的DNA为模板，按照下表配制PCR体系。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，循环30次，最后72℃保温5分钟。
表1基因组DNA PCR体系
Figure BDA0003443725460000061
鉴定结果表明：本发明筛选到的菌株为米曲霉，将其命名为米曲霉LBM 30008。
实施例3：优质米曲霉组合菌剂的制备
(1)分生孢子悬液的制备
用无菌接种环分别从将本发明筛选得到的高产蛋白酶米曲霉LBM 30008与优质米曲霉LBM 30007、米曲霉沪酿3.042的保存斜面刮取适量孢子并接种于PDA培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养3～5d，待产孢充分后，每个平板加入适量无菌水，用无菌涂布棒在菌丝表面轻轻刮拭，将孢子刮下。将收集到的孢子洗脱液摇匀，用Miracloth对洗脱液进行过滤，收集滤液，即获得孢子悬浮液。将孢子悬浮液摇匀后取适量用于血球计数，获得孢子悬液母液的浓度。
(2)优质米曲霉组合菌剂的制备
将上述3种菌种的分生孢子悬浮液按配比进行稀释混合，菌剂组成为：米曲霉LBM30008孢子数占比为30％；米曲霉LBM 30007孢子数占比为30％；米曲霉沪酿3.043孢子数占比为40％。最终，菌剂分生孢子浓度为5×106～1×107个/mL。
实施例4：优质米曲霉组合菌剂在制备蚕豆曲中的应用
利用实施例3制备得到的优质米曲霉组合菌剂制作蚕豆曲，以米曲霉LBM 30008、米曲霉LBM 30007和米曲霉3.042单独制作的蚕豆曲作为对照组。
制曲时将蚕豆瓣用自来水冲洗3次除杂，用95℃烫瓣20s，再将蚕豆在45℃清水中浸泡20min，沥干水分。按干蚕豆瓣：小麦粉的质量比为100：30进行拌粉。按6.75×106个孢子/g干蚕豆瓣的比例加入米曲霉分生孢子，混合均匀后置于恒温恒湿培养箱中培养，恒温恒湿培养箱培养条件：0-20h时，控制温度30℃、湿度90％；0-20h结束后，控制温度28℃、湿度80％。当曲料逐渐出现嫩黄绿色孢子后，即可出曲，检测成曲的酶活及氨基酸含量。
由表2和表3可知优质米曲霉组合菌剂制作豆瓣蚕豆曲时，较之米曲霉沪酿3.042，其酸性蛋白酶、中性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶活力更高，酶系更加均衡，鲜味氨基酸谷氨酸、天冬氨酸含量更高，非常利于豆瓣酱原料利用率及产品品质的提升。
表2不同米曲霉菌株制作蚕豆曲水解酶活力
Figure BDA0003443725460000071
表3不同米曲霉菌株制作蚕豆曲氨基酸含量
Figure BDA0003443725460000072
实施例5：优质米曲霉组合菌剂在制备豆瓣酱中的应用
按照实施例4的步骤，制备得到由优质米曲霉组合菌剂制备得到的蚕豆曲，将制备得到的蚕豆曲用于甜瓣子的制备，具体方法为：
按照曲料(以干蚕豆计)：食盐：水＝100：38：75的质量比制备模拟发酵体系，其中，盐水温度为50～60℃，发酵时取部分盐预先溶解，浓度为19～20％(190～200g/L)，剩余盐以干盐形式在加盐水时均匀加入曲料，在温度为28℃、湿度为70％条件下恒温恒湿培养30d，每2d将混合物搅拌均匀。
检测不同米曲霉菌株制作的蚕豆曲发酵30d后成熟蚕豆醅的总酸及氨基酸态氮含量，可知总酸含量与氨基酸态氮含量具有正相关性，且组合制曲优于纯种制曲，说明本发明提供的菌剂有助于郫县豆瓣原料利用率及风味的提升。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
四川省郫县豆瓣股份有限公司
<120> 优质米曲霉组合菌剂及其在制备郫县豆瓣酱中的应用
<130> BAA211669A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcctctaaat gaccaagttt g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaagggrtg tatttattag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (10)

1.一株米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30008，于2021年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23816。
2.含有权利要求1所述米曲霉LBM 30008的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1所述米曲霉LBM 30008，或者同时含有权利要求1所述米曲霉LBM 30008、米曲霉LBM30007和米曲霉3.042；所述米曲霉LBM 30007于2021年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23815。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，将所述米曲霉LBM 30008、米曲霉LBM 30007和米曲霉3.042分别培养3～5d，三菌按孢子个数比(1～3):(1～3):(4～7)进行混合，得到孢子总浓度为5×106～1×107个/mL的微生物菌剂。
5.一种制备蚕豆曲的方法，其特征在于，利用权利要求2～4任一所述菌剂制备蚕豆曲。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将蚕豆瓣经烫瓣、浸泡后，将蚕豆瓣与小麦粉按照干蚕豆瓣质量：小麦粉质量＝(100～120):(10～30)混匀，再按5.00～7.00×106个孢子/g干蚕豆加入米曲霉孢子，混合后在温度28～35℃、湿度85～38％培养18～22h，培养结束后，在温度25～30℃、湿度75～85％下培养至获得成曲。
7.一种制备豆瓣酱的方法，其特征在于，利用权利要求5或6任一所述方法制备得到的蚕豆曲制备豆瓣酱。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述蚕豆曲、食盐、水按照干蚕豆：食盐：水＝(100～120)：(35～40)：(70～80)的质量比混合，在温度为25～30℃、湿度为60～80％条件下恒温恒湿培养25～35d，每2～3d翻动一次。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将食盐加水调制成盐水，配制成浓度为190～200g/L的盐水，并保持盐水温度为50～60℃，剩余的食盐以干盐形式在加盐水时均匀加入曲料。
10.权利要求1所述米曲霉，或权利要求2～4任一所述微生物菌剂在制备蚕豆曲、豆瓣酱、酱油、食醋中的应用。
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