JPH06506831A - ラムノガラクツロナーゼ、対応するｄｎａ配列、ラムノガラクツロナーゼ含有酵素調製物および該酵素調製物の用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ラムノガラクツロナーゼ、対応するＤＮＡ配列、ラムノガラクツロナーゼ含有酵 素調製物および該酵素調製物の用途 本発明は、ラムノガラクツロナーゼ（以下、一般にＲＧアーゼと略記する）、対 応するＤＮＡ配列、ＲＧアーゼ含有酵素調製物および該酵素調製物の用途に関す る。

本発明は遺伝子工学に関し、ＲＧアーゼの部分アミノ酸配列を提供する。それら の部分アミノ酸配列はＤＮＡプローブの作製に利用することができ、該ＤＮＡプ ローブは、そのような酵素を発現する生物体からのゲノムライブラリーまたはｃ ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、微生物種中に挿入する とＲＧアーゼの過剰生産に、または非形質転換条件下ではＲＧアーゼ密接関連酵 素を生産しない宿主微生物中に挿入すると密接関連酵素を伴わないＲＧアーゼの 生産に利用することができるＤＮＡ配列を得るのに用いることができる。

ラムノガラクツロナンを含む植物細胞壁は複雑な性質のものである。多数の刊行 物がそれらの細胞壁を構成している構成単位として働く多糖、並びに果物と野菜 の生育、成熟および加工に関する多糖の重要性を扱っている。特にペクチンは、 この点で最も重要な成分の１つであるために頻繁に研究されている。ペクチンは 、主に高度に分岐したラムノガラクツロナンを含んで成る［毛状Ｊ　（分岐）領 域と交互に存在する高度にカルボキシメチル化された直鎖状ホモガラクツロナン 領域から成るといわれている。直鎖状ホモガラクツロナン領域は非常に良く理解 され特徴づけられているが、いわゆる毛状領域の構造はまだ十分には特徴づけら れておらず、従って多数の研究の主題となっている。しかし、科学的興味の他に も工業的理由で、それらの毛状領域を分解し得ることは非常に重要である。例え ば果物、野菜、穀物、油性果物および種子のような植物材料の工業的手法による 酵素的液化は、ベクトース分解酵素、セルロース分解酵素およびタンパク質分解 酵素調製物の組合せを必要とする。この酵素処理は、不溶性細胞壁プロトペクチ ンに由来する毛状領域と他のペクチン断片を可溶化する。一方で、例えば不透明 液体や可溶性植物繊維含有溶液の製造のために、それらの多糖の可溶化が所望さ れる。他方では、それらの多糖はほとんどの工業用酵素調製物の完全分解に耐性 であるため、透明液体の加工中に問題を引き起こす。

今までに毛状領域のラムノガラクツロナン骨格を分解することができる唯一の酵 素調製物〔アスペルギルス・アクレータス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ａｃｕｌ ｅａｔｕｓ　）由来〕が記載されているだけである。

従って、科学的（それらの複雑な多糖の構造の研究）および工業的（植物材料の 液化）理由でそれらの毛状領域を分解することのできる酵素について一層多くの 知識を得ることは非常に重要である。特に例えば人間の食物や動物飼料用への植 物細胞壁の改質（例えば果物、野菜、穀物、油性果物および種子の液化）を扱う 研究にとっては、大幅に異なる工業作業条件下で望ましいＲＧアーゼ作泪を発揮 できるようにするために、多様なＲＧアーゼ（作用形態、ｐＨおよび温度領域に 関して）を提供することが非常に重要である。

ＲＧアーゼはオランダ国Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ　６７０３　ＨＤ、　Ｂｏｍｅｎ ｗｅｇ　２にある　Ｗａｇｅｏｉｎｇｅｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ、　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｊｏｎからのポスター“Ｒｈａｍｎｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓ ｅ　；　ａｎｏｖｅｌ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ ｌｙ　ｂｒａｎｃｈｅｄ　ｒｈａｍｎｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎｒｅｇｉｏｎ ｓ　ｉｎ　ａｐｐｌｅ　ｐｅｃｔｉｃ　５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ”中に記載されて いる。このポスターから、ラムノガラクツロナーゼは、その起源は記載されてい ないが、植物細胞壁中の改質［毛状領域Ｊ　（ＭＨＲ）の骨格の分解に非常に適 している。また、この酵素は、特に別の酵素と組合せて、植物細胞壁組織の分解 において役割を果たし得ることが記載されている。しかしながら、その別の酵素 は特定されていない。

また、アスペルギルス・アクレータスからのＲＧアーゼの単離および精製は、５ ｃｈｏｌ　ｓらによりＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　２０６　 （１９９０）１０５−１１５．　”Ｐｈａｍｎｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ： 　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｅｎｚｙｍｅ、　ｔｈａｔ　ｄｅｇｒａｄｅｓｔｈｅ　ｈａ ｉｒｙ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｅｃｔｉｎｓ”中に記載されている。第１１ 頁の１行目から、ＲＧアーゼが５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい て単一バンドとして移動することから高純度に精製されたらしい。

更に、Ｃｏ１ｑｕｈｏｕｎによるＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　２０６　（Ｊ９９０）１３１−１４４．　“Ｉｄｅｎｔｉｆｊｃａｔｉｏｎ　 ｂｙ　ｎ、ｍ、ｒ、　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏ−ｓａｃｃ ｈａｒｉｄｅｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ 　ｈａｉｒｙ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆａｐｐｌｅ　ｐｅｃｔｉｎ　ｗｉｔｈ　ｒ ｈａｍｎｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ”の文献において、リンゴペクチンの改 質毛状（分岐）領域をＲＧアーゼで酵素分解することにより得られたオリゴ糖の 混合物の組成が記載されている。

ＲＧアーゼによるリンゴペクチンの抽出は、Ｃ，Ｍ、Ｇ、Ｃ，Ｒｅｎａｒｄら。

Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ　ｄｅ　Ｂｉｏｃｈｉａ＋ｉｅ　ｅｔ　Ｔｅｃｈｎａｌ ｏｇｉｅ　ｄｅｓ　Ｇ２ｕｃｉｄｅｓ、　ＩＮＲＡ。

Ｎａｎｔｅｓ　（Ｆｒａｎｃｅ）によりポスター”　Ｅｘｔｒａｃｔｊｏｎ　ｏ ｆ　ａｐｐｌｅ　ｐｅｃｔｉｎｓｂｙ　Ｒｈａｍｎｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓ ｅ、　ａ　ｎｅｗ　ｐｅｃｔｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｌＸｌｅ”中に更に記載さ れている。

出願人の知識の限りでは、一種のＲＧアーゼ、即ち５ｃｈｏｌｓらにより記載さ れたＡ、アクレータス（Ａ、　ａｃｕ　ｅａｔｕｓ）　ＲＧアーゼのみが従来技 術に属し、精製されている。このＲＧアーゼは前述の全参考文献中に見られるＲ Ｇアーゼである。また、このＲＧアーゼは部分的にのみ特徴づけられており、ア ミノ酸配列に関しては特徴づけられておらず、対応するＲＧアーゼ産生遺伝子は クローニングされておらず、よって従来技術のＲＧアーゼは安価で工業的に有用 な製品として利用可能ではない。

従って、前に指摘した理由で、ラムノガラクッロナンを工業的に分解しなければ ならない条件に対応する異なる性質、例えば異なる特異性、最適ｐ）（および最 適温度、を有する多様なＲＧアーゼを提供する必要がある。第二に、経済的に堅 実な方法で工業的に利用することができる安価で且つ純粋なＲＧアーゼへの要求 がある。

よって、本発明の目的は、ラムノガラクッロナンを分解しなければならない種々 の工業条件に対応する多様な特性を示す態様を包含するＲＧアーゼの提供、およ び今までに可能なものよりも優れた収率で一層安価に且つ一層高純度で生産する ことができるＲＧアーゼの提供である。また、もとの生成物中の比率に比較して ＲＧアーゼの比率が増加または減少されている新規生成物を提供することも本発 明の目的である。

従って、本発明に係るＲＧアーゼは次のアミノ酸配列：Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ −Ａｒｑ　（配列＃号１）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−工１ｅ− Ｔｈｒ−Ｓａｒ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号 ２） ｌ　５ Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−工１ｅ−Ａｌａ−工１ｅ　（配列番号５）Ｐ ｈｉ　（配列番号６） Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−工１ｅ（配列番号１０）（配列番号１２） １　５　１０　ユ５ Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−５＠ｒ−５ａｒ−５ｅｒ− Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−工１ｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−または上記配列に対して少 なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０現する種々の条件下でラムノガラク ツロナンを分解する有利に高い能力を有する新規部類のＲＧアーゼである。

本発明に係るＲＧアーゼの好ましい態様は、次の部分アミノ酸配列： Ｇｌｙ−Ａｌ　ａ　−Ｖａｌ　−Ｇｌ　ｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ− Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＴｈｒＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ａ ｌａ−Ａｒｇ　（配列番号１）５ｅｒ−Ｘａａ−Ａｓｎ−工１ｅ−Ｌｅｕ−５ｓ ｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｘａａ−５ｅｒ−Ｔｈ ｒ−Ａｓｐ−ＶａニーＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−工１ｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ａｌ ａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号２） ５ｅｒ−ＡｒＣｉ−ＡＳｎ−工１ｅ（配列番号３）Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａ ｓｐ−工１ｅ−Ａｌａ−工１ｅ（配列番号５）ＧＩＹ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｌａ −Ｘａａ−工１ｅ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−工１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ −Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈａ　（配列番号６） ５ａｒ−Ｌａｕ−Ａｓｐ−工１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ　（配列番号７）（ 配列番号８） Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｓｎ−工１ｇ（配列番号１０）Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌ ａｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ　（配列番号１１）Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔ ｈｒ−Ｔｒｐ−６ｓｒ−５ａｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｍａｔ−工 １ｅ−Ｌｙｓ（配列番号１２） 列により特徴づけられる： 本発明に係るＲＧアーゼの好ましい態様は、次の部分アミノ酸配列により特徴づ けられる： Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−に１ｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−（配列番号１５）本発明に 係るＲＧアーゼの好ましい態様は、アスペルギルス・アクレータス（Ａｓ　ｅｒ 　１ｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ　）　ＣＢＳ　１０１．４３によって得られ ることにより特徴づけられる。

本発明に係るＲＧアーゼの好ましい態様は、Ａ、ジャボニカス（Ａ、　」ａ　ｏ ｎｉｃｕｓ）　ＡＴＣＣ２０２３６によって得られることにより特徴づけられる 。

本発明に係るＲＧアーゼの好ましい態様は、イルペックス・ラフテラス（ｉＢｅ ｘ　Ｉａｃｔｅｕｓ）　ＡＴＣＣ２０１５７によって得られることにより特徴づ けられる。

また、本発明は、ＲＧアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 、またはそのようなＲＧアーゼコード配列に対する実質的配列相同性、好ましく は少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０９６、最も好ましくは少な くとも９０％の相同性を有するＤＮＡ配列、を含んで成る組換えＤＮＡ配列に関 する。

本発明の組換えＤＮＡ配列の好ましい態様は、ａ）任意の適当なプラスミド中の アスペルギルス・アクレータス（Ａ、　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）　、Ａ、ジャポニ カス（Ａ、　」ａ　ｏｎｉｃｕｓ）またはイルペックス・ラフテラス（扛坦Ｕ尤 ｔｅｕｓ）　ＲＧアーゼＤＮＡ挿入断片 ｂ）　ａ）のＤＮＡ挿入断片により構成される成熟ＲＧアーゼＤＮＡのコード領 域にハイブリダイズし、且つＲＧアーゼ活性を有するポリペプチドの構造遺伝子 、並びに所望によりプロモーター、シグナルもしくはリーダーペプチドおよび／ または転写ターミネータ−を含んで成るＤＮＡ配列 Ｃ）　ａ）またはｂ）において定義されたＤＮＡ配列の誘導体、またはｄ）成熟 ＲＧアーゼまたはそれのシグナルペプチドもしくはリーダーペプチドをコードし 、且つａ）またはｂ）のＤＮＡ配列に関する遺伝暗号の意味の中で縮重するＤＮ Ａ配列から選ばれたＤＮＡ配列を含んで成る。

本発明の組換えＤＮＡ配列の好ましい態様は、ＲＧアーゼ活性が本発明の部分ア ミノ酸配列を用いてアスペルギルス・アクレータス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　 ａｃｕｌｅａｔｕｓ）　ＣＢＳ　１０１．４３により生産可能であるＲＧアーゼ に由来するという事実により特徴づけられる。

本発明の組換えＤＮＡ配列の好ましい態様は、ＲＧアーゼ活性が本発明の部分ア ミノ酸配列を用いてアスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　 ’ａ　ｏｎｉｃｕｓ）　ＡＴＣＣ２０２３６により生産可能であるＲＧアーゼに 由来するという事実により特徴づけられる。

本発明の組換えＤＮＡ配列の好ましい態様は、ＲＧアーゼ活性が本発明の部分ア ミノ酸配列を用いてイルペックス・ラフテラス（ｋ卯り山ｔｃｔｅｕｓ）　ＡＴ ＣＣ２０１５７により生産可能であるＲＧアーゼに由来するという事実により特 徴づけられる。

本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ配列を含んで成るベクターを包含する。

本発明に係るベクターの好ましい態様は、プロモーターがアスペルギルス・オリ ザエ（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｏｒ　ｚａｅ）のタカアミラーゼプロモーター であるという事実により特徴づけられる。

本発明は、本発明のベクターを含有するという事実により特徴づけられる、形質 転換された宿主も包含する。

本発明の形質転換された宿主の好ましい態様は、形質転換された宿主がアスペル ギルス・アクレータス（Ａｓ　ｅｒ　’ｆｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アス ペルギルス・ニガー（Ａｓ　ｅｒ　ｊｌｌｕｓ　ｎｊ　ｅ　）　、アスペルギル ス・オリザエ（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｏｒ　ｚａｅ）またはアスペルギルス ・アワモリ（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）種に属する株であると いう事実により特徴づけられる。

本発明の形質転換された宿主の好ましい態様は、形質転換された宿主がそれの非 形質転換条件下ではＲＧアーゼを生産しないかまたは取るに足らない量でしかＲ Ｇアーゼを生産しない微生物、好ましくはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、Ｅ 、コリ（Ｅ　ｃｏ且）またはＳ、セレビシェ−（Ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で あるという事実により特徴づけられる。

更に本発明は、本発明の形質転換された宿主を生産に利用するという事実により 特徴づけられる、ＲＧアーゼの生産方法を包含する。

また、本発明は、本発明の方法によって生産されるＲＧアーゼを包含する。

本発明は、本発明のＲＧアーゼを含んで成る酵素調製物であって、それか別の植 物細胞壁分解または改質剤、好ましくは植物細胞壁の分解または改質に有用なペ クチナーゼおよび／またはセルラーゼおよび／またはへミセルラーゼを含有し、 ＲＧアーゼが富化された、好ましくは少なくとも１．１の富化係数を有する酵素 調製物、またはＲＧアーゼが損失された、好ましくは最大０．９の損失係数を有 することにより特徴づけられる酵素調製物を包含する。

本発明に係る酵素調製物の好ましい態様は、別の細胞壁分解または改質剤が、ア スペルギルス属に属する微生物、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓ　ｅ ｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ）　、アスペルギルス・アクレータス（Ａｓ　ｅｒ 　１ｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）　、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓ　ｅ ｒ　１ｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）またはアスペルギルス・オリザ−ｒ−（昼Ｌ ｒ　ｊｌｌｕｓ　ｏｒ　ｚａｅ）により生産可能であるという事実により特徴づ けられる。

本発明はまた、植物細胞壁および／または植物細胞壁成分の分解または改質剤と しての本発明のＲＧアーゼの用途を包含する。

また、本発明は、植物細胞壁および／または植物細胞壁成分の分解または改質剤 としての本発明の酵素調製物の用途を包含する。

本発明の組換えＤＮＡ配列をいかに生産することができるかを下記に説明する。

遺伝子供与体としてのアスペルギルス・アクレータス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ 　ａｃｕｌｅａｔｕｓ　）　ＣＢＳ　１０１．４３株を次のようにしてパイロッ トプラントの規模で増殖させた。

次の組成の寒天基質をフェルンバッハフラスコ中で調製した：ペプトン　Ｄｉｒ ｃｏ　６　ｇ アミノリン　０ｒｔａｎａ　４　ｇ グルコース　１ｇ 酵母エキス　Ｄｉｒｃｏ　３　ｇ 肉エキス　Ｄｉｒｃｏ　１．５　ｇ ＫＨｘＰＯａ　Ｍｅｒｃｋ　２０　ｇ 麦芽エキス　Ｅｖｅｒｓ　２０　ｇ イオン交換ＨｚＯａｄ　１０００　ｍ１ｐＨを５．３０〜５．３５に調整した。

次に４０　ｇの寒天（Ｄｉｒｃｏ）を加え、混合物を１２０℃で２０分間加熱滅 菌した（この基質をＥ寒天と称する）。

株ＣＢＳ　１０１．４３をＥ寒天斜面上で培養した（３７℃）。この斜面からの 芽胞を滅菌法スキムミルク中に懸濁し、その懸濁液をバイアル中で凍結乾燥した 。１つの凍結乾燥バイアルの中身をフエルンバッハフラスコに移した。次いでこ のフラスコを３０℃で１３日間インキュベートした。

次の組成を有する基質を５００１の種ｇ酵槽中に調製した：ブロフェック（コー ン浸漬液乾燥物）３．６ｋｇ大豆油　１．２ｋｇ 水道水を約２４０１の総容量になるように加えた。ＣａＣ０＊の添加前にｐＨを 約５．５に調製した。上記基質を種母醗酵条件で１２１”Ｃにて１時間滅菌した 。接種前の最終容量は約３００１であった。

フェルンバッハフラスコ芽胞懸濁液を種母醗酵槽に移した。種母醗酵条件は次の 通りであったコ 醗酵槽の型：約２．３の高さ／直径比を有する常用の通気型攪拌醗酵槽。

攪拌　３００ｒｌ）ｍ（２つのタービン攪拌翼）通気　３００６ｍ準リすトル空 気／分 温度　３０〜３１℃ 時間　約２８時間 接種後約２８時間目に１５０１を種母偕酵槽から主醗酵槽に移した。

次の組成を有する基質を２５００１の主醗酵槽中に調製したニド−ストした大豆 粉　９０　ｋｇ ＫｔｂＰ（Ｌ　２０　ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（ｉＥｌ消泡剤　１５０　ｍｌ水道水を約９００１の総容量に なるように加えた。トーストした大豆粉を水に懸濁した。ＮａＯＨでｐＨを８． ０に調整し、温度を５０℃に上げた。その後、９２５アンソン単位のＡＩｃａＪ ａｓｅ＠　Ｑ、６　Ｌを懸濁液に加えた。この混合物を通気せずに１０Ｏｒｐｍ の攪拌下で５０℃とｐＨ＝　８．０（ＮａｚＣＯｔ添加）に約４時間維持した。

その後、残りの基質成分を加え、リン酸でｐＨを約６．０に調整した。この基質 を主醗酵槽中で１２３℃にて１．５時間滅菌した。接種前の最終容量は約１０８ ０　ｆであった。

次に１５０１の種母培養物を添加した。

醗酵条件は次の通りであった： 醗酵槽の型、約２．７の高さ／直径比を有する常用の通気型攪拌醗酵槽。

攪拌　２５０ｒｐｍ（２つのタービン攪拌翼）通気　１２００標準リットル空気 ／分 温度　３Ｑ’Ｃ 時間　約１５１時間 ２４醗酵時間から約１１６醗酵時間までペクチン溶液を約８１／時の一定速度で 主醗酵槽に無菌添加した。次の組成を有するペクチン溶液を５００１の計量タン ク中で調製した：ペクチン　ｇｅｎｕリ　２２　ｋｇ 濃リン酸　６　ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ＠消泡剤　５０ｍ１ ３ゝＧｅｎｕペクチン（ｔｂｅ　Ｃｏｐｅｎｈｕｅｎ　ｐｅｃｔｊｎ　ｆａｃｔ ｏｒｙＬｔｄ、からの柑橘類型ＮＦ） 水道水を約３２５１の総量に添加した。基質を計量タンク中で１２１℃にて１時 間滅菌した。分配開始前の最終容量は約３６０１であった。

１回の醗酵に使うペクチン溶液の総量は約７２５１であった。

約１５１醗酵時間後、醗酵工程を停止した。約１８５ＯＡ’の培養ブロスを５℃ 付近に冷却し、次の方法に従って酵素を回収した。

Ｈｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土（濾過助剤）が下塗された真空ドラム フィルター（Ｄｏｒｒ　０ｌｊｖｅｒ）上で培養ブロスをドラム濾過した。蒸発 によって濾液を培養ブロスの容量の約１５％に濃縮した。この濃縮物を、濾過助 剤として０．２５％　Ｈｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土を使って５ｅｉ ｚ濾紙（ｓｕｐｒａ　１００型）上で濾過した（下記の表では濾過■とした）。

１１あたり５６１　ｇの（ＮＨ４）、Ｓ０４を用いてｐＨ５，５において濾液を 沈澱させ、そして濾過助剤として４＄　ＨｙｆＩｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻 土を添加した。沈＃物と濾過助剤をフレームフィルター上での濾過により分離し た。

濾過ケークを水に溶かし、不溶性部分をフレームフィルター上での濾過により分 離した。その濾液を、濾過助剤として０．２５％Ｈｙｆｌ。

５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌ　ｌを使って５ｅｊｚ濾紙（ｓｕｐｒａ　１００型）上で点 検濾過した（下記の表中では濾過■とした）。濾液を限外濾過装置上で透析した 。

透析後、液体を１２，７％の乾燥物質含量にまで濃縮した（下の表では濃縮物中 の乾燥物質含量とした）。

表１に記載のようにして、上記アスペルギルス・アクレータス酵素調製物ブロス からＲＧアーセを単離した（図１〜４）。

；　太」− よ　アスペルギルス・アクレータス：ラムノガラクッロナーゼの精製夢　アスペ ルギルス・アクレータス酵素ブロス５：試料調製 架橋アルギン酸プール、ｐＨを６．０に調整ラムノガラクッロナーゼ が段階２でカラムに結合しないだろう）。

からラムノガラクツロナーゼ画分をプールした。

３について・ 段階４への準備のため濃度と緩衝液を交換した。

２５５−２６０．１９８２に従って行った。

５について： 段階４への準備のためｐＨを調整した。

段階８への準備のため濃度と緩衝液を交換した。

からラムノガラクツロナーゼ画分をプールした。

ここでアミノ酸配列の一部分を決定する：ＲＧアーゼのＮ末端はブロックされて おり、従って直接アミノ酸配列決定は不可能である。ＲＧアーゼをトリプシンで 酵素消化した後、次の内部アミノ酸配列が得られた。Ｘａａは、おそらく炭水化 物を担持していると思われる未決定のアミノ酸残基を表す。

Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号夏）Ｔｒｙｐ−２３： ５ｅｒ−ｘａａ−Ａｓｎ−工１ａ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−人１ａ− Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｘａａ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ− Ｐｒｏ−Ａｌａ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｓａｒ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ａｌａ− Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号２） Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−工１ｅ（配列番号３）５ｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌ ｙ−５ｅｒ−Ｇａｙ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　（配列番号４）Ｔｈｒ −Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−工１ｅ−Ａｌａ−工１ｅ（配列番号５）Ｇｌｙ−Ｌ ｅｕ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−工１ｅ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−工 １ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ　（配列番号６） Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−工１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ　（配列番号７）次 のようにしてアスペルギルス・アクレータス（’ｆｌｕｓ−ｍ）ＲＧアーゼを更 に特徴づけた。

図５と図６は、それぞれｐｌ（活性とｐＨ安定性を示す。

最適ｐＨはｐＨ５，０付近である。安定性は、室温で１時間処理した時、ｐＨ３ 〜６，５で良好である（２８０％残余活性）。活性はより酸性領域で僅かに減少 するか、ｐＨ２，５でもまだ約７０％の活性が認められる。

囚７と図８はそれぞれ温度活性依存性と温度安定性依存性を示す。

最適温度は約４０℃であり、温度活性領域は比較的広範囲である。

果汁およびワイン産業にとっては、低温度領域での活性は非常に注目すべきであ る：ｌＯ℃で約５０％の活性、５℃で約４０％の活性。

５〜５０℃の温度領域では、ＲＧアーゼはｐＨ４，５での１時間の処理後も著し く影響を受けない（初期活性の２８０％）が、５５℃以上の温度では急速に不活 性化される。

分子量：　６１．０００ダルトン 等電点：　ｐ）ｆ４．６ Ａ、アクレータスＲＧアーゼ、Ａ、ジャポニカスＲＧアーゼおよびイルペックス ・ラクテウスＲＧアーゼについて同一であるＲＧ活性単位は、次のように定義さ れる。

ＲＧアーゼ１単位は、基質としてのリンゴのけん化改質毛状領域（ＭＨＲ−３） からｐＨ５，３０℃にて１分間に１ｇモルの分子を放出する酵素の量である。

このＭＨＲ−３基質は、５ｃｈｏｌ　ｓら、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　２０６（１９９０）、　１０５−１１５頁、“Ｒｈａｍｎｏｇａ ｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ：　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｅｎｚｙｍｅ。

ｔｈａｔ　ｄｅｇｒａｄｅｓ　ｔｈｅ　ｈａｉｒｙ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐ ｅｃｔｉｎｓ”中に記載された方法に従って調製した。

分子の放出量は、高性能ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）を使って決 定される分子量の分布の変化から算出される。市販のゲル浸透クロマトグラフィ ーソフトウェアを使って、ＲＧアーゼでの処理の前後に数平均分子量（Ｍ、）を 算出した。基質濃度に関連して、開裂されたグリコシジル結合の数を算出し、そ して上述の単位定義に従って活性単位において表した。

遺伝子供与体としてのアスペルギルス・ジャポニカス（翁■肛ｌｕ力坦」ｌ曵頂 工胚−）　ＡＴＣＣ２０２３６を次の方法で、（イロットプラントの規模におい て培養した。

次の組成を有する寒天基質をフエルンバツノ＼フラスコ中で調製した： ペプトン　Ｄｉｒｃｏ　６　ｇ アミノリン　０ｒｔａｎａ　４　ｇ グルコース　１ｇ 酵母エキス　Ｄｉｒｃｏ　３　ｇ 肉エキス　Ｄｉｒｃｏ　１．５　ｇ ＫＨｚＰＯ４Ｍｅｒｃｋ　２０　ｇ 麦芽エキス　Ｅｖｅｒｓ　２０　ｇ イオン交換Ｈ，Ｏａｄ　１０００　ｍ１ｐＨを５，３０〜５．３５に調整した。

次に４０　ｇのＤｉｒｃｏ寒天を加え、混合物を１２０℃で２０分間加熱滅菌し た（この基質をＥ寒天と称する）。

株ＡＴＣＣ２０２３６をＥ寒天斜面上で培養した（３０℃）。この斜面からの芽 胞を滅菌済スキムミルク中に懸濁し、その懸濁液をバイアル中で凍結乾燥した。

１つの凍結乾燥バイアルの中身をフエルンバツハフラスコに移した。次いでこの フラスコを３０℃で２７日間インキュベートした。

次の組成を有する基質を５００１の種母醗酵槽中に調製した：ＣａＣＯ５１，２ ｋｇ グルコース　７．２ｋｇ プロフェック （コーン浸漬液乾燥物質）３．６ｋｇ 大豆油　１．２ｋｇ 水道水を約２４０１の総容量になるように加えた。ＣａＣ０，の添加前に９Ｈを 約５．５に調整した。上記基質を種母醗酵槽中で１２１’Ｃにて１時間滅菌した 。接種前の最終容量は約３００１であった。

フェルンバッハフラスコ芽胞懸濁液を種母醗酵槽に移した。種子醗酵条件は次の 通りであった： 醗酵槽の型：約２，３の高さ／直径比を有する常用の通気型攪拌醗酵槽。

攪拌　３００　ｒｐｍ　（２つのタービン攪拌翼）通気　３００標準リットル空 気／分 温度　３０〜３１℃ 時間　約２８時間 接種後約２８時間目に１５０１を種９酵槽から主醗酵槽に移した。

次の組成を有する基質を２５００１の主醗酵槽中で調製したニド−ストした大豆 粉　９０　ｋｇ ＫＨｚＰＯ４２０ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ＠消泡剤　１５０　ｍｌて１．５時間滅菌した。接種前の最終 容量は約１１００１であった。

次に１５０１の種母培養物を添加した。

酵槽。

攪拌　２５０ｒｐｍ（２つのタービン攪拌翼）通気　１２００標準リットル空気 ／分 温度　３０℃ 液を５００１の計量タンク中で調製した：ペクチン　ｇｅｎｕ”　２２　ｋｇ 濃リン酸　６　ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ＠消泡剤　５０　［１１”　Ｇｅｎｕペクチンはｔｈｅ　Ｃｏ ｐｅｎｈａｇｅｎ　ｐｅｃｔｉｎ　ｆａｃｔｏｒｙＬｔｄ、　からの柑橘類型Ｎ Ｆのものであった。

水道水を約３２５１の総量に添加した。基質を計量タンク中で１２１°Ｃにて１ 時間滅菌した。投与開始前の最終容量は約３６０１であった。

この部分が尽きた時、別の同様な部分を作製した。

約１５１醗酵時間の後、醗酵工程を停止した。約１８５０１の容量を有する得ら れた培養ブロスを５°Ｃ付近に冷却し、次の方法に従って酵素を回収した。

Ｈｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土（濾過助剤）が下塗された真空ドラム フィルター（Ｄｏｒｒ　０ｌｉｖｅｒ）上で培養ブロスをドラム濾過した。蒸発 によって濾液を培養ブロスの容量の約１５％に濃縮した。この濃縮物を、濾過助 剤として０．２５％Ｈｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土を使って５ｅｊｚ 濾紙（ｓｕｐｒａ　１００型）上で濾過した。（ＮＨ，）、ＳＯ，を用いて５， ５のｐＨにおいて濾液を沈澱させ、そして濾過助剤として４％Ｈｙｆｌｏ　５ｕ ｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土を添加した。沈澱物と濾過助剤をフレームフィルター上 での濾過により分離した。濾過ケークを水に溶かし、不溶性部分をフレームフィ ルター上での濾過により分離した。その濾液を、濾過助剤として０．２５％　Ｈ ｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌを使って５ｅｉｚ濾紙（ｓｕｐｒａ　１００型 ）上で点検濾過した。濾液を限外濾過装置上で透析した。透析後、液体を濃縮し た。

表２に記載のようにして、上記アスペルギルス・ジャボニカス（ハ坦匡■用り坦 匹肚聾し）酵素調製物からＲＧアーゼを単離した（図９〜１１）。

紅 アスペルギルス・ジャボニカス、ラムノガラク゛ノロナーゼの精製アスペルギル ス・ジャボニカス酵素ブロス１について： 段階２への準備のため緩衝液を交換し、小粒子および約５０％の色を除去し、最 大１５　［［１ｇタンパク質質層−希釈した（そうでないと試料が段階２でカラ ムに結合しないだろう）。

２について： ＩＥＣはイオン交換クロマトグラフィーである。０−０５−０．０６　Ｍ　Ｎａ Ｃ１からラムノガラクツロナーゼ画分をプールした。

３について： 段階４への準備のため緩衝液を合わせた。

４について： ＨＩＣは疎水的相互作用クロマトグラフィーである。１．１８　Ｍ−１，４１Ｍ （ＮＨ４）、ＳＯ，からラムノガラクツロナーゼ画分をプールした。

５について： 段階６への準備のため緩衝液を交換した。

６について： ＩＥＣはイオン交換クロマトグラフィーである。０．０１４−０．０２４　ＭＮ ａＣ１からラムノガラクツロナーセ画分をプールした。

ここでアミノ酸配列の一部分、即ちアスペルギルス・ジャポニカス（ん迂皇ｒ上 す五−り立川Ｂ犯長−）　ＡＴＣＣ２０２３６由来のラムノガラク゛ノロナーゼ のＮ末端アミノ酸配列が決定された。

該配列は、データベース中の他のタンパク質に対する相同性を持たない。その上 、アスペルギルス・アクレータス（渠注里玉月↓Ｉ−ａｃｕｌｅａｔｕｓ　）由 来のラムノガラクツロナーゼのペプチド配列に対しても相同性がない。

次のようにしてアスペルギルス・ジャポニカス（ｋ津影Ｉ月１四−釦匹旺皿し） 　ＲＧアーゼを更に特徴づけた。

図１２と図１３は、それぞれｐＨ活性とｌ）Ｈ安定性を示す。

最適ｐＨは約ｐＨ６，５−７，０である。中性およびアルカリ性領域での活性が 特に顕著である。ｐＨ５゜５〜１２の間で活性は最大活性の２８０％である。

安定性は、室温で１時間処理した時、ｐＨ５，５〜１２で良好であるが、より低 いｐｔ＋では安定性が有意に減少する。

図１４と図１５はそれぞれ温度活性依存性と温度安定性依存性を示す。

最適温度は約４０℃であり、温度活性領域は比較的広範囲である：２０℃〜６０ ℃で活性は最大活性の２８０％である。

果汁およびワイン産業にとっては、低温度領域での活性は非常に注目すべきであ る＝５〜ＩＯ°Ｃで２６０％の活性。５〜５０℃の温度領域では、ＲＧアーゼは ｐＨ４，５での１時間の処理後も著しく影響を受けない（初期活性の２８０％） が、４０℃以上では顕著に影響を受ける。

分子量：　５３．０００ダルトン 等電点：　ｐＨ５，３ 遺伝子供与体としてのイルペックス・ラフテラス（Ｉｒ　ｅｘ　１ａｃｔｅｕｓ ）ＡＴＣＣ２０１５７を次の方法でパイロットプラントの規模において培養した 。

次の組成を有する寒天基質をフェルンバッハフラスコ中で調製した： ペプトン　Ｄｉｒｃｏ　６　ｇ アミノリン　０ｒｔａｎａ　４　ｇ グルコース　Ｉｇ 酵母エキス　Ｄｉｒｃｏ　３　ｇ 肉エキスＤｉｒｃｏ　Ｉ−５ｇ ＫＨｚＰＯ４Ｍｅｒｃｋ　２０　ｇ 麦芽エキス　Ｂｖｅｒｓ　２０　ｇ イオン交換ＨｚＯａｄ　１０００　ｍ１ｐＨを５．３０〜５．３５に調整した。

次に４０　ｇのＤｉｒｃｏ寒天を加え、混合物を１２０℃で２０分間加熱滅菌し た（この基質をＥ寒天と称する）。

株ＡＴＣＣ２０１５７をＥ寒天斜面上で培養した（３７℃）。この斜面からの芽 胞を滅菌済スキムミルク中に懸濁し、その懸濁液をバイアル中で凍結乾燥した。

１つの凍結乾燥バイアルの中身をフェルンバッハフラスコに移した。次いでこの フラスコを３７℃で１８日間インキュベートした。

次の組成を有する基質をｓｏｏ　ｚの種子醗酵槽中に調製した：ＣａＣ０，１， ２ｋｇ グルコース　７．２ｋｇ プロフェック （コーン浸漬液乾燥物質）３．６ｋｇ 大豆油　１．２ｋｇ 水道水を約２４０１の総容量になるように加えた。ＣａＣ０２の添加前にＩ）Ｈ を約５．５に調整した。上記基質を種卯酵槽中で１２１℃にて１時間滅菌した。

接種前の最終容量は約３００！であった。

フェルンバッハフラスコ芽胞懸濁液を種母僅酵槽に移した。種子醗酵条件は次の 通りであった： 醗酵槽の型：約２．３の高さ／直径比を有する常用の通気型攪拌醗酵槽。

攪拌：　３０Ｏｒｐｍ　（２つのタービン攪拌翼）通気＝３００３００標準リツ トル空 気／＝３７℃ 時＠：　約５９時間 接種後約５９時間目に１５０１を種号借酵槽から主醗酵槽に移した。

次の組成を有する基質を２５００　／の主醗酵槽中で調製したニド−ストした大 豆粉　１２０　ｋｇ マルトース　３０　ｋｇ セルロース粉末　５０　ｋｇ （Ａｒｂｏｃｅｌ　ＣＢ−２００） Ｐｌｕｒｏｎｊｃ＠消泡剤　２００　ｍｌ水道水を約１２０Ｏｆの総容量になる ように加えた。トーストした大豆粉を水に懸濁した。ｐＨを６．２に調整した後 、基質を主醗酵槽中で１２３°Ｃにて１．５時間滅菌した。接種前の最終容量は 約１５５０１であった。

次に１５０１の種子培養物を添加した。

醗酵条件は次の通りであった： 醗酵槽の型：約２．７の高さ／直径比を有する常用の通気型攪拌醗酵槽。

攪拌：　２５０ｒｐｍ　（２つのタービン攪拌翼）通気：　１２００標準リット ル空気／分温度＝３７℃ 時間　約１２０時間 ２４醗酵時間から約１３０醗酵時間まで水を約４１／時の一定速度で主醗酵槽に 無菌添加した。

表３に記載のようにして、上記イルペックス・ラフテラス（Ｉｒ　ｅｘ　１ａｃ ｔｅｕｓ　）酵素調製物ブロスからＲＧアーゼを単離した（図１６〜１８）。

紅 イルペックス・ラクテウス；ラムノガラクツロナーゼの精製イルペックス・ラフ テラス酵素ブロス １について： 段階２への準備のため緩衝液を交換し、小粒子および約５０％の色を除去し、最 大１５ＩＩ１ｇタンパク質／ｌｄに希釈した（そうでないと試料が段階２でカラ ムに結合しないだろう）。

２について： 段階３への準備のため溶液を合わせた。

３について二 ＨＩＣは疎水的相互作用クロマトグラフィーである。１．０７−１．１６１１（ ＮＨ４）、Ｓ０４からラムノガラクツロナーゼ画分をプールした。

４について： 段階５への準備のため緩衝液を交換した。

５について： ＩＥＣはイオン交換クロマトグラフィーである。カラムに結合しなかったラムノ ガラクツロナーゼ画分をプールし、段階６に使った。

６について： 段階７への準備のため緩衝液を交換した。

７について： ＩＥＣはイオン交換クロマトグラフィーである。０．１８　Ｍ−０，２２ＭＮａ Ｃｌからラムノガラクツロナーゼ画分をプールした。

ここでアミノ酸配列の一部分が決定された。

次のようにしてイルペックス・ラフテラス（Ｉｒ　ｅｘ　Ｉａｃｔｅｕｓ　）Ｒ Ｇアーゼを更に特徴づけた。

図１９と図２０は、それぞれｐＨ活性とｐＨ安定性を示す。

最適ｐＨは約ｐＨ５−ｓである。

安定性は、室温で１時間処理した時、ｐＨ３〜１１で良好である（残余活性≧８ ０％）。中性およびアルカリ性ｐＨ域での活性が顕著である：ｐＨ７ではまだ５ ０％以上の活性が認められ、ｐＨ８〜１２でもまだ約３０〜３５％の活性が認め られる。更に、優れたｐＨ安定性を言及しなければならない。ｐＨ３〜１２にお いて残余活性≧８０％が認められる。

図２１と図２２はそれぞれ温度活性依存性と温度安定性依存性を示す。

最適温度は約４０℃であり、温度活性領域は比較的広範囲である：１０℃〜１７ ℃で活性は最大活性の２８０％であり、８０℃でさえもまだ半分の活性が存在す る。

果汁およびワイン産業にとっては、低温度領域での活性は非常に注目すべきであ る＝１０℃で約８０％の活性、そして５℃で約７０％の活性。

５〜５０°Ｃの温度領域では、ＲＧアーゼはｐＨ４，５での１時間の処理後も著 しく影響を受けない（初期活性の２８０％）。６０℃でもまだ約７０％の活性が 認められるが、一方７０℃以上の温度では安定性が急速に減少する。

分子量＋　４５，０００ダルトン 等電点：　ｐＨ７，２ 下表は、同定された３つの株から単離された異なるＲＧアーセの幾つかの特徴を 示す。

上記アミノ酸配列をもとにして、対応するｃＤＮＡについて探査作業を行った。

ｍＲＮＡの単離後、ｃＤＮＡを合成した。

本発明に係る組換えＤＮＡを次のようにして作製し同定する。

Ｅ　コリ　でのＡ　アクレータスｃＤＮＡライブラリーのＢｏｅｌら（ＥＭＢＯ Ｊ、、鉦１０９７−１１０２．１９８４）およびＣｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗａｓｈ）、　１８：５２９４−５２９９．２９７９）によ り記載された方法を使って、ＲＧアーゼの最大活性時に収集したホモジナイズ済 Ａ。

アクレータス菌糸から全ＲＮＡを抽出した。ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ（ＰＮＡ Ｓ、　ＵＳＡ聾：１４０８−１４１２．１９７２）により記載されたようにオリ ゴ（ｄＴ）−セルロース上での２サイクルのアフィニティークロマトグラフィー により、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを得た。製造業者の説明に従ってＩｎｖｉｔｒｏ ｇｅｎからのｃＤＮＡ合成キットを使ってｃＤＮＡを合成した。

八　すりボデオキシリボヌクレオチド　リたＡ、アクレータスＲＧアーゼ　ｃＤ ＮＡ組　え　のｐ 決定されたアミノ酸配列の一部分に相当する合成オリゴヌクレオチドの混合物を Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、のＤＮＡ合成装置上で合成し 、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。Ａ。

アクレータスｃＤＮＡライブラリーからの約１５０．０００個のＥ、コリ組換え 体をｗｈａｔｍａｎ　５４０濾紙に移行せしめた。Ｇｅｒｇｅｎら（Ｎｕｃｌｅ ｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　７．２０５−２２３５．２９７９　）により記載さ れたようにコロニーを溶解させ固定化した。このフィルターを、Ｂｏｅｌら（Ｅ ＭＢＯＪ、、影−１０９７−１１０２，１９８４）により記載されたようにして 、２２ｐ−標識ＲＧアーゼ特異的オリゴ混合物とハイブリダイズせしめた。計算 したＴ。

よりｌＯｏＣ低い温度でフィルターのハイブリダイゼーションと洗浄を行い、次 いで映像強化膜を使って２４時間オートラジオグラフィーを行った。オートラジ オグラフィーの後、増加する温度で該フィルターを洗浄し、次いで映像強化膜を 使って２４時間オートラジオグラフィーを行った。標準法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍお よびＤｏｌｙ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

７　、１５１３−１５２３．　１９７９）によりハイブリダイズしているコロニ ーからミニプレブブラスミドＤＮＡを単離し、サンガージデオキシ法によりｃＤ ＮＡ挿入断片のＤＮＡ配列を決定した。ＨｉｎｄＩＩｒ、／Ｘｂａ　Ｉ（または 他の適当な酵素）での開裂により、ベクターからＲＧアーゼｃＤＮＡ断片を切り 出し、アガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出せしめ、そして連結反応 の用意をした。該ｃＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩ［Ｉ／Ｘｂａ　Ｉで消化されたｐＨ ０４１４に連結せしめ、該ｃＤＮＡがアスペルギルス・オリザエ（Ａｓ　ｅｒ　 １ｌｌｕｓ　ｏｒ　ｚａｅ）由来のＴＡＫＡプロモーターとアスペルギルス・ニ ガー（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ　）由来のＡＭＣターミネータ−の 転写調節下にあるｐＨＤ　ＲＧａｓｅを作製した。

免疫学的スクリーニング法を使ったＡ、アクレータスＲＧアーゼ特異的ｃＤＮＡ 組換え体の同定。

各々が約３．０００個の異なるｃＤＮＡクローンを含む５ｏブールにＣＤＮＡラ イブラリーを分割した。このプールからＤＮＡを単離し、適当な酵母株中に形質 転換せしめた。全てのクローンが酵母ライブラリーに表れていることを保証する ために、もとのプールの各々から約２０．０００個の酵母クローン（１０枚のプ レート）を得た。これらの酵母クローンを、ガラクトース含有最少寒天プレート 上に複製塗抹した。酵母コロニーの上にニトロセルロースフィルターを置き、次 いで３０℃にて２日間プレートをインキュベートした。ニトロセルロースフィル ターを剥がし、標準的免疫学的方法を使って、ＲＧアーゼに対して惹起された一 特異的抗体と共にインキュベートした。陽性クローンを２回精製し、同じ抗体調 製物を使って再スクリーニングした。陽性の酵母クローンからＤＮＡを単離し、 そして多量のＤＮＡを得るためにＥ、コリＭＣ１０６１中に形質転換せしめた。

ＤＮＡを単離し、制限酵素を使って分析した。

Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ［／　Ｘｂａ　Ｉを使って酵母／Ｅ、：７リベクターからｃＤＮ Ａを切り出し、ゲル精製し、そして本明細書に記載のアスペルギルス発現ベクタ ーｐＨＤ４１４中に挿入した。

アスペルギルス発　ベクターの　製 ベクターｐＨ０４１４（図２３）ハブラスミドｐ７７５　（ＥＰ　２３８０２３ ｉ、ｍ記載）の誘導体である。このプラスミドに対比して、ｐＨ０４１４はプロ モーターとターミネータ−の闇に一連のユニーク制限部位を有する。

該プラスミドは、ターミネータ−の３′末端のところの長さ約２００ｂｐの断片 （望ましくないＲＥ部位を含む）を除去し、続いて同じく望ましくない部位を含 むプロモーターの５′末端のところの長さ約２５０１）ｐの断片を除去すること によって作製した。前記２００　ｂｐ領領域ＮａｒＩ　（ｐＵｃベクター中に位 置する）とＸｂａＩ（ターミネータ−のすぐ３′側）での開裂により除去し、続 いて生成末端をフレノウＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰを用いてフィルインし、 ゲル上でベクター断片を精製し、そしてベクター断片を再連結せしめた。このプ ラスミドをｐＨ０４１３と命名した。ｐＨ０４１３を５ｔｕｒ（プロモーターの ５′末端に位置する）とＰｖｕＩ［（ｐｕｃベクター中）で切断し、ゲル上で分 画し、再連結せしめてＩ）ＨＤ４１４を得た。図２３はプラスミドｐＨＤ４１４ の地図であり、ここでｒＡＭＧターミネータ−」はＡ、ニガー（Ａ、　ｎｉ又旺 ）グルコアミラーゼターミネータ−を示し、そしてｒＴＡＫＡプロモーター」は Ａ９オリザエ（Ａ、　ｏ■ｚａｅ　）タカアミラーゼプロモーターを示す。

アスペルギルス・オリザエ　たはアスペルギルス・ニガーの遺」と」幻赴ル １００−のＹＰＤ　（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、　１９８１）にＡ、オリザエ、Ａ、ニガーまたはそのａｒｇ９変異体の芽胞 を接種し、３７℃で振盪しながら約２日間インキュベートした。［ｌ１ｉｒａｃ ｌｏｔｈを通した濾過により菌糸を収集し、そして２００−の０．６Ｍ　ＭｇＳ Ｏ４で洗浄した。菌糸を１５−の１．２Ｍ　Ｍｇ５Ｏａ。

１０ｍＭ　ＮａＨ＊ＰＯｎ、　ｐＨ＝５．８中に懸濁した。この懸濁液を氷冷し 、１２０　ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｏ　２３４．バッチ１６８７を含有する緩衝液 ｌ−を加えた。５分後、１２＊／−のＢＳＡ　（Ｓｉｇｍａ　Ｉ（２５型）Ｉ− を加え、顕微鏡下で検査した試料中に多数のプロトプラストが目に見えるように なるまで穏やかに攪拌しながら３７℃にて１．５〜２．５時間連続インキュベー トした。

ａ＋１ｒａｃｌｏｔｈを通して懸濁液を濾過し、濾液を無菌試験管に移し、その 上に５ｒＩｄｌの０．６Ｍソルビトール、　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　 ｐＨ＝７．０を重層した。１００ｇにて１５分間遠心を行い、Ｍｇ５Ｏｎ　クッ ションの最上部からプロトプラストを収集した。２容の５ＴＣ（１，２Ｍソルビ トール。

１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ＝７．５．１０ｍＭ　ＣａＣ１ｔ　）をプ ロトプラスト懸濁液に添加し、この混合物を１０００　ｇにて５分間遠心した。

プロトブラストベレットを３−のＳＴＣ中に再懸濁し、再度ベレット化した。こ れを繰り返した。最後にプロトプラストを０．２〜１−のＳＴＣに再懸濁した。

１００μｌのプロトプラスト懸濁液を１０μｌのＳＴＣ中の５〜２５μｇの適当 なりＮＡと混合した。ａｒｇＢ株からのプロトプラストはｐｓａ１４３ＤＮＡ　 （Ａ、ニジュランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）　ａｒｇＢ遺伝子遺伝子担持 プラスミド台し、そしてａｒｇＢ”株からのプラスミドはｐ３ＳＲ２（Ａ。

ニジュランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）　ａｍｄｓ遺伝子遺伝子担持プラス ミド台した。混合物を室温で２５分間維持した。０．２−の６０％ＰＥＧ　４０ ００（ＢＤＨ２９５７６）、　１０［ｏＭ　ＣａＣ１ｚおよび１０ｍＭ　Ｔｒｊ ｓ−）ＩＣ１，ｐＨ＝７．５を加え、注意深く混合しく２回）、最後に０．８５ −の同溶液を加えて注意深く混合した。この混合物を室温で２５分子ＷＩｉｔき 、２５００　ｇにて１５分間遠心し、ベレットを２−の１，２Ｍソルビトールに 再懸濁した。もう１回沈降させた後、プロトプラストを適当なプレート上に塗抹 した。

ｐｓａ１４３により形質転換されたａｒｇＢ株からのプロトプラストは、それぞ れ炭素源および窒素源としてグルコースおよび尿素を含みそして浸透圧安定化の ため１．２Ｍソルビトールを含む最少プレート（ＣｏｖｅＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、　ＡｃｔａＪ１３　（１９６６）　５ｌ−５６）上に塗抹した。

ｐ３ＳＲ２により形質転換されたａｒｇＢ株からのプロトプラストは、窒素源と しての１．０Ｍショ糖、　ｐＨ＝７．０．　ｌ０ｍＭアセトアミドとバックグラ ウンド増殖を抑制するための２０ｍＭ　ＣｓＣｌ　とを含有する最少プレート（ ＣｏｖｅＢｊｏｃｈｅｍ、　Ｂｊｏｐｈｙｓ−Ａｃｔａｌ１３　（１９６６）　 ５ｌ−５６）上に塗抹した。３７℃にて４〜７日間インキュベートした後、芽胞 を取り、無菌水中に懸濁し、単一コロニーを得るために塗抹した。この手順を繰 り返し、２回目の再単離後の単一コロニーの芽胞を限定された形質転換体として 保存した。

この形質転換宿主を用いた高収量でのＲＧアーゼの生産２Ａ　オリザエ　での　 え　アクレータスＲＧアーゼの等量のｐｔ（Ｄ　ＲＧａｓｅとｐ３ｓＲ２（各々 約５μｇ）の混合物を使って、上述のＡ、ニジュランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎ ｓ）由来のａｎｄ　Ｓ遺伝子を含むｐ３ＳＲ２との同時形質転換により、ｐＨＤ 　ＲＧａｓｅを用いてＡ０オリザエＣンー」コｌ居−）　ＩＦＯ４１７７を形質 転換せしめる。唯一の窒素源としてアセトアミドを利用することができる形質転 換体を２回再単離する。

Ｙ　Ｐ　Ｄ　（Ｓｈｅｒｍａｎら、　＋９８１）上で３日間増殖させた後、培養 上清を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。ゲルをクーマシーブリリアントブルー Ｒで染色する。次の研究のために最良の形質転換体を選択し、２１のＫｉｅｌｅ ｒｍ酵槽中で４％大豆粉末上で増殖させ、増殖中にグルコースを供給する。醗酵 中は培養液を激しく攪拌する。遠心による細胞の除去、上清の限外濾過および凍 結乾燥により、培養プロスから組換え生成物を単離する。

Ａ、ニが一株　でのＲＧアーゼの 上述のＡ、ニジュランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）由来のａｍｄｓ遺伝子を含 むｐｓａｌ　４３との同時形質転換により、ｐＨＤ　ＲＧａｓｅを用いてＡ、ニ が−（Ｌユ江肛）　ａｒｇＢを形質転換せしめる。プロトプラストを等量の約５ μｇの各プラスミドと共にインキュベートする。アルギニン要求のレリーフによ り最少プレート（Ｃｏｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ１ １３　（１９６６）　５ｌ−５６）上で形質転換体を選択する。

分生子柄の２回の再単離後、形質転換体をＹ　Ｐ　Ｄ　（Ｓｈｅｒｍａｎら。

＋９８１）上で３０℃にて７日間培養する。培養上清を５Ｏ５−ＰＡＧＥにより 分析する。形質転換体の大部分がそれらの上清中にＲＧアーゼを生産する。

有意な量の付随の類似酵素を伴わないアスペルギルス種以外の形質転換宿主を使 ったＲＧアーゼの生産：Ｓ、セレビシェ−でのＲＧアーゼの ｐＨＤ　ＲＧａｓｅからＲＧアーゼ遺伝子を単離し、ｃＤＮＡがＧａｌ　ｌ−１ ０プロモーターとα因子ターミネータ−の転写調節下にくるように酵母発現ベク ターｐＹＨＤＳ中に導入する。この酵母発現プラスミドを用いてＬｉ基塩法より ＵＲＡ３変異体酵母株を形質転換せしめる。形質転換体をウラシル不含有最少寒 天プレート上で選択する。ウラシル不含有であるがガラクトースが捕捉されてい る（プロモーターを誘導するために）最少寒天プレートに形質転換体を複製塗抹 し、抗体の使用と酵素活性の測定によりＲＧアーゼの発現について試験する。

Ｅ、コリ　でのＲＧアーゼの ＨｉｎｄＩ［［／Ｘｂａ　ｒを使ってｐＨＤ　ＲＧａｓｅからＲＧアーゼｃＤＮ Ａを切り出す。この断片をフレノウＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰで処理して平 滑末端を有するＤＮＡ分子を作り、ゲル上で精製する。該断片をベクターｐＨ０ ２８２中のＰｖｕ　■部位（Ｄａｌｂｏｅｇｅら、　Ｇｅｎｅ、　７９．３２５ −３３２゜１９８９）にクローニングし、そして次の変異段階において標準的部 位特異的突然変異誘発技術を使って、ｐＨ０２８２中のＯｍｐＡシグナルペプチ ドに枠内において直接融合せしめる。

ＯｍｐＡ　−ＲＧアーゼキメラ遺伝子をＣ１ａ　ｒ　／ＢａｍＨＩ断片として発 現ベクターｐＨ０２３４中に移入し、Ｅ、コリＭＣ１０６１（Ｃａｓａｄａｂａ ｎおよびＣｏｈｅｎ、　、Ｌ　Ｍａｌ、　Ｂｉｏｌ、、　１３８．１７９−２０ ７．１９８０）中に導入して組換えクローンを生成せしめる。該発現プラスミド を含むＥ、コリＭＣｌ０６１を、温度、ｐＨ１通気速度および攪拌制御装置を装 備した１、５１のＭＢＲ反応器中で増殖させる。培地は４０■トリプシン／ｒｄ 　（Ｄｉｒｃｏ）と２０■酵母エキス／−を含んだ。Ａｓｚｓ　＝５０において 温度を２８℃から３７℃以上に上昇させることによりＲＧアーゼの生産を誘導す る。

細菌試料を５Ｏ３−ＰＡＧＥと活性測定により分析する。

本発明に係るＲＧアーゼは植物細胞分解酵素として利用することができ、従って ＧＢ　２］１５８２０Ａの３５頁に示される応用を包含する。

本発明に係るＲＧアーセをＰｅｃｔｉｎｅｘ　Ｕｌｔｒａ　ＳＰおよび／または アセチルエステラーゼと一緒に使うと、相乗効果を証明することができる。

実施例１ さ文±之逍斑 ペクチンはゲル化性質と安定化性質を有し、それらの性質はペクチンを食品産業 に有用にしている。それらは食品産業の廃棄材料、例えば柑橘類の皮、リンゴの しぼりかすまたはサトウダイコンの果肉から商業的に抽出される。

最も頻繁には酸（硫酸または硝酸）による抽出がペクチンの生産に使われる。２ 付近のｐＨと高められた温度において、植物材料からペクチンを抽出し、沈澱後 、アルコールで沈澱させる。

この酸抽出は幾つかの公魚を有する一水質汚染、腐食、植物細胞壁の崩壊による 濾過問題、所望のペクチンポリマーの部分的分解（重合の程度が商用ペクチンの 最重要パラメーターである）。よって、生来のペクチンポリマーを分解しない酵 素によるペクチンの抽出が非常に有利であることは明白である。

ペクチン生産用の産業リンゴしぼりかすを使って化学薬品またはＲＧアーゼのい ずれかにより抽出することができるペクチンの量を比較した。

ペクチンの化　″ しぼりかす１部に蒸留水１９部を加え、混合物を沸点まで加熱し、しぼりかすの 可溶性部分を溶液にする。２Ｎ　Ｈ，ＳＯ，を使ってｐＨ値を１．９に調整する 。この混合物を９０℃においてこのｐＨに２．５時間保持し、その後室温に冷却 する。混合物を濾過し、しぼりかす残渣を１０部の蒸留水で洗浄する。

濾液１部にメタノール６部を加える。３０分放置した後、混合物を濾過し、圧縮 する。アルコール不溶性物質（Ａ　Ｉ　Ｓ）をメタノール４部で洗浄し、濾過し 、再び圧縮する。

得られたＡＩＳを６０℃で１時間乾燥する。

このＡＩＳから、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍからの試験キット（ 注文番号２０７７４８　）を使ってデンプンの量を決定する。

しぼりかすからの乾燥物質から得られたＡＩＳの量（％）を測定しそしてＡＩＳ 中のデンプンの量を差し引くことにより、得られたペクチンの量を算呂する。

ペクチンの　的抽 しぼりかす１部にｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（０，０２９６Ｎ ａＮ　２含有）１９部を加える。この混合物を３０℃においてＡ、アクレータス （Ａ、　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）およびＡ、ジャポニカス（Ａ、　」ａ　ｏｎｉｃ ｕｓ）由来の本発明の精製ＲＧアーセの溶液で２０時間処理する。その後、混合 物を濾過し、しぼりかす残渣を１０部の蒸留水で洗浄する。

上述の方法でＡＩＳを得る。

■ 化学的抽出では１７．５％のペクチンが得られ、一方酵素的抽出では使用するＲ Ｇアーゼの種類と量に依存して９〜１１％のペクチンが得られた。

それらの結果は、ＲＧアーセが植物材料からのペクチンの酵素的抽出のための鍵 酵素の１っであることを証明する。また、上記から、化学的手段により全ての付 随の欠点を伴って抽出可能であるペクチンの５０〜６０％が、特にこの酵素を他 のペクチン放出活性を有する酵素、例えばβ−１，４−ガラクタナーゼと組み合 わせた時、環境上安全な方法で酵素的に抽出できることは明らかである。植物細 胞壁からペクチンを抽出するこの能力は、ＲＧアーゼが不透明ジュース、ネクタ ーおよびピユーレの製造（製品の濁度および所望の濃度の安定化）に重要である ことを証明する。

実施例２ Ｃｉｔｒｏｆｉｂｅｒ　ＤＦ５０　（Ｃｉｔｒｏｓｕｃｏ　Ｐａｕｌｉｓｔｏ　 Ｓ／Ａ、　Ｍａｔａｏ、　Ｂｒａｚｉｌ）　！まオレンジ果肉から得られる市販 の食物繊維製品である。それはオレンジからの果汁小胞膜と部分壁を含有する柑 橘類果汁加工からのＮＩＪ産物である。この製品はペクチンやヘミセルロースと ０ツだセルロース分解多糖と非セルロース分解多糖から成る。

この繊維の可溶性／不溶性固体の比を変えるためのこのＣｉ　ｔｒｏｆ　１ｂｅ ｒの液化が、より優れた応用価値をもたらし、且つ他の製品、例えζｆジュース 、ソフトドリンクおよび液体健康食品中にこの繊維を配合する新たな可能性を提 供するだろう。

図２４は、ＲＧアーセがこのＣ１ｒｔｏｆ　１ｂｅｒの液化にとって重要な活性 の１つであることを示す。ＲＧアーゼは単独で、使用したＲＧアーセに関して約 １！Ａから２５〜３０％に可溶性部分を増加させることカベできる。

成る量でＲＧアーセ（アスペルギルス・アクレータス）を含む液化用事酵素複合 体であるＰｅｃｔｉｎｅｘ■Ｕｌｔｒａ　５Ｐ−Ｌの官能価（ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｌ　１ｔｙ）は、ＲＧアーセ活性を高めることにより更に改善することができ たｏ　Ｐｅｃｔｉｎｅｘ＠　１Ｊｌｔｒａ　５Ｐ−Ｌ中のＲＧアーゼの量の倍増 により、可溶性固体の５〜１０％の増加（処理時間に関して）が得られた。

より高程度の液化の他に、加工時間の短縮も可能である。これもまた植物細胞壁 の液化に対するＲＧアーゼの重要性を証明する。

配列表 （１１一般情報： （ｉ）　出願人：ノボ　ノルディスク　Ａ／５（ｉｉ）　発明の名称コラムノガ ラクツロナーゼ、対応するＤＮＡ配列、ラムノガラクツロナーゼ含有酵素調製物 および該酵素調製物の用途 （ｉｉｉ）配列の数：１５ （ｊｖ）　住所： （Ａ）受信人：ノボ　ノルディスク　Ａ／Ｓ、特許部（Ｂ）通り二ノボ　アレ （Ｃ）市：パックスバード （Ｄ）　ＺＩＰ　：　ＤＫ−２８８０ （Ｖ）　コンピューター読み取り形式：（Ａ）媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コアビューター：　ＩＢＭ　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）オペレーテ ィングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−００５（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔ ｅｎｔｌ＋　Ｒｅ］ｅａｓｅ　＃１．０．　Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ｖｉ ｉｉ）代理人憤報： （Ａ）名称：バッハ、ニールズ他 （Ｂ）登録番号：　（ＥＰＯ）　ＧＡ　２４３０７（ｉｘ）　遠距離通信情報： （Ａ）電話：　＋４５４４４４８８８８（Ｂ）テレファックス：　＋４５４４４ ９３２５６（Ｃ）テレックス：　３７３０４ （２）配列番号１の情報・ （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１９アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：アスベルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）　配列：配列番号ｌ： Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　 Ｔｙｒ　Ｈ３ｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇａｙ　Ｔｈｒ（２）配列番号２の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２９アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ０ （ｉ　ｖ）　アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：アスベルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）　配列コ配列番号２： Ｓｅｒ　Ｘａａ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　 Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｘａａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒｌ　５　１０　１５ Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇａｙ　Ｐｒｏ　Ａｈａ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｈａ　 Ｘａａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ（２）配列番号３の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ。

（ｙｉ）　起源： （Ａ）　生物名：アスベルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａ ｃｕｌｅａｔｕｓ）（８）株名コＣＢＳ　１０１４３ （ｘｉ）　配列：配列番号３： Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ （２）配列番号４の情報コ （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：アスベルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）　配列：配列番号４： Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　 Ｌｙｓ（２）配列番号５の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さニアアミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 Ｃ３ｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス＝Ｎ。

（ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名ニアスペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ Ｃｘｉ）　配列コ配列番号５： Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　Ａｌａ　ｌｉｅ（２）配列番号６の 情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイポセティカル、Ｎ。

（ｊｖ）　アンチセンス＝Ｎ。

（ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：アスベルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）　配列：配列番号６： Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｘａａ　Ａｌａ　Ｘａａ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　 Ｘａａ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　Ｐｈｅ（２）配列番号７の情報。

（１）　配列の特徴： 特表十６−５０６８３１　（１５） （Ａ）配列の長さニアアミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ。

（ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：アスベルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名コＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）　配列：配列番号７： Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ（２）配列番号８の 情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１３アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス：Ｎ。

（ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：アスベルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）　配列：配列番号８： Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　 Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｈｅ（２）配列番号９の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）配列の長さ、５アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ０ （ｖｌ）起源： （Ａ）生物名、アスペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）　配列：配列番号９： Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ（２）配列番号１０の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・４アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイポセティカル、Ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ。

（ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：アスペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）　配列：配列番号１０： Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ｌｉｅ （２）配列番号１１の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ一７アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイボセティカル、Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス、Ｎｏ （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：アスペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）　配列：配列番号１１： Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ（２）配列番号１２ の情報： （ｊ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｊ　ｖ）　アンチセンス＝ＮＯ （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：アスベルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）　配列：配列番号１２： Ａｓｎ　Ｖａｌ　丁ｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　 Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ５１Ｏ （２）配列番号１３の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイポセティカル＝ＮＯ （ｉｖ）　アンチセンス＝Ｎ。

（ｖ）　フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名二Ａ、ジャボニカス （Ａ、ｊａｐｏｎｉｃｕｓ） （Ｂ）株名：　ＡＴＣＣ２０２３６ （ｘｉ）　配列：配列番号１３： Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｔｈｒｌ　５　１０　１５ Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｘａａ　Ｔｈｒ　 Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ（２）配列番号１４の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）配列の嬰コアミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列の種類：タンパク質 （山）ハイボセティヵル：Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ。

（ｖｉ）　起ｉｌ： （Ａ）生物名ごイルペックス・ラフテラス（Ｉｒｐｅｘ　１ａｃｔｅｕｓ） （Ｂ）株名：　ＡＴＣＣ２０１５７ （ｘｊ　）　配列：配列番号１４： Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇａｙ　 Ａｈａ　Ａｒｇ１５１゜ （２）配列番号１５の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝６アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）　１１１の数ニー重鎖 （「゛トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス＝Ｎ。

（ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名ニイルペックス・ラフテラス（Ｉｒｐｅｘ　］ａｃｔｅｕｓ） （Ｂ）株名：　ＡＴＣＣ２０１５７ （ｘｉ）配列：配列番号１５： Ａｈａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＡｌａＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、１２ ＦＩＧ、　１３ ＦＩＧ、　１６ ＦＩＧ、　１７ ＦＩＧ、　２０ ＦＩＧ、　２１ ＦＩＧ、　２２ ＦＩＧ、　２４ 国際調査報告 ＋ｌｌｍ−＋ｉ−＊＋　Ａｅｍｌ−ｅｍ　Ｎ−ＰＣＴ／ＤＫ　９２１００１４３ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：６６） （Ｃ１２Ｎ　９／２４ ＣＩ２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　９／２４ Ｃ１２Ｒ１：０７） （Ｃ１２Ｎ　９／２４ ＣＩ　２　Ｒ１：８６５） （ＣＩ２Ｎ　１５１５６ ＣＩ　２　Ｒ１：６６） （７２）発明者　ミツケルセン、セン　メーレルデンマーク国、デーゴー−２８ ２０ゲントフテ、スネルレバイ　２０ Ｉ （７２）発明者　クリステンセン、フレミング　マルクスイス国、ツェーハー− ４０５９バーゼル。

ピテルオヒスシュトラーセ　３３ （７２）発明者　ハルキエル、トルベンゾンマーク国、デーゴー−１９００フレ デリクスベルウセー、ポドロフスバイ　６ゲ−

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．次の部分アミノ酸配列： 【配列があります】（配列番号１） 【配列があります】（配列番号２） 【配列があります】（配列番号３） 【配列があります】（配列番号４） 【配列があります】（配列番号５） 【配列があります】（配列番号６） 【配列があります】（配列番号７） 【配列があります】（配列番号８） 【配列があります】（配列番号９） 【配列があります】（配列番号１０） 【配列があります】（配列番号１１） 【配列があります】（配列番号１２） 【配列があります】（配列番号１３） 【配列があります】（配列番号１４） 【配列があります】（配列番号１５） または上記配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より 好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する部分アミノ酸配列、好ましくはＮ 末端アミノ酸配列、を有するラムノガラクツロナーゼ（ＲＧアーゼ）。
2. ２．次の部分アミノ酸配列： 【配列があります】（配列番号１） 【配列があります】（配列番号２） 【配列があります】（配列番号３） 【配列があります】（配列番号４） 【配列があります】（配列番号５） 【配列があります】（配列番号６） 【配列があります】（配列番号７） 【配列があります】（配列番号８） 【配列があります】（配列番号９） 【配列があります】（配列番号１０） 【配列があります】（配列番号１１） 【配列があります】（配列番号１２） または上記配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より 好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する部分アミノ酸配列、好ましくはＮ 末端アミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＲＧアーゼ。
3. ３．次の部分アミノ酸配列： 【配列があります】（配列番号１３） を有する、請求項１に記載のＲＧアーゼ。
4. ４．次の部分アミノ酸配列： 【配列があります】（配列番号１４） 【配列があります】（配列番号１５） を有する、請求項１に記載のＲＧアーゼ。
5. ５．アスペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔ ｕｓ）ＣＢＳ　１０１．４３によって得られる、請求項１または２に記載のＲＧ アーゼ。
6. ６．Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ２０２３６によって 得られる、請求項１または３に記載のＲＧアーゼ。
7. ７．イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘｌａｃｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０１５ ７によって得られる、請求項１または４に記載のＲＧアーゼ。
8. ８．ＲＧアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはその ようなＲＧアーゼコード配列に対する実質的な配列相同性、好ましくは少なくと も７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％ の相同性を有するＤＮＡ配列を含んで成る短換えＤＮＡ配列。
9. ９．ａ）任意の適当なプラスミド中のＡ．アクレータス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕ ｓ）、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）またはイルペックス・ラク テウス（Ｉｒｐｅｘ　Ｉａｃｔｅｕｓ）ＲＧアーゼＤＮＡ挿入断片ｂ）ａ）のＤ ＮＡ挿入断片により構成される成熟ＲＧアーゼＤＮＡのコード領域にハイブリダ イズし、且つＲＧアーゼ活性を有するポリペプチドの構造遺伝子、並びに所望に よりプロモーター、シグナルもしくはリーダーペプチドおよび／または転写ター ミネーターを含んで成るＤＮＡ配列 ｃ）ａ）またはｂ）において定義されたＤＮＡ配列の誘導体、または ｄ）成熟ＲＧアーゼまたはそれのシグナルペプチドもしくはりーダーペプチドを コードし、且つａ）またはｂ）のＤＮＡ配列に関する遺伝暗号の意味の中で縮重 するＤＮＡ配列から選ばれたＤＮＡ配列を含んで成る、請求項８に記載の組換え ＤＮＡ配列。
10. １０．前記ＲＧアーゼ活性が、請求項１および２に記載の部分アミノ酸配列を用 いてアスペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕ ｓ）ＣＢＳ１０１．４３により生産可能であるＲＧアーゼに由来する、請求項８ 〜９に記載の組換えＤＮＡ配列。
11. １１．前記ＲＧアーゼ活性が、請求項１および３に記載の部分アミノ酸配列を用 いてアスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕ ｓ）ＡＴＣＣ２０２３６により生産可能であるＲＧアーゼに由来する、請求項８ 〜９に記載の組換えＤＮＡ配列。
12. １２．前記ＲＧアーゼ活性が、請求項１および４に記載の部分アミノ酸配列を用 いてイルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ　ｌａｃｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０１ ５７により生産可能であるＲＧアーゼに由来する、請求項８〜９に記載の組換え ＤＮＡ配列。
13. １３．請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ配列を含んで成るベ クター。
14. １４．プロモーターがアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒ ｙｚａｅ）タカアミラーゼプロモーターである、請求項１３に記載のベクター。
15. １５．請求項１３または１４に記載のベクターを含有する形質転換された宿主。
16. １６．前記形質転換された宿主がアスペルギルス株である、請求項１５に記載の 形質転換された宿主。
17. １７．前記形質転換された宿主がアスペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ ｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ 　ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　 ａｗａｍｏｒｉ）種に属する株である、請求項１６に記載の形質転換された宿主 。
18. １８．前記形質転換された宿主がそれの非形質転換条件下ではＲＧアーゼを生産 しないかまたは取るに足らない量でしかＲＧアーゼを生産しない微生物、好まし くはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＳ．セ レビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１６に記載の形質転換 された宿主。
19. １９．請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の形質転換された宿主を利用する ことによるＲＧアーゼの生産方法。
20. ２０．請求項１９に記載の方法により生産されるＲＧアーゼ。
21. ２１．請求項１〜７または２０に記載のＲＧアーゼを含んで成る酵素調製物であ って、それが別の植物細胞壁分解または改質剤、好ましくは植物細胞壁の分解ま たは改質に有用なペクチナーゼおよび／またはセルラーゼおよび／またはヘミセ ルラーゼを含有し、ＲＧアーゼが富化された、好ましくは少なくとも１．１の富 化係数を有する酵素調製物、またはＲＧアーゼが損失された、好ましくは最大０ ．９の損失係数を有するという事実により特徴づけられる酵素調製物。
22. ２２．前記別の細胞壁分解または改質剤が、アスペルギルス属に属する微生物、 好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、ア スペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓ）、 アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗｍｏｒｉ）またはア スペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）により生産 可能である、請求項２１に記載の酵素調製物。
23. ２３．植物細胞壁および／または植物細胞壁成分の分解または改質剤としての請 求項１〜７または２０に記載のＲＧアーゼの用途。
24. ２４．植物細胞壁および／または植物細胞壁成分の分解または改質剤としての請 求項２１〜２２に記載の酵素調製物の用途。