CN114317285B

CN114317285B - 一株米曲霉及其在高盐高氮发酵食品中的应用

Info

Publication number: CN114317285B
Application number: CN202111637611.3A
Authority: CN
Inventors: 张丽杰; 徐岩; 亢乐
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2041-12-29
Also published as: CN114317285A

Abstract

本发明公开了一株米曲霉及其在高盐高氮发酵食品中的应用，属于微生物发酵技术领域。本发明提供了一株米曲霉LBM 30007，已于2021年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23815，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明公开的发酵性能优良米曲霉菌株LBM 30007，较之米曲霉沪酿3.042，其制曲酸性蛋白酶、中性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶活力更高，酶系更加均衡，鲜味氨基酸谷氨酸、天冬氨酸含量更高，非常利于高盐高氮发酵食品原料利用率及产品品质的提升。

Description

一株米曲霉及其在高盐高氮发酵食品中的应用

技术领域

本发明公开了一株米曲霉及其在高盐高氮发酵食品中的应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

米曲霉因其特有的生理生化性质以及安全无毒性，被美国食品药品管理局(Foodand drug adiministration，FDA)及世界卫生组织列为食品级安全菌株(Generallyrecognizedas safe，GRAS)，是东亚传统酿造行业的优良菌种，被广泛应用于酱油、豆豉和鱼酱等高盐高氮食品的制曲过程中。其中，郫县豆瓣酱(Pixian broad bean paste)是一种生产于四川省成都市郫都区的辣味发酵豆酱，已有三百多年的历史，为国家地理标志性产品，其味道鲜辣醇厚，瓣粒香脆、化渣，回味悠长，被誉为“川菜之魂”。仅2018年郫县豆瓣实现工业总产值49.16亿元，是一类具有重要工业价值的传统酿造发酵酱。酱油是我国最重要的传统调味用品之一。2018年国内酱油产量为576万吨，行业规模在700亿元左右，在调味品市场中占据62.6％的市场份额，远超过其他类型调味品。

米曲霉既是传统高盐高氮发酵食品制曲的关键，也是发酵的基础。其性能对生产的原料利用率和发酵食品的风味起着决定性的作用。在生产过程中，米曲霉代谢生成蛋白酶、糖化酶、β-葡萄糖苷酶和氨肽酶等多种酶类，将原料中的蛋白、淀粉等物质降解成氨基酸、多肽和单糖，经过微生物的进一步转化和美拉德反应等，形成复杂的风味。目前，我国传统高盐高氮发酵食品制曲时多直接采用商品化曲精，即米曲霉沪酿3.042，该菌株具有生长速度快，繁殖力强，蛋白酶活力高，孢子多，对环境的适应性强，易于培养等优点。

但米曲霉沪酿3.042糖酶活性低，除此之外，在制曲过程中该菌产生的蛋白酶是以中性蛋白酶和碱性蛋白酶为主，酸性蛋白酶活力比较低，当发酵进行到中后期，酱醅pH降低至5.0左右时，酶催化活力减弱，蛋白质水解几乎停止，导致全氮利用率和氨基酸生成率降低。

并且，现有的米曲霉的孢子萌发时间久，亮氨酸氨肽酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶等水解酶酶活低，现有的米曲霉菌株的综合能力较差，导致酿造成品的品质低，米曲霉分泌酶的种类和数量是控制郫县豆瓣和酱油等高盐高氮发酵食品质量的重要因素，酶系优良菌株的选育迫在眉睫。

发明内容

针对上述现有问题，本发明提供了一株酿造性能优良的米曲霉(Aspergillusoryzae)LBM30007及其应用。米曲霉LBM 30007水解酶系均衡，酸性蛋白酶、中性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶等水解酶酶活高，且孢子萌发时间短，有利于提高郫县豆瓣和酱油原料利用率，改善口感和风味，增强成品品质。

本发明的技术目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一株米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23815，保藏日期为2021年11月17日。

所述米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007分离自日本传统酿造曲精，将其应用于高盐高氮发酵食品酿造具有安全性。上述米曲霉LBM 30007的选育方法为，分别以酸性、中性脱脂奶粉平板为筛选培养基，接种定量孢子，30℃恒温培养3d，挑选透明圈/菌落直径比大的菌株即为高产蛋白酶菌株。进一步的，筛选培养基是称取5g脱脂奶粉，加入200mL无菌水溶解，另取10g琼脂粉于另一500mL三角瓶中，加水300mL，分别115℃灭菌30min。使用时在超净工作台混合，分别调pH至3.0、7.2，用以筛选高产酸性蛋白酶、中性蛋白酶的曲霉菌株。

所述米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007在PDA培养基上菌落为黄绿色，丝绒状，具不明显辐射状沟纹，边缘不规则；电子显微镜观察，产生球型、粗糙分生孢子，分生孢子头呈辐射状，分生孢梗茎粗糙，顶囊为球型，表面可育，产孢结构单层。

该菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007经测序分析，其ITS序列如SEQ IDNO.1所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，结果显示与米曲霉的核酸序列相似度高达100％，结果显示该菌株为米曲霉，将其命名为：菌株米曲霉(Aspergillusoryzae)LBM 30007。

本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007。

本发明还提供了一种成曲，所述成曲是将上述米曲霉LBM30007加入制曲原料中发酵制备得到的。

在本发明的一种实施方式中，将所述米曲霉LBM30007以不低于1.0×10⁶个孢子/g接种量接种至制曲原料中。

在本发明的一种实施方式中，所述成曲为蚕豆曲或酱油曲。

本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为：高盐高氮发酵食品曲精。

本发明还提供了上述米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007，或上述微生物制剂在制备提高豆瓣品质或酱油品质的产品中的应用。

本发明还提供了一种酱油或豆瓣酱，所述酱油或豆瓣酱是采用上述成曲制备得到。

本发明还提供了上述米曲霉，或上述微生物制剂，或上述产品在制备郫县豆瓣中的应用。

本发明还提供了上述米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007，或上述微生物制剂，或上述产品在高盐高氮发酵食品或在其制曲阶段中的应用。

本发明公开的发酵性能优良米曲霉菌株LBM 30007，较之米曲霉沪酿3.042，其制曲酸性蛋白酶、中性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶活力更高，酶系更加均衡，鲜味氨基酸谷氨酸、天冬氨酸含量更高。

本发明还提供了一种郫县豆瓣酱蚕豆曲的制备方法，所述方法为：

(1)将蚕豆瓣用自来水冲洗3次除杂，95℃烫瓣20s，45℃浸泡20min，沥干水分。

(2)按干蚕豆瓣：小麦粉的比例为100：30进行拌粉。

(3)按6.75×10⁶个孢子/g干蚕豆瓣的比例，向步骤(2)拌粉后加入米曲霉分生孢子。并置于恒温恒湿条件下培养：0～20h，30℃、湿度90％恒温恒湿培养；20～72h，28℃、湿度80％恒温恒湿培养。

本发明还提供了一种米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007分生孢子的制备方法，所述米曲霉分生孢子的制备方法为：

用无菌接种环从本发明筛选得到的优质米曲霉LBM 30007的保存斜面刮取适量孢子并接种于PDA培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养3～5d，待产孢充分后，每个平板加入适量无菌水，用无菌涂布棒在菌丝表面轻轻刮拭，将孢子刮下。将收集到的孢子洗脱液摇匀，用Miracloth对洗脱液进行过滤，收集滤液，即获得孢子悬浮液。将孢子悬浮液摇匀后取适量用于血球计数，获得孢子悬液的浓度。

有益效果

(1)本发明提供了米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007，该菌株已于2021年11月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.23815，并将该米曲霉用于郫县豆瓣酱蚕豆曲制作过程提升水解酶活力。

(2)本发明从日本传统酿造曲精中筛选获得一株米曲霉LBM 30007，将其应用于郫县豆瓣酱和酱油等高盐高氮发酵食品具有安全性，实施规模不限于实验室，可应用于工厂实际生产过程中。

(3)由于生长环境长期驯化，米曲霉LBM 30007发酵制曲时具有生长速度快、孢子繁殖能力强、水解酶系丰富且水解酶活力高等特性，非常利于高盐高氮发酵食品原料利用率及产品品质的提升。

(4)本发明公开的发酵性能优良米曲霉菌株LBM 30007，较之米曲霉沪酿3.042，其制曲酸性蛋白酶、中性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶活力更高，酶系更加均衡，鲜味氨基酸谷氨酸、天冬氨酸含量更高。

生物材料保藏

一株米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007，分类学命名为米曲霉Aspergillusoryzae，已于2021年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23815，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1：米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007电子显微镜下形态图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进行具体描述。

下述实施例中所涉及的日本传统酿造曲精保藏于本课题组，所涉及的米曲霉沪酿3.042购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

(1)氨基酸含量的检测：

取4g样品加入16mL超纯水中，震荡混匀后，冰浴超声30min；将超声后的液体4℃，8000×g，离心5min；然后取1mL上清液加入等体积的10％磺基水杨酸，4℃静置4h以沉淀蛋白质，万转以上离心10min，取上清由日立氨基酸分析仪测定样品氨基酸含量。

(2)酸性蛋白酶酶活的检测：

测定方法参照GB/T 28715-2012。

将1g大曲在40℃，pH 3.0条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个酸性蛋白酶活力单位(U/g)。

(3)中性蛋白酶酶活的检测：

测定方法参照GB/T 28715-2012。

将1g大曲在40℃，pH 7.2条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个中性蛋白酶活力单位(U/g)。

(4)亮氨酸氨肽酶酶活的检测：

①标准曲线的绘制：将对硝基苯胺(pNA)105℃烘干至恒重，用无水乙醇配制成20μg/mL的标准溶液。用无水乙醇制备系列稀释液，至终浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18和20μg/mL。向试管中分别加入体积为0.4mL上述稀释液，各依次加入6.0mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液，2mL 0.4mol/L三氯乙酸，0.4mL 26mmol/L的L－亮氨酸－pNA乙醇溶液。充分混合后于40℃保温5min。利用可见分光光度计在405nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线并求出斜率K。其中，横坐标为对硝基苯胺浓度(μg/mL)，纵坐标表示净OD值，去离子水为对照。

②酶液的制备：准确称取3g曲料充分研磨，用蒸馏水定容至100mL，于40℃水浴浸提1h，6层纱布过滤后即为待测酶液。

③样品测定：

a、向5mL EP管中加入1.5mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，并加入100μL经适当稀释的酶液。40℃保温10min使温度恒定。

b、加入26mmol/L的亮氨酸对硝基苯胺乙醇溶液100μL，迅速混匀，继续水浴10min。

c、然后立即加入0.5mL 0.4mol/L三氯乙酸终止反应，继续置于水浴中保温5min。用可见分光光度计在405nm波长下测定吸光度。平行试验2次。

d、空白用灭活后的酶液。

④计算：

在40℃，pH 8.0条件下，每分钟水解亮氨酸对硝基苯胺生成1μg对硝基苯胺(pNA)所需的酶量定义为1个酶活力单位。

式中：

A—由样品测得吸光值，查得标准曲线得到相当的硝基苯胺浓度(μg/mL)；

V₀—样品稀释后总体积(mL)；

m—样品质量(g)。

(5)淀粉酶酶活的检测：

①酶液的制备：

精确称取曲料5g，用蒸馏水稀释10倍，在40℃水浴浸提1h，间断搅拌。之后于3500rpm离心10min，收集上清液作粗酶液待测。

②样品测定：

a.吸取5mL 0.8％淀粉溶液，40℃水浴10min。

b.吸取0.5mL酶液，40℃准确保温反应5min。空白用灭活酶液代替。

c.加入0.1mol/L H₂SO₄ 5mL以终止反应，混合均匀。

d.吸取0.5mL反应终止液于另一支试管中，加入5mL稀碘液混匀。用可见分光光度计在620nm波长下测定光密度。平行试验2次。

③计算：

酶活定义：1g大曲中的淀粉酶在40℃，每分钟水解1mg淀粉的量为一个酶活力。

式中：

R₀—对照吸光度；

R—测定吸光度；

V₀—样品稀释后总体积(mL)；

m—样品质量(g)。

(6)糖化酶酶活的检测：

①标准曲线的绘制如表1所示：

表1糖化酶活葡萄糖标准曲线

空白由蒸馏水代替葡萄糖。以OD值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。

②酶液的制备：精确称取曲料2g，充分研磨后倒入100mL烧杯中，加入pH 4.6醋酸缓冲液，40℃水浴浸提1h，间断搅拌。用4层纱布过滤后待测。

③样品测定：

a、向试管中加入0.5mL 1.0％(w/v)可溶性淀粉溶液，0.45mL 0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.8)，和0.05mL稀释到适当浓度的粗酶液。

b、40℃保温20min，立刻取出0.5mL反应液于预先吸有1.5mL DNS的试管中。

c、沸水浴15min，立即用流水冷却。

d、加入8mL蒸馏水，混匀后用可见分光光度计在550nm波长下测定吸光度。

e、空白用灭活后的酶液。平行试验2次。

④计算：在40℃，pH 4.6条件下，每分钟催化水解淀粉产生1mg葡萄糖作为—个酶活力单位。

式中：

A——由样品测得吸光值，查标准曲线得到相当的葡萄糖毫克数(μg)；

V₀——样品稀释后总体积(mL)；

m——样品质量(g)。

(7)纤维素酶酶活的检测：

①标准曲线的绘制如表2所示：

表2纤维素酶标准曲线

按照表2所示比例在10mL EP管中加入上述溶液并摇匀。沸水浴加热5min，立即以流水冷却，补加蒸馏水定容至10mL。以0号管为空白，用可见分光光度计于540nm波长下测定光密度。以光密度为纵坐标，以葡萄糖mg数为横坐标作图，即为标准曲线。

③样品测定：取1mL稀释到适当倍数(估计酶活力)的酶液于10mL EP管，加入1mL1％(w/v)CMC缓冲溶液，40℃水浴作用30min后取出。加入2mL DNS，摇匀。在沸水浴中加热5min，立即流水冷却，补加蒸馏水至10mL，摇匀。用可见分光光度计在540nm波长下测定其吸光度，并在标准曲线上找出试样管的光密度所对应的标准葡萄糖量。平行试验2次。空白样：以煮沸10min的酶液代替，按上法同样操作。

④计算：1g干重大曲在40℃，pH 4.8条件下，1h水解CMC产生相当于1mg葡萄糖的还原糖定义为1个酶活力单位。

式中：

A—由样品测得吸光值，查得葡萄糖标准曲线得到相当的葡萄糖毫克数(μg)；

V₀—样品稀释后总体积(mL)；

m—样品质量(g)。

(8)果胶酶酶活的检测：

①标准曲线的绘制：

精确配制0.1％D-半乳糖醛酸溶液为标准样，按表在各试管加样。

表3果胶酶活标准曲线

按照表3所示比例在10mL比色管中加入上述溶液并摇匀。沸水浴加热5min，冷却后加水至10mL。用可见分光光度讣在520nm波长下测定吸光度，以吸光度为横坐标，D-半乳糖醛酸为纵唯标绘制标准曲线。

②酶液的制备：取成曲10g充分研磨至细，用缓冲液再稀释10倍后于40℃水浴中浸提1h，期间间断搅拌。摇匀过滤后取滤液，用pH 4.4醋酸－醋酸钠缓冲液稀释3倍后使用。

③样品测定：取2支10mL，取2mL备用酶液加入2mL 0.4％的果胶溶于45℃水浴中精确反应30min。分别加入DNS试剂1.5mL于沸水浴中加热5min。冷却后加水至10mL。用可见分光光度计在520nm波长下测定吸光度。空白样：以煮沸10min的酶液代替，按上法同样操作。平行试验2次。

④计算：在pH 4.4，45℃水浴条件下，1min水解果胶质产生1μg半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶单位。

式中：

A——由样品测得吸光值，查得标准曲线得到相当的半乳糖醛酸微克数(μg)；

V₀——样品稀释后总体积(mL)；

m——样品质量(g)。

实施例1：米曲霉LBM 30007的分离与筛选

(1)样品处理

称取0.5g日本传统酿造曲精于装有99mL无菌水且含有无菌玻璃珠的无菌三角瓶中，在30℃，200rpm的摇床振荡分散，制备样品悬浮液。

(2)分离纯化

吸取适量样品悬浮液血球计数板计数，获得菌体浓度。梯度稀释悬浮液，选取合适浓度涂布200μL于分离培养基，室温下静置5min，使菌液浸入培养基，而后置于30℃恒温培养箱中培养2d。根据米曲霉菌落形态特征，挑取单菌落于纯化培养基，纯化3次后转接斜面培养基，4℃保存。

分离、纯化培养基(PDA培养基)：将200g洗净去皮的马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装后115℃，灭菌20分钟。

(3)高产蛋白酶菌株的筛选

制备待筛选菌株的孢子悬浮液：用无菌接种环从保存斜面刮取适量孢子并接种于PDA培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养3～5d，待产孢充分后，每个平板加入适量无菌水，用无菌涂布棒在菌丝表面轻轻刮拭，将孢子刮下。将收集到的孢子洗脱液摇匀，用Miracloth对洗脱液进行过滤，收集滤液，即获得孢子悬浮液，置于4℃保存。

高产蛋白酶菌株筛选：将孢子悬浮液摇匀后取适量用于血球计数，获得孢子悬液母液的浓度。母液梯度稀释至孢子浓度为10⁶个/mL，接种20μL于直径为150mm的筛选培养基，每平板8株，30℃恒温培养3d，挑选透明圈/菌落直径比大的菌株。筛选时设置3个平行。

筛选培养基：称取5g脱脂奶粉，加入200mL无菌水溶解，另取10g琼脂粉于另一500mL三角瓶中，加水300mL，分别115℃灭菌30min。使用时在超净工作台混合，分别调pH至3.0、7.2，用以筛选高产酸性蛋白酶、中性蛋白酶的曲霉菌株。

筛选得到一株高产酸性蛋白酶、中性蛋白酶的曲精分离株，且具有生长速度快、繁殖能力强、产孢时间短的特性。

实施例2：菌种的鉴定

(1)形态学鉴定

将实施例1筛选得到的高产酸性蛋白酶、中性蛋白酶的曲精分离株在PDA培养基上进行培养，得到的菌落为黄绿色，丝绒状，具不明显辐射状沟纹，边缘不规则；电子显微镜观察，产生球型、粗糙分生孢子，分生孢子头呈辐射状，分生孢梗茎粗糙，顶囊为球型，表面可育，产孢结构单层(如图1所示)。

分子生物学鉴定

试验方法：菌株培养——基因组提取——聚合酶链式反应(PCR)——琼脂糖凝胶电泳——测序——NCBI blast比对。

1)基因组提取：

①吸取分生孢子悬浮液1.5mL，加入灭菌的2mL离心管中，12000rpm，4℃，离心2min，去除上清。

②加入1mL灭菌超纯水，重悬，混匀。12000rpm，4℃，离心2min，去除上清。

③重复步骤②。

④加入200μL超纯水后重悬菌体，加入0.3g玻璃珠、150μL氯仿、150μL苯酚，用封口膜封口，上下轻轻颠倒混匀6次。

⑤将离心管对称放于珠磨仪中，机械破碎30s。

⑥取出离心管，加入600μL超纯水，上下颠倒混匀6次。12000rpm，4℃，离心20min。

⑦用200μL移液枪轻轻吸取上清300μL～400μL，勿吸取沉淀。

⑧加入2倍体积预冷的无水乙醇，4℃静置2h后12000rpm，4℃，离心30min。

⑨立即倒掉上清，离心管至于真空离心浓缩仪中离心浓缩，至完全无溶剂。

⑩加入30-50μL超纯水溶解，测定DNA浓度，于-20℃保存。

2)PCR反应时，引物EF3(5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3')与EF4(5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3)用来扩增18S rDNA序列(序列如SEQ ID NO.2所示)，引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')用来扩增全长ITS区域序列(序列如SEQ ID NO.1所示)。

以提取的DNA为模板，按照下表添加PCR体系。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，循环30次，最后72℃保温5分钟。

表4基因组DNA PCR体系

经测序分析，其ITS2序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，结果显示与米曲霉的核酸序列相似度高达100％，结果显示该菌株为米曲霉，将其命名为：菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)LBM 30007。

上述鉴定结果表明：该发明提供的菌株为米曲霉，将其命名为米曲霉LBM 30007。

实施例3：米曲霉LBM 30007应用于郫县豆瓣酱蚕豆曲制备

米曲霉LBM 30007制作郫县豆瓣酱蚕豆曲，将米曲霉3.042制曲作为对照组，具体步骤如下：

(2)按干蚕豆瓣：小麦粉的比例为100：30进行拌粉。

(3)制备米曲霉分生孢子

用无菌接种环从实施例1筛选得到的米曲霉LBM 30007的保存斜面、米曲霉3.042的保存斜面刮取适量孢子并接种于PDA培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养3～5d，即产孢充分，培养结束后向平板加入适量无菌水，分别用无菌涂布棒在菌丝表面轻轻刮拭，将孢子刮下，得到孢子洗脱液。

分别将收集到的孢子洗脱液摇匀，用Miracloth对洗脱液进行过滤，收集滤液，即获得孢子悬浮液。将孢子悬浮液摇匀后取适量用于血球计数，获得孢子悬液的浓度。

(4)按6.75×10⁶个孢子/g干蚕豆瓣的比例，向步骤(2)拌粉后的体系中加入上述米曲霉分生孢子，并将该体系置于恒温恒湿培养箱中培养：在0～20h，培养条件为30℃、湿度90％；在20h～72h，培养条件为28℃、湿度80％进行制曲。制曲结束后，成曲酶活及理化检测结果如表5～表6所示。

表5不同米曲霉菌株制作郫县豆瓣蚕豆曲水解酶活力

表6不同米曲霉菌株制作郫县豆瓣蚕豆曲氨基酸含量

由表5和表6可知，米曲霉菌株LBM 30007制作郫县豆瓣蚕豆曲时，较之米曲霉沪酿3.042，除纤维素酶活力略低于3.043外，其酸性蛋白酶、中性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶活力更高，酶系更加均衡，鲜味氨基酸谷氨酸、天冬氨酸含量更高，非常利于郫县豆瓣酱原料利用率及产品品质的提升。

实施例4：米曲霉LBM 30007应用于酱油曲制作

米曲霉LBM 30007制作酱油曲，将米曲霉3.042制曲作为对照组，具体步骤如下：

(1)大豆用自来水冲洗3次除杂，1.5倍温水浸泡6～8h，沥干水分后，120℃蒸煮13min，及时用手打散，并使其迅速降温；

(2)大豆降温至40～50℃左右时与面粉(面粉与大豆的比例为1:4)进行拌粉；

(3)制备米曲霉分生孢子

(4)按6.75×10⁶个孢子/g黄豆的比例，向步骤(2)拌粉后的体系中加入上述米曲霉分生孢子，并将该体系置于恒温恒湿培养箱中培养，条件如下：

0～16h的培养条件30℃、湿度95％；16h～36h培养条件为28℃、湿度95％；36h～40h的培养条件为28℃、湿度85％；40h～44h的培养条件为28℃、湿度75％，分别于16h、24h翻曲。制曲结束后，成曲酶活及理化检测结果如表7～表8所示：

表7不同米曲霉菌株制作酱油曲水解酶活力

表8不同米曲霉菌株制作酱油曲氨基酸含量

由表7和表8可知，米曲霉菌株LBM 30007制作酱油曲时，较之米曲霉沪酿3.042，其酸性蛋白酶、中性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶、淀粉酶、糖化酶活力更高，酶系更加均衡，鲜味氨基酸谷氨酸、天冬氨酸含量更高，非常利于酱油原料利用率及产品品质的提升。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株米曲霉及其在高盐高氮发酵食品中的应用

<130> BAA211671A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 575

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctgcggaag gatcattacc gagtgtaggg ttcctagcga gcccaacctc ccacccgtgt 60

ttactgtacc ttagttgctt cggcgggccc gccattcatg gccgccgggg gctctcagcc 120

ccgggcccgc gcccgccgga gacaccacga actctgtctg atctagtgaa gtctgagttg 180

attgtatcgc aatcagttaa aactttcaac aatggatctc ttggttccgg catcgatgaa 240

gaacgcagcg aaatgcgata actagtgtga attgcagaat tccgtgaatc atcgagtctt 300

tgaacgcaca ttgcgccccc tggtattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattgctg 360

cccatcaagc acggcttgtg tgttgggtcg tcgtcccctc tccggggggg acgggcccca 420

aaggcagcgg cggcaccgcg tccgatcctc gagcgtatgg ggctttgtca cccgctctgt 480

aggcccggcc ggcgcttgcc gaacgcaaat caatcttttt ccaggttgac ctcggatcag 540

gtagggatac ccgctgaact taagcatatc aataa 575

<210> 2

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtttgaccaa ctttccggcc ctggggggtc gttgccaacc ctcctgggcc agtccgaagg 60

cctcaccgag ccattcaatc ggtagtagcg acgggcggtg tgtacaaagg gcagggacgt 120

aatcggcacg agctgatgac tcgtgcctac taggcattcc tcgttgaaga gcaataattg 180

caatgctcta tccccagcac gacagggttt aacaagatta cccggacctc tcggccaagg 240

tgatgtactc gctggccctg tcagtgtagc gcgcgtgcgg cccagaacat ctaagggcat 300

cacagacctg ttattgccgc gcacttccat cggcttgagc cgatagtccc cctaagaagc 360

cagcggcccg caaacgcgga ccgggctatt taagggccga ggtctcgttc gttatcgcaa 420

ttaagcagac aaatcactcc accaactaag aacggccatg caccaccatc caaaagatca 480

agaaagagct ctcaatctgt caatccttat tttgtctgga cctggtgagt ttccccgtgt 540

tgagtcaaat taagccgcag gctccacgcc ttgtggtgcc cttccgtcaa tttctttaag 600

tttcagcctt gcgaccatac tccccccaga acccaaaaac tttgatttct cgtaaggtgc 660

cgagcgggtc atcatagaaa caccgcccga tccctagtcg gcatagttta tggttaagac 720

tacgacggta tctgatcgtc ttcgatcccc taactttcgt tccctgatta atgaaaacat 780

ccttggcgaa tgctttcgca gtagttagtc ttcagcaaat ccaagaattt cacctctgac 840

agctgaatac tgacgccccc gactatccct attaatcatt acggcggtcc tagaaaccaa 900

caaaatagaa ccgcacgtcc tattctatta ttccatgcta atgtattcga gcaaaggcct 960

gctttgaaca ctctaatttt ttcacagtaa aagtcctggt tccccccaca gccagtgaag 1020

gccatgaggt tccccagaag gaaaggtcca gccggaccag tactcgcggt gaggcggacc 1080

ggccagccag acccaaggtt caactacgag ctttttaact gcaacaactt taatatacgc 1140

tattggagct ggaattaccg cggctgctgg caccagactt gccctccaat tgttcctcgt 1200

taagggattt agattgtact cattccaatt acgagaccca aaagagcccc gtatcagtat 1260

ttattgtcac tacctccccg tgtcgggatt gggtaatttg cgcgcctgct gccttccttg 1320

gatgtggtag ccgtttctca ggctccctct ccggaatcga accctaattc cccgttaccc 1380

gttgccacca tggtaggcca ctatcctacc atcgaaagtt gatagggcag aaatttgaat 1440

gaaccatcgc cggcgcaagg ccatgcgatt cgttaagtta ttatgaatca c 1491

Claims

1.一株米曲霉（Aspergillus oryzae）LBM30007，其特征在于，所述米曲霉保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23815，保藏日期为2021年11月17日。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的米曲霉LBM30007。

3.一种成曲，其特征在于，所述成曲是将权利要求1所述米曲霉LBM30007加入制曲原料中发酵制备得到的。

4.如权利要求3所述的成曲，其特征在于，将所述米曲霉LBM30007以不低于1.0×10⁶个孢子/g接种量接种至制曲原料中。

5.如权利要求3或4所述的成曲，其特征在于，所述成曲为蚕豆曲或酱油曲。

6.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的米曲霉LBM30007。

7.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品为高盐高氮发酵食品曲精。

8.权利要求1所述的米曲霉LBM30007，或权利要求2所述的微生物制剂在制备提高豆瓣品质或酱油品质的产品中的应用。

9.一种酱油或豆瓣酱，其特征在于，采用权利要求3~5任一所述的成曲制备得到。

10.权利要求1所述的米曲霉LBM30007，或权利要求2所述的微生物制剂，或权利要求6或7任一所述的产品在制备高盐高氮酱油或豆瓣酱中的应用。