CN110257253B

CN110257253B - 一种地丝霉突变菌株及其应用

Info

Publication number: CN110257253B
Application number: CN201910186603.8A
Authority: CN
Inventors: 王能飞; 方龙
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2039-03-12
Also published as: JP2021511779A; US11584940B2; CN110257253A; WO2020181765A1; US20210363549A1; JP6952188B2

Abstract

本发明涉及一种地丝霉突变菌株及其应用，属于功能微生物的筛选与应用技术领域。所述突变菌株是通过诱变的方法获得的，能大幅度提高红色素的产量，已于2019年1月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019086。所述突变菌株可广泛应用于天然色素生产领域，有利于降低红色素的生产成本，应用前景广阔。

Description

一种地丝霉突变菌株及其应用

技术领域

本发明涉及功能微生物的筛选与应用技术领域，具体涉及一种地丝霉突变菌株及其在色素生产中的应用。

背景技术

色泽是食品的第一感官指标，影响人们对食物的选择，因此色素被广泛应用于食品加工业。根据来源不同食用色素可分为天然色素和合成色素两大类。许多合成色素已被证明对人体有害，被严格限制或限量添加到食品中，天然色素逐渐受到食品生产厂商的青睐。天然色素按来源主要分为动物色素、植物色素、微生物色素和矿物色素等。目前，天然色素占色素市场份额的31％，低于合成色素的40％，但天然色素的市场份额正在增长，市场潜力巨大 (Mapari AS S,Thrane U等)。

目前，各国批准使用的天然食用色素大多来源于动、植物原料。但动、植物来源的天然色素对原料依赖性强，规模不易扩大；且由于原料产地不同和气候条件的差异，导致不同批次产品差异较大(Spears K)，已经不能满足高速发展的食品工业的需求。近年来，致力于寻找可供代替的天然色素的研究增多，而这些研究大部分把目光投向了微生物色素，尤其是真菌色素。真菌色素种类繁多，色彩丰富，安全可靠，兼具营养和保健作用，而且真菌生长快、易培养、可简单地大规模工业生产，真菌色素渐渐成为一种获取天然色素的重要途径，如利用红曲霉生产的红曲红色素已在东亚各国被广泛使用；2006年丹麦一家公司用三孢布拉霉 (Blakesleatrispora)生产的β-类胡萝卜素获得了欧盟的食用批准(WissgottU,Bortlik K)。利用现代发酵技术生产真菌色素，条件易控制，自动化程度高，规模大，不仅可以克服上面的缺点，还可以节约宝贵的土地资源，降低生产成本。

虽然我国近年来对真菌资源的开发有了较大发展，在色素的利用方面也积累了一定的经验，但产色素真菌的菌种资源还相对匮乏，真正实现产业化的真菌色素种类非常少，远远不能满足现代食品工业对天然色素的生产需求。因此，目前急需开发新的产色素真菌菌种，并提高菌种的色素产量，从而有利于降低天然色素的生产成本，加速天然色素的推广使用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种地丝霉突变菌株及其应用。所述菌株是通过诱变的方法获得的，能大幅度提高红色素的产量，可广泛应用于红色素的生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一株地丝霉，其保藏编号为CCTCC NO:M2019086。

本发明首先从南极菲尔德斯半岛区域的土壤中筛选到一株高产红色素，同时还能产黄色素的真菌，经鉴定，该菌株属于地丝霉属。为了进一步提高其红色素的产量，本发明又对该菌种进行ARTP诱变，筛选获得一株红色素产量大幅提高的突变菌株，命名为Geomyces sp. wnf-18C（phy）。本发明申请人已于2019年1月24日将上述突变菌株Geomycessp.wnf-18C保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019086。

本发明还提供了所述地丝霉在发酵生产红色素中的应用。

本发明还提供了一种生产红色素的发酵方法，是以所述地丝霉为发酵菌株。

在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法包括摇瓶发酵和发酵罐发酵。

在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法中使用的培养基的组分及其含量分别为：葡萄糖10g/L，土豆200g/L。

在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法中所述摇瓶发酵的温度为15℃，发酵时间为12d。

在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法中所述发酵罐发酵的温度为15℃，发酵时间为12d。

本发明还提供了所述地丝霉在发酵生产黄色素中的应用。

本发明自南极土样中筛选获得一株新的地丝霉菌株ST2，其红色素产量显著高于Geomyces sp.wnf-15A。摇瓶发酵第12天时，地丝霉菌株ST2发酵上清液的OD₅₂₅值高达24.6，比对照组Geomyces sp.wnf-15A提高了26.1％。申请人为了进一步提高地丝霉菌ST2的红色素产量，通过ARTP诱变方法筛选获得一株红色素产量大幅提升的突变菌Geomyces sp.wnf-18C。该突变菌摇瓶发酵第12天时，发酵上清液的OD₅₂₅值高达33.6，比出发菌ST2提高了36.5％，比Geomyces sp.wnf-15A提高了72.3％，取得了意料不到的技术效果。

此外，突变菌株Geomyces sp.wnf-18C所产黄色素的质量得到进一步的提高。该突变菌产黄色素的色价为41，比出发菌株ST2提高了7.8％，取得了意料不到的技术效果。

本发明提供的突变菌株Geomyces sp.wnf-18C可广泛应用于天然色素生产领域，有利于降低红色素的生产成本，应用前景广阔。

具体实施方式

本发明公开了一种地丝霉突变菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

本发明实施例中选用的培养基配方如下：

PDA固体培养基：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1000mL；

PDA液体培养基：土豆200g、葡萄糖10g、水1000mL。

实施例1产红色素真菌的筛选与分离

1、样品来源：2018年第34次南极科考收集到的菲尔德斯半岛区域的土壤样品。

2、筛选方法：

(1)样品稀释液的制备

准确称取l.0g土壤样品，放入装有9ml无菌水的试管中，振荡使样品充分打散，制成1： 10的土壤溶液，然后从中吸取1ml土壤溶液加入9ml无菌水制成1:100的土壤溶液，以此方法类推，制备1：1000的土壤稀释溶液。

(2)菌株初筛

取100ul土壤稀释溶液均匀涂布于PDA培养基平板上，15℃培养3-4天，观察培养基上长出的菌落，挑出能产红色素的真菌菌株。

(3)菌株复筛

将初筛得到的能产生红色素的单菌落用接种针点到新的PDA培养基平板上培养，选择红色圈直径与菌落直径比值(HC值)较大的菌落。

(4)菌株的分离纯化

将复筛出来的菌株，接种到新的PDA培养基平板上划线，15℃培养3-4天，观察培养基上长出的菌落，重复划线3次以上，连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体说明菌株已经分离纯化。

经过上述步骤，申请人共筛选获得三株纯化的产红色素真菌菌株，分别命名为ST1，ST2， ST3。

(5)摇瓶发酵验证

向培养皿中加入7ml无菌水，用接种分别环刮取ST1，ST2，ST3的单菌落，转动培养皿，使平板上的菌体充分分布在无菌水中；用移液枪分别移取菌悬液加入PDA液体培养基中，接种量为10％，15℃、120r/min培养12天；将发酵液8000r/min离心5min，取上清液放于光程 1cm石英比色皿中，用分光光度计测定发酵液的OD₅₂₅。其中，ST2菌株发酵上清液的OD₅₂₅值最高，达到24.6。从而说明，申请人筛选到的三株真菌中ST2的红色素产量最高。

实施例2产红色素真菌的鉴定

取实施例1分离纯化得到的ST2菌株进行菌落形态和分子生物学方法鉴定，具体过程如下：

1、固体平板培养法

将ST2菌株接种到PDA培养基平板上，15℃培养10天，菌落直径8-12mm。

菌落形态：ST2菌株的菌落初期为白色，发育后期呈紫红色；形状为圆形，呈平面扩散，中心平伏；孢子梗较短，菌落表面呈短绒状或近于粉状，孢子在生长后期会呈现青灰色；菌落背面初期是无色，后变为淡黄色，最后变为紫红色。

2、分子生物学采用ITS基因鉴定

从上述PDA培养基平板上刮取收集ST2菌株的菌丝100mg，置于装有玻璃珠的2mL离心管中；加750μL CTAB提取液(2％w/v CTAB，1mol/L NaCl,0.1mol/L Tris，0.02mol/LEDTA)；将离心管置于Precellys 24匀质器离心研磨；将液体转移至1.5mL的离心管中，加1.5μL的巯基乙醇，65℃水浴2h；加750μL氯仿：异戊醇(24:1v/v)，颠倒混匀，室温10000g离心15min；收集上层液体，用TaKaRa DNA片段纯化试剂盒纯化；纯化的DNA于-20℃保存。用引物扩增ITS序列。PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。

将PCR扩增得到的ITS基因部分片段送上海桑尼生物科技有限公司测序。测序结果显示， ITS基因序列为SEQ ID NO:1。

经过NCBI BLAST比对分析，SEQ ID NO:1与来源于地丝霉Geomyces sp.wnf-15A的序列SEQ ID NO:2(GenBank:JN630629.1)相似性最高，达98.2％。从而说明，本发明筛选到的ST2菌株为地丝霉属(Geomyces sp.)菌株，与地丝霉Geomyces sp.wnf-15A相比，ST2菌株发生了多处核苷酸的突变。申请人将ST2菌株命名为地丝霉ST2(Geomyces sp.ST2)。

(1)Geomyces sp.ST2序列(SEQ ID NO:1)

gggg cctc cggt gatc gcct gggt tgcc gcag gcct cccg ggta acct acca ccctttgt ttat taca cttt gttg cttt ggca ggcc tgcc ctcg ggct gctg gctc cggc cggcgagc gctt gcca gagg acct aaac tctg tttg tcta tact gtct gagt acta tata atagttaa aact ttca acaa cgga tctc ttgg ttct ggca tcga tgaa gaac gcag cgaa atgcgata agta atgt gaat tgca gaat tcag tgaa tcat cgaa tctt tgaa cgca catt gcgccccc tggt attc cggg gggc atgc ctgt ccga gcgt catt acaa ccct caag ctca gcttggta ttgg gccc cgcc gacc cggc gggc ccta aagt cagt ggcg gtgc cgtc cggc tccgagcg tagt aatt cttc tcgc tctg gagg tccg gtcg tgtg ctcg ccag caac cccc aatttttt tcag gttg acct cgga tcag gtag ggat accc gctg aact taag cata tcaa taagcgga ggaa

(2)Geomyces sp.wnf-15A序列(SEQ ID NO:2)

atca ttac agta gtcg cctg ggtt gccg caag gcct cccg ggta acct acca ccctttgt ttat taca cttt gttg cttt ggca ggcc tgcc ctcg ggct gctg gctc cggc cggcgagc gctt gcca gagg acct aaac tctg tttg tcta tact gtct gagt acta tata atagttaa aact ttca acaa cgga tctc ttgg ttct ggca tcga tgaa gaac gcag cgaa atgcgata agta atgt gaat tgca gaat tcag tgaa tcat cgaa tctt tgaa cgca catt gcgccccc tggt attc cggg gggc atgc ctgt ccga gcgt catt acaa ccct caag ctca gcttggta ttgg gccc cgcc gacc cggc gggc ccta aagt cagt ggcg gtgc cgtc cggc tccgagcg tagt aatt cttc tcgc tctg gagg tccg gtcg tgtg ctcg ccag caac cccc aatttttt tcag gttg acct cgga tcag gtag ggat accc gctg aact taag cata tcaa taagcgga ggaa

实施例2地丝霉ST2菌株产红色素能力分析

1、摇瓶发酵

申请人将地丝霉ST2菌悬液加入PDA液体培养基中，接种量为10％，15℃、120r/min培养12天，每天固定时间观察并记录发酵液的颜色变化，从发酵液中取样，8000r/min离心5min，取上清液放于光程1cm石英比色皿中，用分光光度计测定发酵液的OD₅₂₅，同时以Geomyces sp.wnf-15A作为对照，具体结果详见表1。

观察结果显示，地丝霉ST2的发酵液从第4天开始变红，第5天时发酵液变成紫红色，随着时间的推移，发酵液的紫红颜色越来越深，且发酵液中的菌丝体浓度也越来越高。从而说明，在发酵前期(72h内)，地丝霉ST2主要是吸取大量养分，在胞内储存色素；从第4天开始把色素分泌至胞外，发酵液变红，且随着菌丝体浓度的增加，发酵液中的红色素浓度也随之升高。

表1地丝霉发酵上清液OD₅₂₅值变化情况

从表1的数据可以看出，本发明提供的地丝霉ST2菌株发酵72h内，其发酵上清液的OD₅₂₅值基本为0；到第4天时，OD₅₂₅值提高至2.4，且随着发酵时间的延长，OD₅₂₅值一直呈增长趋势；发酵第12天时，对照组Geomyces sp.wnf-15A发酵上清液的OD₅₂₅值达到19.5，而地丝霉ST2菌株发酵上清液的OD₅₂₅值高达24.6，比对照组提高了26.1％。从而说明，本发明提供的地丝霉ST2菌株能大量分泌红色素，其红色素产量显著高于对照组Geomyces sp.wnf-15A，取得了意料不到的技术效果。

2、发酵罐发酵

将地丝霉ST2菌悬液加入PDA液体培养基中，接种量为10％，15℃、120r/min培养3.5 天，得到种子液。

向150L发酵罐中加入PDA液体培养基，消泡剂，经过蒸汽灭菌，冷却到15℃后，按照10％的接种量，将种子液接入到发酵罐中，设置发酵参数为：15℃、110r/min、空气流速为50-100LPM。连续发酵培养12d，从发酵液中取样，8000r/min离心5min，取上清液放于光程1cm石英比色皿中，用分光光度计测定发酵上清液的OD₅₂₅值。同时以Geomyces sp.wnf-15A作为对照。

结果显示，在150L发酵罐中连续发酵12d后，对照组Geomyces sp.wnf-15A发酵上清液的OD₅₂₅值仅为16.7，而本发明提供的地丝霉ST2发酵上清液的OD₅₂₅值高达21.6，比对照组提高了29％。从而进一步说明，本发明提供的地丝霉ST2菌株的红色素产量显著高于对照组Geomyces sp.wnf-15A。

3、红色素提取与检测

将上述150L发酵罐发酵获得的发酵液装入离心瓶中，7500r/min离心15min；将上清液再用200目筛子过滤，以去除菌体，所得滤液即为色素粗液。

将色素粗液用DPH-722大孔吸附树脂吸附色素，达到饱和吸附后后装入层析柱中，以15 mL/min速率水洗两个柱体积后，然后以同样速度用70％乙醇洗脱色素，收集洗脱液。将收集到的色素洗脱液旋蒸除去乙醇，然后经真空冷冻干燥得到红色素固体粉末。

称取红色素固体粉末0.1g于100ml容量瓶中定容，颠倒溶解后取稀释液放于光程1cm石英比色皿中，用分光光度计测定其最大波长(525nm)处的吸光度A，计算色价。

色价是天然色素的主要质量指标之一，能从一定程度上反映色素含量的高低和产品着色能力的强弱。

其中A表示实测试样溶液的吸光度；c表示被测试样溶液的浓度，单位为克每毫升(g/ml)； 100为浓度换算系数。

结果显示，对照组Geomyces sp.wnf-15A产红色素的OD₅₂₅值为11.2，色价为112；而本发明提供的地丝霉ST2菌株产红色素的OD₅₂₅值为14.4；色价为144，比对照组提高了30.9％。从而说明，本发明提供的地丝霉ST2菌株所产的红色素质量更好，取得了意料不到的技术效果。

实施例3地丝霉ST2产黄色素能力分析

将实施例2所述色素粗液用DPH-722大孔吸附树脂吸附色素，达到饱和吸附后装入层析柱中，以15mL/min速率水洗两个柱体积后，然后以同样速度用70％乙醇洗脱色素，收集洗脱液。将收集到的色素洗脱液旋蒸除去乙醇，然后经真空冷冻干燥得到黄褐色固体粉末，即为黄色素。该粉末可以水溶，并可作为黄色着色剂使用。

称取黄褐色固体粉末0.1g于100ml容量瓶中定容，颠倒溶解后取稀释液放于光程1cm石英比色皿中，用分光光度计测定色素稀释液的OD₄₄₀值。

色价的测定方法为：精确称量黄色素固体样品0.1g，定容于100mL容量瓶中，用光程1cm 的比色皿测定其最大波长(440nm)处的吸光度A，计算色价。

结果显示，本发明提供的地丝霉ST2菌株产黄色素的OD₄₄₀值为3.8，色价为38。

实施例4ARTP等离子诱变筛选

等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。与传统诱变方法相比，采用ARTP能够有效造成DNA多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株。

等离子体诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为诱变所需设备简单，操作方便，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它目前是一种常用的诱变选育方法。

申请人进一步以地丝霉ST2(Geomyces sp.ST2)为出发菌株，通过ARTP等离子诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其红色素的产量。

1、诱变方法

利用75％的酒精将操作台内部擦干净，打开紫外灯照射杀菌20min，诱变操作前通入氦气(He)进行机器预热。

取新鲜培养皿上的单菌落，用6-10ml无菌水刮洗单菌落，将菌悬液自三层滤纸方向移入漏斗中，过滤，用50ml三角瓶收集滤液，摇匀，用血球计数板计算1ml中孢子数量。稀释菌悬液中孢子数量至10⁵数量级。

设置参数：该诱变装置采用高纯氦气(He)作为产生等离子体的出发气体，电源功率 100W，射频功率13W，工作距离4mm，等离子体的温度28℃，气流量10SLM。在气流量、辐射距离确定的情况下，ARTP对样品的作用效果取决于照射时间的长短。分别设定了孢子悬浮液诱变的暴露时间为10s、20s、30s、40s、50s和60s。在经过不同的暴露时间照射后，分别测定孢子数量，计算致死率，具体结果详见表2。

表2不同暴露时间对孢子致死率的影响

暴露时间

10s

20s

30s

40s

50s

60s

致死率

35.7％

67.8％

92.2％

96.3％

98.1％

99.2％

综上，申请人选取40s作为孢子悬浮液诱变的暴露时间。

2、诱变结果

分别取出100μl诱变处理后的孢子悬液于PDA培养基平板中，涂布均匀，15℃培养至菌落微微变红；挑取变红的单菌落共102个，分别接入PDA液体培养基中，15℃，120r/min，摇瓶条件下培养12d，分别检测各株菌发酵上清液的OD₅₂₅值，同时以出发菌地丝霉ST2作为对照组。

结果显示，第一轮诱变筛选获得的102株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液OD₅₂₅值高于出发菌；其中，91株突变菌的OD₅₂₅的值与出发菌基本相当，其余11株突变菌发酵上清液OD₅₂₅值甚至比出发菌普遍降低了5-7％。

申请人按照上述方法继续进行了8轮诱变筛选，最终获得1株发酵上清液OD₅₂₅值显著高于出发菌的突变菌株，命名为Geomyces sp.wnf-18C。

该突变菌株在PDA液体培养基中15℃，120r/min摇瓶条件下培养12d后，其发酵上清液 OD₅₂₅值高达33.6，比出发菌提高了36.5％，比Geomyces sp.wnf-15A提高了72.3％。从而说明突变菌株Geomyces sp.wnf-18C的红色素产量得到大幅提高，取得了意料不到的技术效果。

此外，申请人参照实施例3所述方法收集突变菌Geomyces sp.wnf-18C发酵上清液中的黄色素，制成黄色素固体粉末并测定其色价。结果显示，该突变菌产黄色素的色价为41，比出发菌株提高了7.8％。从而说明，突变菌株Geomyces sp.wnf-18C所产黄色素的质量得到进一步的提高，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2019年1月24日将突变菌株Geomyces sp.wnf-18C保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019086。

序列表

<110> 方龙

<120> 一种地丝霉突变菌株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 544

<212> DNA

<213> Geomyces sp.ST2

<400> 1

ggggcctccg gtgatcgcct gggttgccgc aggcctcccg ggtaacctac caccctttgt 60

ttattacact ttgttgcttt ggcaggcctg ccctcgggct gctggctccg gccggcgagc 120

gcttgccaga ggacctaaac tctgtttgtc tatactgtct gagtactata taatagttaa 180

aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata 240

agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccccc 300

tggtattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattacaa ccctcaagct cagcttggta 360

ttgggccccg ccgacccggc gggccctaaa gtcagtggcg gtgccgtccg gctccgagcg 420

tagtaattct tctcgctctg gaggtccggt cgtgtgctcg ccagcaaccc ccaatttttt 480

tcaggttgac ctcggatcag gtagggatac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga 540

ggaa 544

<210> 2

<211> 544

<212> DNA

<213> Geomyces sp.wnf-15A

<400> 2

atcattacag tagtcgcctg ggttgccgca aggcctcccg ggtaacctac caccctttgt 60

ttattacact ttgttgcttt ggcaggcctg ccctcgggct gctggctccg gccggcgagc 120

gcttgccaga ggacctaaac tctgtttgtc tatactgtct gagtactata taatagttaa 180

aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata 240

agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccccc 300

tggtattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattacaa ccctcaagct cagcttggta 360

ttgggccccg ccgacccggc gggccctaaa gtcagtggcg gtgccgtccg gctccgagcg 420

tagtaattct tctcgctctg gaggtccggt cgtgtgctcg ccagcaaccc ccaatttttt 480

tcaggttgac ctcggatcag gtagggatac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga 540

ggaa 544

Claims

1.一种地丝霉，其拉丁文名称为Geomyces sp，其特征在于所述的地丝霉能向胞外分泌红色素和黄色素，所述地丝霉的保藏编号为CCTCC NO:M2019086。

2.权利要求1所述的地丝霉在发酵生产红色素中的应用。

3.一种生产红色素的发酵方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1所述的地丝霉为发酵菌株。

4.如权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括摇瓶发酵和发酵罐发酵。

5.如权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法中使用的培养基的组分及其含量分别为：葡萄糖10g/L，土豆200g/L。

6.如权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法中发酵温度为15℃，发酵时间为12d。

7.权利要求1所述的地丝霉在发酵生产黄色素中的应用。