CN114196557B - 一种蓝莓天然酵母Bob1及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种蓝莓天然酵母Bob1及其筛选方法和应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一种蓝莓天然酵母Bob1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23757。还提供了该蓝莓天然酵母Bob1的筛选方法和应用。本发明蓝莓天然酵母Bob1能够产生酒精，所酿造的蓝莓果酒酸甜适中，香气馥郁，品质优良，酒精度为3.2％，具有典型的蓝莓风味，酸甜可口，适宜饮用，为蓝莓酒提供一种蓝莓天然酵母株。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种蓝莓天然酵母Bob1及其筛选方法和应用。
背景技术
蓝莓因为其营养物质丰富，口感酸甜，外形小巧独特，主要作为新鲜水果食用。近年来，将蓝莓加工为果脯、果酱也同样深受广大人民的喜爱。但是由于蓝莓果皮较薄，没有坚硬果皮包裹，极不易储存。虽然蓝莓的优点有很多，但是由于每年蓝莓的上市时间集中，产量大，且蓝莓的贮运性很差，导致每年蓝莓由于无法及时食用完而造成了很大的浪费。这不仅使我国蓝莓果业的发展受影响严重，同时也造成了巨大的经济损失。要想很好地解决这个问题，传统的水果消费观念就必须被改变，而蓝莓酒正是蓝莓理想的消费转换方式之一。为避免果酒风味的同质化，生产独具特色的蓝莓果酒，筛选适合蓝莓果酒的天然酵母显得尤为重要。同时，由天然酵母发酵蓝莓可产生酒精。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种蓝莓天然酵母Bob1 及其筛选方法和应用。本发明蓝莓天然酵母Bob1能够产生酒精，所酿造的蓝莓果酒酸甜适中，香气馥郁，品质优良，酒精度为3.2％，pH为3.12，残糖量为13.06g/L，总酸为3.07g/L。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种蓝莓天然酵母Bob1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.23757，分类命名：Pichia bruneiensis，保藏日期为：2021 年11月8日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
还提供了一种蓝莓天然酵母Bob1的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取新鲜蓝莓无菌破碎处理后密闭，置于生化培养箱中培养，待有CO2产生后，取发酵液用无菌水稀释，得到稀释液。蓝莓成熟饱满，每颗果实都经过认真筛选，清洗，但不能过度清洗。
(2)将上述步骤(1)得到的稀释液涂布于含有氯霉素的沙保罗下层培养基中，在通风条件下恒温培养后，置于沙保罗上层培养基中，在密闭环境中避光倒置培养1-3h；观察培养基颜色的变化，TTC试剂与酒精会发生颜色变化生成红色的化合物；TTC下层培养基中添加氯霉素，以抑制杂菌生长；避光倒置培养，以观察显色状况；产酒精能力强的菌株，在培养基上显出的颜色越深。同时，这一过程可初步筛选出优良、发酵性能较好的菌株。
(3)挑取显深红色的菌株，接种于酵母固体培养基上，在通风条件下恒温培养，选取具有典型酵母特征的单菌落，进行3-4次平板划线，保证尽量获得纯菌，得到单个菌落接种至酵母固体培养基中培养，稀释后接种至鉴别培养基上纯化培养，挑取纯菌株，并对纯菌株进行镜检。
(4)采用试剂盒提取法提取上述步骤(3)得到的纯菌株的基因组DNA，以ITS1和ITS4为引物，PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，得到基因序列；以引物ITS1和ITS4扩增其26SrDNA 的D1/D2区域。
(5)进行生长性能分析和理化性质分析，筛选得到蓝莓天然酵母Bob1。
所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(1)中培养的条件为：培养温度28-30℃，培养时间1-3d，所述发酵液与无菌水的稀释比例为1-2:1-2，优选1:1。保证部分果实表面暴露在空气中。
所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中恒温培养条件为：培养温度28-30℃，培养时间24-28h，所述稀释液的浓度为10-4-10-6。保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。
所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(3)中恒温培养条件为：培养温度28-30℃，培养时间1-3d，所述稀释后菌种的浓度为10-4-10-6。保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。
所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(3)中镜检的具体操作为：将挑取的纯菌种经草酸铵结晶紫染色，再置于显微镜下观察细胞形状，大小及繁殖方式。
所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(4)中PCR扩增的体系为：总体积20μL，顺序加入PrimestarMax 10μL，引物ITS1和ITS4各0.5μL，基因组DNA0.3μL，无菌水8.7μL。
所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(4)中PCR扩增的过程为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火20s，72℃延伸30s，共31次循环，最后10℃充分延伸5min。
一种蓝莓果酒，其特征在于所述蓝莓果酒由如权利要求1所述的蓝莓天然酵母Bob1发酵酿造得到的。
所述的蓝莓天然酵母Bob1在蓝莓果酒发酵中的应用。
本发明蓝莓天然酵母Bob1是从江苏省连云港市赣榆区黑林镇莱克西蓝莓上分离的天然酵母，与所认知的Pichia bruneiensis相似度最高，同源性99.88％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对酵母的形态、生理生化特征等方面进行研究，筛选出一种能产酒精的蓝莓天然酵母。由该酵母菌所得的蓝莓果酒产酒精，酸甜适中，香气馥郁，品质优良，酒精度为3.2％，pH为3.12，残糖量为13.06g/L，总酸为3.07g/L。发酵得到的蓝莓酒含有丰富的Vc、花青素等营养物质，具有典型的蓝莓风味，酸甜可口，适宜饮用，为蓝莓产业提供一种加工方法延长蓝莓的供应周期，增加其经济效益。
附图说明
图1为蓝莓天然酵母Bob1的菌落形态图，其中，A为Bob1在YPD培养基菌落形态，B为Bob1在WL培养基菌落形态，C为Bob1的细胞形态(1000x)；
图2为蓝莓天然酵母Bob1的PCR扩增产物电泳图；
图3为蓝莓天然酵母Bob1的26S rDNA D1/D2结构域序列的系统发育树；
图4为蓝莓天然酵母Bob1的生长曲线。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
本发明筛选出的天然酵母的方法，包括以下步骤：
(1)取连云港本土新鲜的蓝莓，略微除去污渍泥土等杂质。将蓝莓在无菌条件下破碎处理，称取100g分别装入500mL无菌三角瓶中，用透气封口膜封住瓶口，放入28℃生化培养箱中培养2d。待观察到有气泡(CO2)产生后，取出发酵液用无菌水稀释，得到稀释液。
(2)将步骤1所述稀释液均匀涂布于含有氯霉素的TTC下层培养基中，在28℃恒温培养箱中生长24h后，倒入TTC上层培养基，避光倒置培养2h。观察培养基颜色的变化，TTC试剂与酒精会发生颜色变化生成红色的化合物。产酒精能力强的菌株，在培养基上显出的颜色越深。同时，这一过程可初步筛选出优良、发酵性能较好的菌株。
(3)挑取步骤2所得显深红色的菌株划线接种到YPD固体培养基上，在28℃的恒温培养箱中生长2d，观察菌落表观特性，选取出具有典型酵母特征的单菌落，进行3次平板化线，得到单个菌落接种到YPD液体培养基中培养。根据菌液的浓度对菌液做出稀释，将菌液划线接种到WL培养基上对酵母做进一步纯化(根据分离效果纯3次)，观察酵母的生长状态。同时挑取YPD固体平板上纯的单克隆菌株，置于显微镜下观察细胞形态。
(4)采用试剂盒提取法提取纯菌株的基因组DNA。以引物ITS1和ITS4扩增其26SrDNA 的D1/D2区域。取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送武汉天一生物工程股份有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST同源序列搜索比对。真菌通用引物 ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
(5)对分离的酵母菌进行生长性能分析、理化性质分析，筛选出所述酿酒用的酵母菌株。
在步骤(1)中，蓝莓成熟饱满，每颗果实都经过认真筛选，清洗，但不能过度清洗。果实破碎过程要在超净工作台中进行，避免实验结果受到杂菌的污染。果实与无菌水的质量比是1:1，保证部分果实表面暴露在空气中。
步骤(2)中，稀释过程应稀释至10-4-10-6，保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。培养温度为28℃，通风条件下进行。TTC下层培养基中添加适量氯霉素，以抑制杂菌生长。倒入TTC上层培养基后，避光倒置培养，以观察显色状况。
步骤(3)中，稀释过程应稀释至10-4-10-6，保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。培养温度为28℃，通风条件下进行。运用平板划线法对菌株进行纯化，次数达3次，保证尽量获得纯菌。菌株镜检前需将挑取的菌株经草酸铵结晶紫简单染色，再置于显微镜下观察细胞形态。结果如图1所示，菌株Bob1在YPD培养基上呈白色、圆润、凸起、易挑起，在WL培养基上显黄色，在显微镜下观察菌株Bob1呈椭圆形，大小为5-6μm，繁殖方式为出芽繁殖。
所述步骤(4)中，PCR反应体系总体积为20μL。每个PCR管中加入顺序及体积分别为：Prime star Max 10μL，引物ITS1和ITS4各0.5μL，基因组DNA0.3μL，无菌水8.7μL。
所述步骤(4)中，PCR循环为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火20s，72℃延伸30s，共31次循环，最后10℃充分延伸5min。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，得到约600bp的片段，清晰可见，无杂带，可用于26S rDNA ITS测序。将测序结果用BLAST进行序列同源性比对，用相邻法的系统发育方法构建酵母菌Bob1 的系统发育树，结果如图3所示，菌株Bob1与两株毕赤酵母聚在一起，根据比对结果将该菌株鉴定为Pichia bruneiensis，其相似度为99.88％。
步骤(5)中，生长性能分析通过全自动生长曲线分析仪测定，菌株以106CFU/mL接种于YPD液体培养基中，在28℃的条件下生长24h，以YPD液体培养基作为空白对照，在600nm处测定菌悬液OD值，平行重复3次，测定出菌株的生长曲线。结果如图4所示，菌株Bob1生长性能良好。理化性质分析主要包括：酒精度、pH值、残糖量、和总酸。
实施例2：
蓝莓酒酿造：
(1)蓝莓采摘后，选择成熟、香气浓郁的蓝莓作为原料；
(2)在清洗机中用喷淋的方式进行清洗；
(3)将蓝莓去梗破碎，添加50mg/L果汁的PMS杀菌，然后经压榨过滤得到蓝莓汁，添加糖调节蓝莓发酵后的酒精度；
(4)用酒石酸调节蓝莓汁pH值为3.2；
(5)蓝莓汁倒入发酵罐，并在此发酵罐中充入CO2，然后接入Bob1酵母，控温环境条件下发酵，得到蓝莓酒原液，并对整个发酵过程中的酒精度、残糖量、pH值、进行监控；
(6)蓝莓酒原液在4℃温度下进行12d陈酿；
(7)蓝莓酒理化性质分析包括：酒精度、残糖量、pH和总酸。
对比例1：
蓝莓酒酿造：
(1)蓝莓采摘后，选择成熟、香气浓郁的蓝莓作为原料；
(2)在清洗机中用喷淋的方式进行清洗；
(3)将蓝莓去梗破碎，添加50mg/L果汁的PMS杀菌，然后经压榨过滤得到蓝莓汁，添加糖调节蓝莓发酵后的酒精度；
(4)用酒石酸调节蓝莓汁pH值为3.2；
(5)蓝莓汁倒入发酵罐，并在此发酵罐中充入CO2，然后接入RB2酵母，控温环境条件下发酵，得到蓝莓酒原液，并对整个发酵过程中的酒精度、残糖量、pH值进行监控；
(6)蓝莓酒原液在4℃温度下进行12d陈酿；
(7)蓝莓酒理化性质分析包括：酒精度、残糖量、pH和总酸。
实施案例2采用Bob1单独发酵蓝莓果酒，对比例1采用商业酵母RB2单独发酵蓝莓果酒。在其他发酵条件相同的情况下，果酒的理化指标见表1。
表1蓝莓果酒主要参数对比
由表1可知，本发明方法制备得到的蓝莓酒酒精度较低、总酸含量少，但具有典型的蓝莓风味，酸甜可口，适宜饮用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明保护的内容主要包括从蓝莓上筛选的酵母Bob1。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 常州大学
<120> 一种蓝莓天然酵母Bob1及其筛选方法和应用
<130> CP121011068C
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物ITS1
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物ITS4
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 869
<212> DNA
<213> 蓝莓天然酵母Bob1
<400> 3
agagctaata catgcgcaaa gccccgactc cgggaggggt gtatttatta gataaaaaat 60
caatgccctc gggccttttg atgattcata ataacttttc gaagcccatg gccttgcgcc 120
ggggctggtt cattcaaatt tctgccctat caactttcga tggtaggata gaggcctacc 180
atggttttca cgggtaacgg ggaataaggg ttcgattccg gagagggagc ctgagaaacg 240
gctaccacat ccaaggaagg cagcaggcgc gcaaattacc caatcctgac acagggaggt 300
agtgacaata tataacgata cagggccatt ggtcttgtaa ttggaatgag tacaatgtaa 360
ataccttaac gaggaacaat tggagggcaa gtctggtgcc agcagccgcg gtaattccag 420
ctccaatagc gtatattaaa gttgttgcag ttaaaaagct cgtagttgaa ctttgggcct 480
gggcgggcgg tctacctatg gtttgtactg ctgcggccgg gtctttcctt ctggctaccc 540
ctccggggaa ccaggacgat tactttgagg aaattagagt gttcaaagca ggcctttgct 600
cggatatatt agcatggaat aatagaatag gacgcatggt tctattttgt tggtttctag 660
gaccatcgta atgattaata gggacggtcg ggggcatcag tattcagtcg tcagaggtga 720
aattcttgga ttgactgaag actaactact gcgaaagcat ttgccaagga cgttttcatt 780
aatcaagaac gaaagttagg ggatcgaaga tgatcagata ccgtcgtagt cttaaccata 840
aactatgccg actagagatc gggcgggca 869
Claims (2)
1.一种蓝莓天然酵母Bob1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 23757。
2.如权利要求1所述的蓝莓天然酵母Bob1在蓝莓果酒发酵中的应用。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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-
2021
- 2021-11-18 CN CN202111370897.3A patent/CN114196557B/zh active Active
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