CN112143659A - 一株用于果酒全过程绿色生产的克鲁维毕赤酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，其于2020年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19722，命名为Pichia kluyveri WTB20042302。该菌株可利用柠檬酸和酒石酸，且对果酒中的柠檬酸、乳酸、甲酸、乙酸和琥珀酸都有降解能力，对柠檬酸的降解能力尤为显著；能有效提高总酚、总黄酮和花青素等活性物含量，提升果酒抗氧化水平。此外，该菌株还有优于现有已知生防菌株的生防效果，对灰葡萄孢菌抑制作用显著。因而该菌株可应用于水果采后贮藏保鲜或果酒降酸发酵，是一株可应用于果酒制备工艺全程的优选菌株。

Description

一株用于果酒全过程绿色生产的克鲁维毕赤酵母及其应用

技术领域

本发明涉及一株功能酵母菌，尤其涉及一株用于果酒全过程绿色生产的克鲁维毕赤酵母及其应用。

背景技术

果酒是酵母菌利用水果本身的糖分发酵成为酒精的酒，含有水果的特定风味和营养成分，是人类最早学会酿造的酒。可酿造果酒的水果五花八门，以猕猴桃、杨梅、橙、葡萄、蓝莓、红枣、樱桃、荔枝、蜜桃、柿子、草莓等较为理想。在果酒中，最出名的要数葡萄酒，近几年又因蓝莓含有丰富的花青素可对抗自由基、具有延缓衰老的功能而深受人们喜爱。

果酒的酿制工艺为：采摘鲜果→分选→破碎、除梗→果浆→分离取汁→澄清→清汁→发酵→倒桶→贮酒→过滤→冷处理→调配→过滤→成品。原料品种是保证果酒产品质量的重要因素之一，它将直接影响果酒酿制后的感观特性。其中，从采摘的鲜果中选取的水果要求水果成熟度达到全熟透、果汁糖分含量高且无霉烂变质、无病虫害。而酿制后的成品果酒中，含酸量如果适当，酒的滋味就醇厚、协调、适口。反之适口性差、酸味过重、酒汁失光浑浊，降低消费者的购买欲。果酒中的酸一部分是由原料带来的，如葡萄中的酒石酸，苹果中的苹果酸，杨梅中的柠檬酸等；也有发酵过程中产生的(酵母菌代谢物)，如醋酸，丁酸，乳酸，琥珀酸等。L-苹果酸和酒石酸是葡萄酒中最突出的有机酸，在葡萄酒酿造过程中起着至关重要的作用，包括葡萄酒的感官品质和物理，生物化学和微生物稳定性。果酒产品质量指标中有一项就是要控制果酒中有机酸的总量。

综上所述，在果酒的酿制工艺中，鲜果的防腐保藏和成品酒中有机酸总量的控制是影响果酒成本和质量的两个重要环节。

据分析，新鲜果蔬品质劣变受诸多因素的影响，但病害是最主要的原因。其中，真菌性病害引起的腐烂变质是果实采后损失中最严重的因素，不同水果的主要病害也不同，葡萄主要由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起黑粉病，苹果主要由扩展青霉(Penicillium expansum)引起青霉病。目前，解决鲜果防腐的常见和主要的方法是物理防治和化学药剂防治，使用化学农药不但导致病原菌产生耐药性而降低杀菌效果，同时因处理不干净造成的化学药剂残留也会影响到人们的健康。而物理防治方法(如低温储藏)需要借助专门的设备、且往往需要耗能，同时也不利于保留鲜果中营养成分。而对果酒中有机酸总量的控制，现有技术通常是在果酒中加入降酸剂(可食用的碱)、阴离子交换树脂柱子降酸、低温冷冻降酸等，前一株降酸方式因引入碱影响果酒的风味和口感，后一株降酸方式只能影响在生产的过程中对有机酸进行控制且成本高效率低，灌装完成后无法对酒中有机酸进行控制。

生物降酸法，是一株比较新的方法，其利用微生物代谢途径将果酒中的有机酸分解以达到降酸目的，相比物理和化学降酸，生物降酸，不仅能够降低果酒的酸度，更重要的是可以增加果酒的稳定性,提升酒的品质，副作用较小,目前研究较多的是苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation，MLF)，是由乳酸菌进行发酵。乳酸菌会产生苹果酸-乳酸酶，L-苹果酸在该酶的催化作用下变成L-乳酸和二氧化碳，相对于苹果酸来说，乳酸较为柔和，因此达到降酸作用。但乳酸也是有机酸，因而该方法实际上并不能有效降低果酒中的有机酸和改善果酒口感。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一株用于果酒全过程绿色生产的克鲁维毕赤酵母及其应用。该菌株不仅具有优异的生防效果，对水果采后病原真菌具有明显抑制作用，可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，保持水果新鲜防止腐烂变质；同时该菌株还有优异的降低果酒中柠檬酸、乳酸和乙酸等有机酸的功能，可用于果酒的发酵降酸，且几乎能够完全降解掉蓝莓果酒中的柠檬酸。尤其是当果酒为蓝莓果酒时，所述菌株还能显著提高蓝莓果酒中总酚、总黄酮和花青素等活性物含量，提升果酒抗氧化能力和总还原力从而提升蓝莓果酒品质。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

申请人采用孟加拉红培养基对自然发酵的苹果发酵醪液中微生物进行筛选和纯化，得到可有效利用柠檬酸且其降酸能力对酒精浓度不敏感的菌株，通过鉴定，确认该菌株为克鲁维毕赤酵母(P.kluyveri)，将其分类命名为P.kluyveri WTB20042302，并于2020年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.19722。

基于本发明筛选的酵母菌株，本发明还提供如下的技术方案：

本发明还涉及上述克鲁维毕赤酵母菌株P.kluyveri WTB20042302在水果采后贮藏保鲜或果酒降酸中的应用。具体包括：

方案一：一株鲜果保鲜方法，是将克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302配制成菌悬液，利用该菌悬液对鲜果进行喷洒或浸涂。

具体方法为：将克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302活化，用YPD液体培养基发酵培养，离心得到菌体，将菌体用无菌水清洗去除培养基后配制成浓度为1×10⁶CFU/mL～1×10⁸CFU/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒后取出，风干；放入保鲜盒中，密封后，放入常温贮藏。

优选地，所述鲜果为葡萄或蓝莓。

优选地，所述活化步骤为：取固体培养基上的单菌落于YPD液体培养基，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗3遍。

方案二：一株果酒降酸发酵方法，是在向果汁中接种酿酒酵母之前，先接种克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302，然后进行发酵处理。

优选地，所述果酒为蓝莓果酒，所述果汁为蓝莓果汁。

优选地，所述方法为：由新鲜蓝莓破碎后，再经成分调整得到蓝莓果汁，向所述蓝莓果汁中加入克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302，2-4天后加酿酒酵母，经糖度调节、初发酵、过滤、后发酵制得。延迟加入酿酒酵母目的是使先加入的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302能够大量成活，同时可先行降解果汁中自带的有机酸，如柠檬酸、苹果酸等。糖后加入，避免因克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302优先利用糖而失去降酸作用。

优选地，所述克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302的加菌量为1×10⁶CFU/mL。

优选地，所述酿酒酵母的加菌量为1×10⁶CFU/mL，糖度调节的加糖量为120g/L，发酵在22-26℃的室温环境下进行发酵，每天搅拌2次，待发酵结束后过滤，滤液为蓝莓果酒。

所述克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302在使用前，包括一个活化处理：取固体培养基上的单菌落于YPD液体培养基，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗3遍。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

(1)本发明筛选的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302，在柠檬酸(柠檬酸为唯一碳源)筛选培养基上培养96h后培养基中的含量下降了98.65％，在酒石酸(酒石酸为唯一碳源)筛选培养基上培养96h后培养基中的含量下降了38.73％，说明其能够利用柠檬酸和酒石酸；将其加入到蓝莓果汁中进行发酵，在发酵终点时未检测到柠檬酸，说明该菌株具有很强的柠檬酸降解能力。此外，若以仅加入了酿酒酵母的蓝莓汁发酵液为对照，同时加入酿酒酵母和克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302的蓝莓汁发酵液，在发酵终点时乳酸的含量降低了31.91％，甲酸含量降低了14.63％，乙酸含量降低了8.99％，琥珀酸含量降低了16.42％。由此说明，本发明筛选的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302对果酒中的柠檬酸、乳酸、甲酸、乙酸和琥珀酸都有降解能力，其中对柠檬酸的降解能力尤为显著。

以本发明的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302为降酸酵母，能对果酒中绝大部分有机酸起到降解作用，更重要的是可以增加果酒的稳定性(装瓶后还能起到稳定酸度的作用)，提升酒的品质。

(2)本发明筛选的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302加入到蓝莓果汁发酵液中，若以仅加入了酿酒酵母的蓝莓汁发酵液为对照，同时加入酿酒酵母和克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302的蓝莓汁发酵液在发酵终点时，蓝莓果酒中总酚增加了10.42％，总黄酮增加了4.23％，花青素的含量增加了6.96％，酚类、黄酮类和花青素是蓝莓果酒中的重要活性物质，具有抗氧化、清除自由基、抗变异和预防癌变的活性。DPPH自由基清除力提升了3.28％，FRAP总抗氧化能力提升了6.64％，ABTS自由基清除力提升了5.76％，总还原力提升了10.58％，果酒抗氧化能力的提升有效预防衰老和机体因衰老引起的病变。因此，本发明筛选的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302若应用到蓝莓果酒的酿造中，则能够大大提升蓝莓果酒的品质。

(4)在发酵制备蓝莓果酒的过程中，从发酵终点的糖含量可证明，加入本发明克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302后并不影响酿酒酵母对蓝莓酒的发酵进程。因此加入克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302后蓝莓汁能正常发酵，发酵终点时酒精度约为12％，SSC约为7°Bx。若以仅加入了酿酒酵母的蓝莓汁发酵液为对照(发酵终点时pH＝3.61)，而加入本克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302和酿酒酵母后，发酵终点的pH为3.87，进一步证明本发明的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302有明显的降酸效果。

(5)以本发明的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302作为生防菌，对预先接种了灰葡萄孢菌的葡萄，对发病率进行统计，结果为31.11％；在生防菌浓度相同的情形下，现有生防菌(已有菌株，保藏编号为CGMCC No.14909)的发病率为71.11％，由此说明，本发明酵母菌株相比现有生防菌，对灰葡萄孢菌具有更好的抑制作用。

由此可知，本发明的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302不仅能够在鲜果采摘后防止鲜果腐烂变质保证其新鲜度，同时还能够在后期使用果汁发酵酿酒时起到降酸作用，且其降酸作用不受酒精浓度影响，也不影响酿酒酵母的正常发酵进程，可对果酒中绝大多种类的有机酸都能起降酸效果、提升果酒口感和品相(酸度高酒汁呈浑浊)，是一株可应用于果酒制备工艺全程的优选菌株，在鲜果保鲜储藏时所喷洒的生防菌悬液即使有部分残留，其在发酵过程中依然能发挥其降酸效果。此外，还能增加果酒中酚类和花青素等活性物质的含量，提高果酒抗氧化水平，进一步提升果酒品质。

附图说明

图1为本发明筛选的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302的形态学特征的照片。

图2为本发明筛选的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302的总DNA的PCR电泳检测图谱。

图3为本发明筛选的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302的进化树。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

一、菌株的筛选和鉴定

(一)菌株的分离

分别在0d、3d、6d、9d、12d以及15d对自然发酵的苹果果酒进行取样，将酒样液于孟加拉红培养基进行稀释1000倍、10000倍和100000倍样品铺板，26℃恒温培养48h后获得单菌落，所有实验均做两个平行。挑取单菌落在孟加拉红培养基平板上进行分离纯化，26℃恒温培养48h，根据酵母菌的形态特征挑取疑似菌落镜检，通过在孟加拉红培养基平板上划线分离，得到纯化菌种。

本发明要求保护的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302即来自上述苹果发酵醪液。经实验证明，克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302比从葡萄发酵醪液分离的克鲁维毕赤酵母，在降酸、生防等综合能力方面更优。

(二)克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri WTB20042302的生物学特性

(1)形态学特征

参见图1A、图1B所示，A代表在孟加拉红培养基【真菌培养基，蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g、琼脂20g、1/3000孟加拉红溶液100mL、蒸馏水1000mL、氯霉素0.1g；制作方法：前述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液，分装后，121℃灭菌20min】上26℃培养48h的菌落形态，标尺1cm；B代表在40倍镜下观察到的细胞形态(标尺10μm)。据观察，该菌落不规则，较大，整体为白色，中间浅粉，表面干燥；在显微镜下观察，细胞为椭圆形，直径在8μm左右。

(1)分子生物学鉴定

①采用SDS煮沸法提取该菌株总DNA，以NL-1和NL-4为引物扩增26s rDNA D1/D2区目的片段并进行琼脂糖凝胶电泳分析(电泳条件：180V,30min)，结果如图2所示；检测目的片段大小正确，样品进行DNA测序。

②同源性比对与进化树结果

将测序基因序列与Gene Bank内已知菌株的相应序列进行比对，通过同源性比对结果构建系统发育进化树。参见图3所示。结果表明：菌株与Pichia kluyveri(KC510043.1),在同一分枝上且置信度达到98％，且亲缘性很近(距离＜0.01)从而确定该菌株鉴定为克鲁维毕赤酵母。

二、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302对鲜果的生防效果

(1)实验材料

①菌株：酵母菌：克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302、P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)和P.cactophila BY35(现有菌株、保藏号CGMCC No.14909)

病原菌：灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，为本实验室保存

水果：葡萄，购买于北京新发地

②实验主要仪器，参见表2

(2)实验方法

步骤1：配制酵母菌菌悬液，作为生防菌菌悬液，包括如下步骤：

①活化菌株：在YPD平板上取1个单菌落接种到YPD液体培养基，26℃摇床培养24h。

②收集菌体：离心，去除培养基，加入1mL无菌水冲洗(用移液枪吹打或者震荡混匀)，12000r/min，4℃，2min离心。此操作重复三次。去水，留下菌体后，加入1mL无菌水混匀，稀释到合适倍数。

③血球板计数：先盖上载玻片，在上室和下室分别加入10μL菌悬液，首先用10倍镜找到方格，再换40倍镜计数。计数后稀释成目标浓度悬浮液。

步骤2：配制霉菌菌悬液

在灭菌的10mL离心管中加入2mL无菌水,用灭菌的镊子夹取培养基表面的菌丝，加入离心管中，用移液枪吹打混匀，使孢子完全混入水中，用滤布过滤后用血球计数板计数，稀释成5×10⁴CFU/mL浓度孢子悬浮液。

步骤3：果实准备

将买回来的葡萄进行挑选，将有碰伤和损坏的单独放，将挑选出来的成熟度和大小一致的好果用清水洗净，再用次氯酸钠水溶液(0.5％)处理5min，然后摆放到经过清洗的盒子里面，每盒15个葡萄，待葡萄表面水分晾干后，用刺伤针开始刺伤，每个果实刺伤1个孔，每次刺伤一盒将接种针灼烧。待葡萄的汁液晾干后(大约4h)，实验组加入20μL目的浓度酵母菌悬液，在4h后(基本上酵母菌悬液被完全吸收)加入20μL病原菌5×10⁴CFU/mL的孢子悬浮液，对照组也加入病原菌20μL，装框时在框内放入俩团用水打湿的卫生纸球。

步骤4：对发病(腐烂)情况进行统计

腐烂率的统计方法采用观察法，计算公式为：腐烂率(％)＝烂果数/总果数×100％。病斑直径的测量采用十字交叉法，单位为mm。

(3)实验结果

在葡萄接种灰葡萄孢菌(B.cinerea)的葡萄进行发病率统计，生防菌的浓度为1×10⁶CFU/mL，以P.cactophila BY35(现有菌株、保藏号CGMCC No.14909)为阳性对照，不同处理间发病情况差异比较显著。接种P.kluyveri WTB20042302菌株的葡萄发病率为31.11％；在生防菌浓度相同的情形下，现有生防菌P.cactophila BY35(已有菌株，保藏编号为CGMCCNo.14909)的发病率为71.11％，而接种葡萄酒来源的P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)发病率为57.78％。

通过上述比较可知，本发明的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302对灰葡萄孢菌(B.cinerea)的抑制作用强于生防菌P.cactophila BY35(已有菌株，保藏编号为CGMCCNo.14909)，且强于P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)，说明不同种克鲁维毕赤酵母对灰葡萄孢菌(B.cinerea)抑制效果不同，同种菌菌株之间对灰葡萄孢菌(B.cinerea)抑制效果存在差异。当生防菌的浓度升高到1×10⁸CFU/mL时，克鲁维毕赤酵母P.kluyveriWTB20042302菌悬液的生防效果没有明显增加(发病率为28.89％)。故从经济角度考虑，在利用本发明的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302菌悬液保存鲜果时，优选将浓度设置在1×10⁶CFU/mL。

三、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302的降酸特性

(一)以柠檬酸为唯一碳源的培养基，测试克鲁维毕赤酵母P.kluyveriWTB20042302的降酸能力

(1)实验材料

①菌株：克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302、P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)、P.cactophila(保藏菌株编号为CGMCC No.14909)

②药品和试剂

表1药品和试剂

③实验仪器

表2实验主要仪器

④培养基

柠檬酸培养基：将1g柠檬酸，1g酵母浸粉，2g蛋白胨和0.1g磷酸二氢钾溶于100mL水中，通过121℃高压灭菌20min灭菌，备用。

(2)实验方法

①将培养好的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302、P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)、P.cactophila BY35(保藏菌株编号为CGMCC No.14909)，分别挑取单菌落到装有5ml YPD培养基的试管中，在摇床上进行摇瓶16-24h，以保证其纯度和活力，取出，去上清液，加水清洗后离心3次，最后加入1ml水定容，制成菌悬液。将制备好的菌悬液梯度稀释10倍、100倍和1000倍，选用1000倍用血球计数板在显微镜下进行细胞计数，用公式算出菌悬液浓度，再稀释至2×10⁶CFU/mL。

②在96孔板中分别加入100μL上述的加酸培养基(上述柠檬酸培养基)以及100μL菌悬液，每株菌做三个平行。分别在0h、24h、48h、72h扫描590nm下的吸光度，并计算与0h吸光度的差值，通过吸光度的差值来反映菌株生长状况，进而判定这些菌株能否利用相应有机酸进行生长。

(3)单一降酸效果分析

分别准备3份柠檬酸培养基，每瓶培养基各50mL，灭菌备用。将培养好的3株菌分别挑取单菌落到装有5mLYPD培养基的试管中，在摇床上进行摇瓶16-24h，以保证其纯度和活力，取出，去上清液，加水离心3次，最后加入1ml水定容，制成菌悬液，并进行血球计数。将3株菌分别加入到对应的三角瓶中，使酵母菌的终浓度均为10⁶CFU/mL，放入恒温摇床中摇瓶，26℃，200rpm，分别在0h、48h、96h进行取样，每次取2×4mL，在取样时间点分别测有机酸含量。

采用液相色谱仪检测条件：

色谱柱：Agilent 5 TC-C18(250×4.6mm)，以pH为2.4的磷酸氢二氨为流动相，柱温为45℃、流速为0.8ml/min，进样量为20μL的色谱条件下分别对含有柠檬酸以及加入3株降酸酵母后的有机酸培养基发酵48h和96h的样品离心并稀释20倍后用高效液相色谱仪进行检测。通过柠檬酸标准品色谱图结果确定有机酸的保留时间，并与0h培养基中各有机酸色谱峰面积的对比，检测各菌株的降酸效果。测试前，首先将0h柠檬酸培养基的样品用超纯水稀释20倍，上样检测，然后分别对48h、96h的培养基稀释并检测。

标准曲线的建立：称取一定量的有机酸标准品放入容量瓶内，用超纯水稀释配制成10mg/ml的母液，用流动相稀释成所需浓度，浓度梯度分别为2.5mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml，依次进样得到相应峰面积，用最小二乘法得到相应线性回归方程。

(4)实验结果

①以柠檬酸和酒石酸为唯一碳为唯一碳源降酸效果，如表3-表5：

表3:相对于实验开始时在柠檬酸中的OD₅₉₀增加值

表4:相对于实验开始时在酒石酸中的OD₅₉₀增加值

表5:72h柠檬酸和酒石酸的含量

由表3可知，向柠檬酸培养基(柠檬酸为唯一碳源)中加入P.kluyveriWTB20042302菌株后，在培养48h时吸光度增加1.45以上。而向柠檬酸培养基加入P.cactophila BY35菌株后，在培养48h、72h时吸光度仅增加0.9、1.2左右；加入分离于葡萄酒发酵醪液的P.kluyveri WTBB2吸光度增加1左右。由表4可知，向酒石酸培养基(酒石酸为唯一碳源)中加入P.kluyveri WTB20042302菌株后72h吸光度仅增加0.59，P.cactophilaBY35吸光度仅增加0.65，P.kluyveri WTBB2吸光度仅增加了0.67。由表5可知，P.kluyveriWTB20042302、P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)和P.cactophila BY35(保藏菌株编号为CGMCC No.14909)在72h柠檬酸基本降解完，降酸率分别为98.65％、83.83％和76.33％；而对酒石酸的降酸率分别为38.73％、39.93％和26.73％。

由此说明，本发明筛选的P.kluyveri WTB20042302在柠檬酸中生长繁殖和利用柠檬酸能力显著高于已知专利菌株P.cactophila BY35和葡萄酒来源的P.kluyveri WTBB2，且对柠檬酸利用率高于对酒石酸的利用率。

(二)克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302对蓝莓醪液中有机酸、活性物质和抗氧化水平的影响

(1)实验材料

①菌株：克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302、P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)和P.cactophila BY35(保藏菌株编号为CGMCC No.14909)

蓝莓：由日照尚礼酒厂2019年1月6日提供，品种为北陆

②药品和试剂

表6药品和试剂

③实验仪器

表7实验主要仪器

(2)实验方法

将蓝莓破碎，然后分装到3个发酵罐中，每个发酵罐中放3.5公斤蓝莓。将活化好的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302、P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)和P.cactophila BY35(现有菌株、保藏菌株编号为CGMCC No.14909)分别加入2个发酵罐中，加菌量为1×10⁶CFU/mL，对照组中不加任何降酸酵母。在第3天时再加入酿酒酵母，浓度也为1×10⁶CFU/mL，加糖120g/L。将发酵罐放在22℃的条件下进行发酵，每天搅拌2次。待发酵结束后过滤，果酒滤液密封保存。

(3)蓝莓果酒指标测定

a、理化指标测定

pH值测定：用pH计测定。SSC测定：用糖度计测定。酒精度测定：用酒精计测定。总糖测定：苯酚硫酸法，1mL样品+0.5mL5％苯酚溶液+2.5mL浓硫酸，混匀5min后，取出冷却至室温，分光光度计490nm处测吸光值。总酸测定：根据国标法测定。

b、活性物质测定

总酚含量的测定参考Singleton【Singleton V.L.,Rossi J.A.Colorimetry oftotal phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagents[J].American Journal of Enology and Viticulture,1965,16:144-158.】的方法。总黄酮含量根据王友升等的方法【朱昱燕,王友升,赵茜等.槐花中抗氧化及清除自由基活性物质的提取条件研究[J].食品工业科技,2009(12):130-132.】，以芦丁作标准曲线，醪液中总酚含量换算为每克样品中芦丁的含量。花青素含量的测定参考许昆【许昆.干型蓝莓酒的生产工艺研究[D].安徽大学,2014.】的方法。

c、蓝莓果酒降酸效果检测

混合标准品的配制：固体标准品各取10mg，液体标准品母液各取100μL，用流动相定容至10ml，混合均匀后，与4℃冰箱中避光保存。使用时用注射器取1ml过45μL微孔膜于液相小瓶中在最优条件下检测。

样品前处理：首先将样品用超纯水稀释20倍，上样检测，然后分别对48h、96h的培养基稀释并检测。

液相条件：色谱柱：Agilent 5TC-C18(250×4.6mm)，以pH为2.4的磷酸氢二氨为流动相，柱温为45℃、流速为0.8ml/min，进样量为20μL的色谱条件下，分别对含有柠檬酸的培养基以及加入2株降酸酵母后的有机酸培养基发酵48h和96h的样品离心并稀释20倍后，用高效液相色谱仪进行检测。通过柠檬酸标准品色谱图结果确定有机酸的保留时间，并与0h培养基中各有机酸色谱峰面积的对比，检测各菌株的降酸效果。

(4)实验结果

①柠檬酸含量变化

发酵开始时蓝莓汁中的柠檬酸含量较高，为6.81g/L，而在发酵终点时，除对照组(不加降酸酵母)，添加P.kluyveri WTB20042302、P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)和P.cactophila BY35(现有菌株、保藏菌株编号为CGMCC No.14909)菌株的蓝莓果酒均未检测到柠檬酸。

由此说明，P.kluyveri WTB20042302酵母在蓝莓果酒中对柠檬酸有很强的降解能力。

②乳酸含量变化

发酵开始时的乳酸含量很少，只有0.08g/L。通过对比发酵终点与发酵开始时的乳酸含量可以看出，酿酒酵母在发酵过程中会产生乳酸，因此对照组在发酵终点时乳酸含量为0.94g/L。具体结果如表8：

表8

此外，加入本发明筛选的酵母菌株时，发酵终点的乳酸的含量相对于对照组降低了31.91％。且发酵终点时蓝莓果酒中乳酸含量低于添加P.cactophila BY35和P.kluyveriWTBB2菌株的。

③甲酸含量变化

发酵开始时的蓝莓汁中检测到的甲酸只有0.07g/L，且酿酒酵母在发酵过程中会产生较多甲酸，在发酵终点时对照的甲酸含量为0.41g/L。通过对比发酵终点与发酵开始时的甲酸含量可以看出，酿酒酵母在发酵过程中会产生甲酸。具体结果如表9：

表9

此外，加入本发明筛选的酵母菌株时，发酵终点的甲酸的含量相对于对照组降低了14.63％。而添加P.cactophila BY35和P.kluyveri WTBB2菌株的蓝莓果酒发酵结束时甲酸含量高于对照组。

④乙酸含量变化

发酵开始时的乙酸含量很少，只有0.15g/L。通过对比发酵终点与发酵开始时的乙酸含量可以看出，酿酒酵母在发酵过程中会产生乙酸，因此对照组在发酵终点时乙酸含量为14.97g/L。具体结果如表8：

表10

此外，加入本发明筛选的酵母菌株时，发酵终点的乙酸的含量相对于对照降低了8.99％。而添加P.cactophila BY35和P.kluyveri WTBB2菌株的蓝莓果酒发酵结束时乙酸含量相对于对照组几乎无变化。

⑤琥珀酸含量变化

发酵开始时蓝莓汁中含有极少量的琥珀酸，只有0.05g/L，酿酒酵母在发酵过程中会产生琥珀酸，发酵终点时对照组的琥珀酸含量为0.67g/L。通过对比发酵终点与发酵开始时的琥珀酸含量可以看出，酿酒酵母在发酵过程中会产生琥珀酸。具体结果如表10。

表11

此外，加入本发明筛选的酵母菌株时，发酵终点的琥珀酸的含量相对于对照降低了16.42％。而添加P.cactophila BY35和P.kluyveri WTBB2菌株的蓝莓果酒发酵结束时琥珀酸含量相对于对照组都升高10％左右。

⑥P.kluyveri WTB20042302对蓝莓果酒中活性物质的影响

对照组在发酵终点时总酚含量为1.13mg/g，总黄酮含量为1.05mg/g，花青素含量为120.29mg/L。

表12

与对照组相比，在蓝莓果酒中加入不同降酸酵母后会增加果酒中总酚含量，而加入P.kluyveri WTB20042302后，发酵终点时总酚含量为1.24mg/g，总黄酮含量为1.09mg/g，花青素含量为128.66mg/L，相对于对照总酚增加了10.42％，总黄酮增加了4.23％，花青素增加了6.96％。加入P.cactophila BY35和P.kluyveri WTBB2的蓝莓果酒总酚含量也有增加但增加量都低于P.kluyveri WTB20042302，总黄酮相对于对照几乎无变化，花青素相对于对照组都有增加但增加量都低于P.kluyveri WTB20042302。

⑦P.kluyveri WTB20042302对蓝莓果酒抗氧化水平的影响

表13

与对照组相比，在蓝莓果酒中加入克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302、P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)和P.cactophila BY35(现有菌株、保藏菌株编号为CGMCC No.14909)后，除菌株P.cactophila BY35的FRAP略有降低，所有菌株的各抗氧化指标都升高。而加入P.kluyveri WTB20042302后，DPPH自由基清除力提升了3.28％，FRAP总抗氧化能力提升了6.64％，ABTS自由基清除力提升了5.76％，总还原力提升了10.58％，优于P.kluyveri WTBB2(分离于葡萄酒发酵醪液)和P.cactophila BY35(现有菌株、保藏菌株编号为CGMCC No.14909)。P.kluyveri WTB20042302对蓝莓果酒抗氧化水平具有明显的提升效果。

⑧P.kluyveri WTB20042302对蓝莓果酒中pH的影响

加入降酸酵母后的蓝莓果酒均能正常发酵，发酵终点时所有处理的酒精度均约为12％，SSC约为7°Bx。发酵终点时对照的pH为3.61。加入克鲁维毕赤酵母P.kluyveriWTB20042302后，发酵终点pH为3.87。说明本发明的P.kluyveri WTB20042302有明显的降酸效果。

基于前文叙述可知，克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302(CGMCC No.19722)在降解果酒中的柠檬酸、乳酸、甲酸、乙酸和琥珀酸等方面，相较于其他降酸酵母，具有其独特性，且降酸性能十分优异、适应能力广泛。通过降低果酒中有机酸的含量，可提高果酒的口感、色泽等质量。

在制备果酒，特别是制备蓝莓果酒时，在加酿酒酵母之前加入本发明的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302，发酵终点时所有处理的酒精度在12％左右，SSC在7°Bx左右，发酵终点的pH较高，在3.8以上，果酒中花青素、总酚含量和总酮含量都有增加。

此外，本发明克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302还被证实，P.kluyveriWTB20042302对葡萄灰葡萄孢菌(B.cinerea)的抑制作用强于生防专利菌P.cactophilaBY35(保藏号CGMCC No.14909)。

由此可知，本发明的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302不仅能够在鲜果采摘后防止鲜果腐烂变质保证其新鲜度，同时还能够在后期使用果汁发酵酿酒时起到降酸作用，且其降酸作用不受酒精浓度影响，也不影响酿酒酵母的正常发酵进程，可对果酒中绝大种类的有机酸都能起降酸效果、提升果酒口感和品相(酸度高酒汁呈浑浊)，是一株可应用于果酒制备工艺全程的优选菌株，在鲜果保鲜储藏时所喷洒的生防菌悬液，即使未清除干净，其残留的菌种在发酵过程中依然能发挥其降酸效果。

Claims (10)

1.一株克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，其于2020年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19722，命名为Pichia kluyveriWTB20042302。

2.根据权利要求1所述的克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302在水果采后贮藏保鲜或果酒降酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述水果为蓝莓，所述果酒为蓝莓果酒。

4.一株鲜果保鲜方法，其特征在于：将克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302配成菌悬液，利用该菌悬液对鲜果进行喷洒或浸涂。

5.根据权利要求4所述的鲜果保鲜方法，其特征在于：将克鲁维毕赤酵母P.kluyveriWTB20042302活化，用YPD液体培养基发酵培养，离心得到菌体，配制成浓度为1×10⁶CFU/mL～1×10⁸CFU/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒后取出，风干；放入保鲜盒中，密封后，常温贮藏。

6.根据权利要求4或5所述的鲜果保鲜方法，其特征在于：所述鲜果为葡萄或蓝莓。

7.一株果酒降酸发酵方法，是在向果汁中接种酿酒酵母之前，先接种克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302，再进行发酵处理。

8.根据权利要求7所述的果酒降酸发酵方法，其特征在于：所述果酒为蓝莓果酒，所述果汁为蓝莓果汁。

9.根据权利要求7所述的果酒降酸发酵方法，其特征在于：新鲜蓝莓破碎后，经成分调整得到蓝莓果汁，向所述蓝莓果汁中加入克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302，2-4天后加酿酒酵母，再进行糖度调节、初发酵、过滤和后发酵工艺流程。

10.根据权利要求7所述的果酒降酸发酵方法，其特征在于：所述克鲁维毕赤酵母P.kluyveri WTB20042302的加菌量为1×10⁶CFU/mL。

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