CN112725204A - 一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株HSP11及其应用 - Google Patents

一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株HSP11及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明“一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11及其应用”属于微生物技术领域。所述一株克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11的保藏号为CCTCC M2021087。该菌株发酵葡萄汁生成的乙酸戊酯产量高达2518.31μg/L，乙酸异丁酯的产量高达1417.05μg/L，丙酸乙酯的产量高达1551.25μg/L，3‑甲硫基丙醇乙酸酯的产量高达1364.91μg/L，1‑辛烯‑3‑醇的产量高达1538.96μg/L。

Description

一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株 HSP11及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株 HSP11及其应用。
背景技术
克鲁维毕赤酵母菌(Pichia kluyveri)，其生物学特征为：白色至奶油色的菌落，湿润，粘稠，易挑起，菌落正、反面及中央与边缘的颜色一致，有假菌丝，生长过程中带果香味；球形或卵圆形；能产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶，可用于发酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖。同化葡萄糖、蔗糖、棉子糖、纤维二糖、麦芽糖、松三糖、木糖、乙醇、甘油；不同化半乳糖、乳糖、蜜二糖、山梨糖、可溶性淀粉。
目前已报道的克鲁维毕赤酵母菌的主要用途有：饲料发酵，餐厨垃圾发酵降解、果酸降解。例如：
发明专利申请202010561573.7公开了一种餐厨垃圾高温生物降解用的微生物菌剂，该微生物菌剂就包括一株保藏号为CCTCC NO：M 2019263的克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)ZJB-091。
发明专利申请202010525384.4提供了一株保藏号为CGMCC No.19722的克鲁维毕赤酵母 (Pichia kluyveri)WTB20042302。该菌株可利用柠檬酸和酒石酸，且对果酒中的柠檬酸、乳酸、甲酸、乙酸和琥珀酸都有降解能力。
发明专利申请202010852525.3披露了一株可降解L-苹果酸的保藏编号为CCTCCNO：M 2020372的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)LI-27-1。
但本领域目前尚未报道过可产1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯等香气物质的克鲁维毕赤酵母 (Pichia kluyveri)。
发明内容
基于本领域的上述空白，本发明筛选得到一株以葡萄汁为底物发酵高产1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯等香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11。
本发明的技术方案如下：
一株克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，其保藏号为CCTCC M 2021087。
保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在生产香气物质方面的应用。
所述香气物质选自由异戊醇、正辛醇、正庚醇、辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯组成的组。
所述香气物质选自由1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、 3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯组成的组。
保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在酿酒方面的应用。
一种酿酒发酵剂，其特征在于，其发酵活性物质包括保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11。
所述发酵活性物质还包括酿酒酵母。
所述酿酒发酵剂为菌剂；
优选地，所述酿酒发酵剂还包括菌剂可接受的辅料；
优选地，所述菌剂可接受的辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养基物质包括但不限于：淀粉、蔗糖、蛋白胨、水。
一种葡萄酒酿造方法，其特征在于，采用保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11进行发酵酿造。
所述发酵指采用所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11以葡萄或葡萄汁做为底物进行发酵。
优选地，所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在底物中的添加浓度为106-107CFU/ml，优选106CFU/ml。
本发明筛选得到一株菌株，经香气物质成分鉴定实验测得其可高产1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯等一系列香气物质，并且对比商业的酿酒酵母菌株F33，本发明的菌株还可产生F33 无法生成的香气物质，例如：1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯，其中乙酸戊酯产量高达2518.31μg/L，乙酸异丁酯的产量高达1417.05μg/L，丙酸乙酯的产量高达1551.25μg/L，3-甲硫基丙醇乙酸酯的产量高达1364.91μg/L，1-辛烯-3-醇的产量高达1538.96μg/L。经鉴定，该菌株为一株克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株，申请人将其命名为HSP11，并将该菌株送保藏。
本发明的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11的保藏信息如下：
命名：HSP11
分类名称：克鲁维毕赤酵母
拉丁名称：Pichia kluyveri
保藏号：CCTCC M 2021087
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏地址：中国.武汉.武汉大学
保藏日期：2021年1月15日。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的详细内容做进一步具体说明，但并不以此限制本发明的保护范围。
生物材料的来源及记载出处
实验例1中使用的葡萄品种的来源和产地如下表1所示：
表1
葡萄品种 产地 来源
赤霞珠 宁夏贺兰山东麓产区 采集
美乐 宁夏贺兰山东麓产区 采集
西拉 宁夏贺兰山东麓产区 采集
蛇龙珠 宁夏贺兰山东麓产区 采集
小味儿多 宁夏贺兰山东麓产区 采集
贵人香 宁夏贺兰山东麓产区 采集
威代尔 宁夏贺兰山东麓产区 采集
雷司令 宁夏贺兰山东麓产区 采集
霞多丽 宁夏贺兰山东麓产区 采集
上表1中的葡萄品种均为公知公用的葡萄品种，也可商购获得。
实验例2中使用的葡萄品种为威代尔冰葡萄，购自宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司；
商业菌株-酿酒酵母F33购自法国拉氟德(Laffort)公司。
第1组实施例、本发明的菌株HSP11
本组实施例提供一株克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，其保藏号为CCTCC M 2021087。
第2组实施例、本发明菌株HSP11的应用
本组实施例提供保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11 在生产香气物质方面的应用。
在一些实施例中，所述香气物质选自由异戊醇、正辛醇、正庚醇、辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯组成的组。
在另一些实施例中，所述香气物质选自由1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯组成的组，这些香气物质中的任意一种在产量上HSP11菌株都比已知酿酒酵母F33的要高很多，具体对比数值可参考下面的表1。
第3组实施例、本发明菌株HSP11的酿酒应用
本组实施例提供保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11 在酿酒方面的应用。
第4组实施例、本发明的酿酒发酵剂
本组实施例提供一种酿酒发酵剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述酿酒发酵剂的发酵活性物质包括保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株 HSP11。
在进一步的实施例中，所述发酵活性物质还包括酿酒酵母。本领域技术人员可根据本发明的教导，将本发明的HSP11菌株与本领域现有常见的酿酒酵母联用，用于来发酵酿酒。
在具体的实施例中，所述酿酒发酵剂为菌剂；
在优选的实施例中，所述酿酒发酵剂还包括菌剂可接受的辅料；
在另一些优选的实施例中，所述菌剂可接受的辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养基物质包括但不限于：淀粉、蔗糖、蛋白胨、水。
第5组实施例、本发明的葡萄酒酿造方法
本组实施例提供一种葡萄酒酿造方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11进行发酵酿造。
在具体的实施例中，所述发酵指采用所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11以葡萄或葡萄汁做为底物进行发酵。
在优选的实施例中，所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在底物中的添加浓度为106-107CFU/ml，优选106CFU/ml。
实验例1、本发明克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11的筛选过程
采集宁夏贺兰山东麓不同产地、不同品种酿酒葡萄(如表1所示)，剔除腐烂、发霉、破损的果粒及杂物，称取均匀完整葡萄果粒10.0g，加入90mL无菌的YPD液体培养基中，振荡10 min，制成菌悬液，采用梯度稀释的方法，将适宜稀释度菌悬液涂布在添加100mg/L氯霉素的YPD固体培养基上，28℃培养2d～3d，依据菌落形态，在YPD固体培养基上多次划线纯化，获得纯化菌株。纯化后的菌株于YPD培养基活化24h后，取1mL菌液按照接Biospin 真菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取酵母基因组，以引物NL-1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')和NL-4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3') 进行PCR扩增，测序获得26S rDNA片段的基因序列，通过NCBI的BLAST比对，获得同源性较高的已知标准菌株信息，并对相似度超过99％以上的菌株做种属鉴定，最终获得菌株种属信息。
本实验例中一共获得35株Pichia kluyveri菌株。分别将35株Pichia kluyveri菌株按初始浓度106CFU/mL接入已灭菌的威代尔葡萄汁中(100℃，10min)，18℃±2℃发酵18天，测定其香气含量，最终获得一株产香效果最好的Pichia kluyveri菌株HSP11，并将该菌株送保藏，其保藏信息如下：
命名：HSP11
分类名称：克鲁维毕赤酵母
拉丁名称：Pichia kluyveri
保藏号：CCTCC M 2021087
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏日期：2021年1月15日。
实验例2、本发明克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11产香气物质的数据
葡萄品种：威代尔冰葡萄
葡萄汁生产过程：对采收后的冰葡萄通过气囊压榨机进行带冰压榨操作，同时添加二氧化硫 (50mg/L K2S2O5)和20mg/L果胶酶(≥500U/mg)，抑制细菌病提高出汁率。
葡萄汁发酵条件：浸渍后的葡萄汁分别按初始浓度106CFU/mL接入F33酿酒酵母和Pichia kluyveri菌株HSP11，发酵温度为18℃±2℃，待葡萄汁失重连续三天不再变化终止发酵。所有葡萄酒样品在7500rpm下离心8分钟，取上清液于4℃保存。
各香气物质的检测方法：采用顶空-固相微萃取法-气相质谱法(HS-SPME-GC/MS)。准确量取8mL葡萄酒样品加入含有1.5g NaCl顶空瓶中，同时394.08μg/L 4-甲基-1-戊醇(内标物)，加盖密封。插入CAR/DVB/PDMS萃取纤维，45℃下吸附30min后将萃取纤维在GC进样口 250℃下解吸3min，进行GC-MS分析。色谱柱：InertCap WAX极性色谱柱(60m×0.25mm，0.25μm)；升温程序为：40℃保持5min，以3℃/min升至120℃，再以8℃/min升至230℃，保持10min；载气(He)流速0.8mL/min，不分流。电子轰击离子源；电子能量70eV；传输线温度275℃；离子源温度230℃；激活电压1.5V；灯丝流量0.25mA；质量扫描范围m/z 33～450。采用外标定量法进行化合物定量分析。
以同一品种的葡萄生产的同一批葡萄汁为底物，在相同的发酵条件下，分别以商业菌株-酿酒酵母F33和本发明的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11对等量的葡萄汁进行发酵酿酒处理，再经通过顶空-固相微萃取法-气相质谱方法检测各香气物质的含量(单位：μg/L，含义：每升葡萄酒中该香气物质的含量)，得到下表2：
表2
Figure BDA0002912590590000061
Figure BDA0002912590590000071
上表1中的香气阈值指人类可以嗅闻到该物质的最低浓度下限值。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁夏农产品质量标准与检测技术研究所
<120> 一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株及其应用
<130> P201028/NNZ
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物NL-1
<400> 1
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物NL-4
<400> 2
ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (10)

1.一株克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，其保藏号为CCTCC M 2021087。
2.保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在生产香气物质方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述香气物质选自由异戊醇、正辛醇、正庚醇、辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯组成的组。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述香气物质选自由1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯组成的组。
5.保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在酿酒方面的应用。
6.一种酿酒发酵剂，其特征在于，其发酵活性物质包括保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11。
7.根据权利要求4所述的一种酿酒发酵剂，其特征在于，所述发酵活性物质还包括酿酒酵母。
8.根据权利要求5或6所述的一种酿酒发酵剂，其特征在于，所述酿酒发酵剂为菌剂；
优选地，所述酿酒发酵剂还包括菌剂可接受的辅料；
优选地，所述菌剂可接受的辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养基物质包括但不限于：淀粉、蔗糖、蛋白胨、水。
9.一种葡萄酒酿造方法，其特征在于，采用保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11进行发酵酿造。
10.根据权利要求9所述的一种葡萄酒酿造方法，其特征在于，所述发酵指采用所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11以葡萄或葡萄汁做为底物进行发酵；
优选地，所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在底物中的添加浓度为106-107CFU/ml，优选106CFU/ml。
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