CN111961599B - 固态发酵呈花果香风味的酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于非酿酒酵母的开发利用技术领域，具体涉及一种固态发酵呈花果香风味的酵母及其应用。针对目前还没有采用Geotrichum属酵母纯培养菌株用于固态发酵的问题，本发明提供了一种固态发酵呈花果香风味的酵母，保藏编号为CGMCC 19814。该酵母能够专用于固态发酵，在发酵过程中同时高产乙酸乙酯、乙酸异戊酯和β‑苯乙醇，产乙酸乙酯的量为3.0g/kg，产乙酸异戊酯的量为573mg/kg，产β‑苯乙醇的量为477mg/kg，使得发酵产物呈现特有的花果香风味。本发明酵母产乙醇能力与现有酿酒酵母相当，发酵周期长达40天，持续发酵能力强。本发明为固态发酵生产风味更丰富的白酒提供了一种新的发酵酵母，拓宽了白酒的风味，具有重要的现实意义。

Description

固态发酵呈花果香风味的酵母及其应用
技术领域
本发明属于非酿酒酵母的开发利用技术领域，具体涉及一种固态发酵呈花果香风味的酵母及其应用。
背景技术
浓香型白酒发酵为续糟发酵，需经过多轮次的发酵才能使原料中的淀粉充分转化为酒精。窖池的周转率决定了白酒企业的生产效率，目前常规生产工艺中出窖糟醅的酒精含量仅 6-7％，因此，产乙醇效率已经达到了极高的水平，与产乙醇效率相比，行业人员目前研究的方向更多的倾向于关注白酒的品质。
影响白酒品质的因素很多，主要在于白酒中醇、酯、酸、酯等风味物质的含量，这些风味物质可赋予白酒多种风味特征，如乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸异戊酯等赋予白酒花果香，己酸乙酯赋予白酒菠萝香气，β-苯乙醇赋予白酒玫瑰香气等。目前，行业内可通过选育高产这些风味物质的微生物菌株来定向调控白酒的风味。
酵母作为使用较为安全的一类微生物，在白酒酿造过程中有重要应用价值。目前已经选育了多种功能酵母，如产酯酵母等。但迄今为止尚未在生产中使用除酿酒酵母外的其他种属的纯培养酵母，且酿酒酵母仅仅用于复糟酒的生产，这一方面由于产香酵母等功能酵母的固态发酵特性还不确切或不稳定，另一方面，则是考虑到添加外来酵母有可能影响到白酒自然发酵的微生物生态环境。因此，最好是在酿造环境中分离其中本来就有的酵母，并明确其固态发酵特性的基础上，用于白酒固态发酵。
研究表明，白酒糟醅或大曲中的Pichia anomala、P.kudriavzevii、Zygosaccharomyces bailii 等多种属酵母与多种香型白酒中的风味物质生成有关，部分种属已经分离到具有特殊酿造功能的纯培养菌株。同样的，白地霉(Geotrichum candidum)作为一种介于酵母及真菌之间的芳香微生物，近年来也在白酒发酵糟醅中检测到，如李小龙等发现Geotrichum是芝麻香白酒发酵糟醅中的三大优势酵母之一，崔小亮等在多粮浓香型白酒糟醅中分离到G.candidum菌株，徐岩等也在浓香型白酒发酵糟醅中检测大量Dipodascus属真菌，尽管Geotrichum是否属于 Dipodascus属的无性阶段仍存在争议，但这一重要酵母类群在多种香型白酒糟醅中的广泛存在已无争议。但目前为止，对该酵母在白酒糟醅中的发酵特性仍缺乏了解，也未见该酵母纯培养菌株用于固态发酵的相关报道。
另一方面，现有浓香型白酒发酵采用自然发酵，完全利用自然环境中的天然酵母群体发酵，而随着季节、气温等环境因素及原材料、工人操作、环境污染等其他因素的影响，天然酵母群体的种属构成及不同种属酵母的数量均容易出现波动，导致实际参与每轮次发酵的酵母有明显差异，因此容易导致不同批次产品质量出现波动，也难以实现标准化生产，针对这一情况，本发明拟在发酵起始时的糟醅中强化接种分离自糟醅原生环境的产香功能酵母，对糟醅微生物生态环境的影响更小，从而更好地实现与糟醅中其他微生物的协同发酵，有助于维持糟醅酵母群体的稳定性。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：目前还没有采用Geotrichum属酵母纯培养菌株用于固态发酵的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种固态发酵呈花果香风味的酵母，保藏编号为CGMCC 19814。保藏时间为2020年05月13日，保藏中心为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
其中，上述固态发酵呈花果香风味的酵母的26S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1固态发酵产香的酵母的26S rDNA序列
tacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatcggccaccaggtcgagttgtaatttgtagattgtatcttgagagcggattaaag tctgttggaacacagcgccttagagggtgacagccccgtaaaatctattctcattgtaagatactttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagct ctaagtgggaggtaaattccttctaaagctaaatattgacgagagaccgatagcgaacaagtactgtgaaggaaagatgaaaagcactttgaaaa gagagtgaaaaagtacgtgaaattgttaaaagggaagggtattgaatcagacttggtgctgttgttcaactgtgtttcggcacagtgtactcagca gtactaggccaaggtggggtgtttgggagtgaaaaagaagttggaacgtaactcttcggagtgttatagcctactttcatagctcctcaggcgcct caggactgcgcttcggcaaggaccttggcataatgattctataccgcccgtcttgaaccacgggacca。
其中，上述固态发酵呈花果香风味的酵母，产乙酸乙酯的量为3.0g/kg，产乙酸异戊酯的量为573mg/kg，产β-苯乙醇的量为477mg/kg。
其中，上述固态发酵呈花果香风味的酵母由五粮液发酵糟醅中分离得到。
其中，上述固态发酵呈花果香风味的酵母生长条件为：温度25-32℃，pH 3.0-6.0。
优选的，上述固态发酵呈花果香风味的酵母生长条件为：温度28℃，pH 4.5。
其中，上述固态发酵呈花果香风味的酵母的乙醇耐受量为6％Vol。
本发明的固态发酵呈花果香风味的酵母的生物学特征为：在YPD培养基上28℃培养24 小时后，形成米白色、辐射状、边缘绒毛状的湿润微凸菌落，容易挑取，略带烘焙香气，细胞近长方形，未见出芽生殖。
其中，所述的乳酸YPD培养基的组成包括：每1000mL水中葡萄糖20g、酵母粉10g、蛋白胨20g、琼脂10g。使用前将YPD培养基采用乳酸调节pH值为4.5，在121℃高压下灭菌30min。
其中，上述固态发酵呈花果香风味的酵母的保藏培养基组成包括：每1000mL水中酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，乳酸调节pH至5.0，121℃灭菌20min。
本发明还提供了一种上述酵母在固态发酵在浓香型、酱香型、清香型或米香型白酒酿造中的用途。
本发明还提供了一种上述酵母在饲料工业中制备微生物发酵饲料的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明从五粮液发酵糟醅中分离得到一株专用于固态发酵呈花果香风味的酵母，该酵母能够利用山梨醇、木糖、甘露醇及尿素，可充分利用发酵基质中的木糖，生产的风味物质丰富，包括乙酸乙酯、异丁醇、乙酸异戊酯、β-苯乙醇等，尤其是能够同时高产乙酸乙酯、乙酸异戊酯和β-苯乙醇，乙酸乙酯产量达到3.0g/kg，乙酸异戊酯产量达到573mg/kg，β-苯乙醇产量达到477mg/kg，使产物中呈特殊的花果香风味。同时，本发明的酵母能够耐受发酵后期厌氧及贫瘠营养，持续发酵能力强，可持续发酵40天。此外，本发明的酵母可专用于固态发酵，固态发酵中乙醇产量是液态发酵产量的4.5倍；风味物质总产量达4.3g/kg糟醅，为液态发酵的340倍。本发明的酵母还能有效利用无机氮源，可应用于饲料工业中制备微生物发酵饲料。
本发明的固态发酵呈花果香风味的Geotrichum酵母于2020年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 19814,保藏地中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。分类命名为地霉Geotrichum spp.。
附图说明
图1所示为本发明固态发酵呈花果香风味的酵母在乳酸YPD琼脂培养基上28℃培养24 小时后的菌落形态。
图2所示为本发明固态发酵呈花果香风味的酵母在乳酸YPD琼脂培养基上28℃培养24 小时后的细胞形态。
具体实施方式
本发明提供了一种固态发酵呈花果香风味的酵母，保藏编号为CGMCC No. 19814。保藏时间为2020年05月13日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为地霉 Geotrichum spp.。
本发明提供的固态发酵呈花果香风味的酵母的26S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明酵母分离自五粮液发酵糟醅中，生物学特征为：在YPD培养基上28℃培养24小时后，形成米白色、辐射状、边缘绒毛状的湿润微凸菌落，容易挑取，略带烘焙香气，细胞近长方形，未见出芽生殖。
其中，所述的乳酸YPD培养基的组成包括：每1000mL水中葡萄糖20g、酵母粉10g、蛋白胨20g、琼脂10g。使用前将YPD培养基采用乳酸调节pH值为4.5，在121℃高压下灭菌30min。
本发明分离的固态发酵呈花果香风味的酵母产乙醇能力优于现有商业酵母，接种到由高粱、大米、糯米、玉米、小麦、大曲、糠壳按照浓香型白酒生产工艺比例配制的固态发酵糟醅中后4天才启动发酵，但可持续发酵40天，其发酵24d消耗淀粉的量是酿酒酵母的1.3倍，消耗淀粉的量显著高于酿酒酵母，乙醇产量为6.71mL/100g，能与现有酿酒酵母持平；但本发明的酵母在产风味物质上显著优于现有的酿酒酵母，发酵后的固态发酵糟醅与接种现有的酿酒酵母(安琪白酒王高活性干酵母)的对照糟醅相比，其花果香风味特征显著增强，检测表明其所产的主要挥发性风味物质包括乙酸乙酯、异丁醇、乙酸异戊酯、β-苯乙醇等，其中乙酸乙酯产量为3.0g/kg，乙酸异戊酯产量573mg/kg，β-苯乙醇产量为477mg/kg。
另一方面，本发明分离的酵母在固态发酵与液态发酵中体现出了相当大的差异，固态发酵中乙醇产量是液态发酵产量的4.5倍；风味物质总产量达4.3g/kg糟醅，为液态发酵的340 倍。可见，本发明的酵母适合专用于白酒固态发酵。
本发明的酵母还能有效利用无机氮源，可应用于饲料工业中制备微生物发酵饲料。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例1本发明固态发酵产香的酵母菌株的分离鉴定
分离：取样窖池为宜宾五粮液股份有限公司生产车间中已连续发酵5年以上的窖池。在发酵30d时取样，以专用取样器(中空的双层不锈钢套管)插入窖池，取从窖池表面开始0.5 m-2.7m之间、中心及四周5个取样点的糟醅，装入无菌取样袋中，冰盒运回实验室，在取样后1小时内按如下方法分离酵母菌株：糟醅样品加无菌水分别稀释1000、10000倍后，涂布于以木糖代替葡萄糖的、且用乳酸调节pH至5.0的YPD培养基(配方为：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％木糖，2％琼脂，121℃下灭菌20min)。28℃培养36小时，挑取湿润、白色、表面及边缘呈细小绒毛状的菌落，并在相同培养基上纯化3次备用。
鉴定：按照E.Z.N.A Yeast DNA试剂盒(上海伟进生物科技有限公司)的步骤提取DNA，以NL1、NL4为引物(NL1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示： 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'(SEQ ID NO:2)；NL4引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'(SEQ ID NO:3))扩增酵母菌株26S rDNA序列。通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，送往上海美吉测序公司进行测序，获得的序列与 GenBank中的模式菌株的序列进行BLASTN，将其序列相似性大于99％的序列鉴定为同种，并进一步对比分离酵母与文献记录中的该酵母种的形态特征及生理生化特征，完全吻合则鉴定为该种。
实施例2本发明固态发酵产香的酵母的生理生化特性
在L-YPD琼脂培养基上28℃培养2d，观察其菌落及细胞形态；以葡萄糖、山梨醇、木糖、甘露醇、肌醇、蔗糖、鼠糖、麦芽糖、阿拉伯糖、水杨酸、乳糖、半乳糖、棉子糖为YNB 培养基中的唯一碳源培养酵母，观察其生长情况，评价其对糖的同化能力；将酵母菌接种到尿素培养基上，培养24h，根据培养基是否变红色评价酵母利用尿素的能力。5mL菌悬液接种乳酸YPD培养基(pH5.0)，分别在20、24、28、32、36、40℃下以100r/min振荡培养36 h，检测其温度耐受性，5mL菌悬液接种至乙醇含量分别为1、2、3、4、5、6、7、8％的乳酸YPD培养基(pH5.0)中，28℃、100r/min振荡培养36h，检测其乙醇耐受性，5mL菌悬液接种至pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的乳酸YPD培养基中，28℃、100r/min 振荡培养36h，检测其pH适应性，以OD560增长超过50％视为生长。本发明编号为CGMCC 19814的菌株的生理生化特性如表1所示。
表1菌株CGMCC 19814的生理生化特性
Figure BDA0002653118840000051
Figure BDA0002653118840000061
实施例3本发明酵母在浓香型白酒酿造中的应用
首先将斜面保存的酵母菌种利用接种针接种1环到乳酸YPD液体培养基中，28℃培养1 天，再对得到的酵母菌悬液在25℃下，3000rpm离心5min，倒去上清液，添加无菌水后混匀再次在相同条件下离心，洗涤菌体，制成浓度为0.5OD左右的酵母菌悬液备用。
以多次煮沸清洗并灭菌的糠壳基质作为固态载体，吸附按生产工艺配比4倍重量(28％高粱+18％糯米+22％大米+16％小麦+8％玉米)的五粮粉，调节水分含量到55％，灭菌后接种由0.5％的根霉菌剂干粉制备的液体菌剂，分装到已灭菌的2kg容量的呼吸袋，分别接种在乳酸YPD培养基中活化24h(1.2.3)的2株酵母菌株，25℃发酵20d，期间于0、4、8、12、16、20d分别取样检测糟醅理化指标及酵母菌数量，发酵起始及结束时取样检测糟醅中风味物质含量。在固态发酵糟醅中同时添加2倍体积的无菌水，装入2.5L广口瓶发酵，其余同上。以接种酿酒酵母(安琪白酒活性干酵母)为对照。
如下表2所示，本发明的酵母可使粮糟中的乙酸乙酯含量从0.1g/kg增加至2.8g/kg，乙酸异戊酯产量0.013g/kg增加至0.546g/kg，β-苯乙醇从0.009g/kg增加至0.456g/kg，除乳酸乙酯外的己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯等多种酯类物质上升0-150％，正丙醇、异戊醇产量显著下降.
表2本发明酵母与常用商品酵母固液态发酵粮糟产风味物质情况(g/kg)
Figure BDA0002653118840000062
Figure BDA0002653118840000071
如表2所示，该Geotrichum sp.酵母在固液态糟醅中主要产13种风味物质，其风味物质总产量高达4.4g/kg糟醅，其产量超过100mg/kg的物质包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯、β-苯乙醇这3种，产量分别为3.0g/kg、573mg/kg、477mg/kg，有助于强化浓香型白酒的花果香气。感官品评发现，接种本发明酵母发酵后的糟醅风味显著优于对照，呈典型的花果香特征。
实施例4利用本发明酵母提升浓香型白酒乙醇产量
酵母菌种的制备方法同实施例2。
根据本发明酵母持续发酵能力强的特点，将其接种入窖粮糟，分别于2口窖池内与未接种的相同粮糟同步发酵70d，与未接种酵母的自然发酵粮糟(对照)相比，该酵母可使粮糟的酒精含量从60mL/kg上升至67.1mL/kg，在发酵40天时检测到明显的乙醇产量上升，接种本发明酵母的糟醅在发酵24-40d期间的乙醇产量占总乙醇产量的33.3％，而对照在发酵24-40d期间的乙醇产量仅占总乙醇产量的22.7％，本发明的酵母显著增加了发酵中后期糟醅乙醇产量，体现出明显的耐厌氧柔俨发酵产乙醇特征。
实施例5利用本发明酵母改善发酵饲料风味
根据本发明酵母生长迅速，风味好的特点，将其用于饲料发酵。按实施例2中方法得到酵母菌悬液，喷洒到以酒糟为主要原料的发酵饲料，与黑曲霉、乳酸菌、绿色木霉一起发酵 3天，发酵后的饲料与未喷洒本发明酵母的发酵饲料相比，呈现典型的花果香风味特征，适口性显著改善，因本发明酵母可利用多种碳源生长，形成大量菌体蛋白，发酵后的酒糟饲料蛋白含量从10.1％提高13.7％。
序列表
<110> 宜宾五粮液股份有限公司
<120> 固态发酵呈花果香风味的酵母及其应用
<130> A200685K（序）
<141> 2020-08-27
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacggcgagt gaagcggcaa aagctcaaat ttgaaatcgg ccaccaggtc gagttgtaat 60
ttgtagattg tatcttgaga gcggattaaa gtctgttgga acacagcgcc ttagagggtg 120
acagccccgt aaaatctatt ctcattgtaa gatactttcg aagagtcgag ttgtttggga 180
atgcagctct aagtgggagg taaattcctt ctaaagctaa atattgacga gagaccgata 240
gcgaacaagt actgtgaagg aaagatgaaa agcactttga aaagagagtg aaaaagtacg 300
tgaaattgtt aaaagggaag ggtattgaat cagacttggt gctgttgttc aactgtgttt 360
cggcacagtg tactcagcag tactaggcca aggtggggtg tttgggagtg aaaaagaagt 420
tggaacgtaa ctcttcggag tgttatagcc tactttcata gctcctcagg cgcctcagga 480
ctgcgcttcg gcaaggacct tggcataatg attctatacc gcccgtcttg aaccacggga 540
cca 543
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (9)

1.固态发酵呈花果香风味的酵母，其特征在于：分类命名为地霉Geotrichum spp.，保藏编号为CGMCC 19814。
2.根据权利要求1所述的固态发酵呈花果香风味的酵母，其特征在于：该酵母的26 SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的固态发酵呈花果香风味的酵母，其特征在于：该酵母同时高产乙酸乙酯、乙酸异戊酯和β-苯乙醇。
4.根据权利要求3所述的固态发酵呈花果香风味的酵母，其特征在于：所述的乙酸乙酯的产量为3.0 g/kg，乙酸异戊酯的产量为573 mg/kg，β-苯乙醇的产量为477 mg/kg。
5.根据权利要求1所述的固态发酵呈花果香风味的酵母，其特征在于：其生长条件为温度25-32℃，pH 3.0-6.0。
6.根据权利要求5所述的固态发酵呈花果香风味的酵母，其特征在于：其生长条件为温度28℃，pH 4.5。
7.根据权利要求5所述的固态发酵呈花果香风味的酵母，其特征在于：其乙醇耐受量为6%Vol。
8.权利要求1-7任一项所述的酵母在固态发酵浓香型白酒酿造中的用途。
9.权利要求1-7任一项所述的酵母在饲料工业中制备微生物发酵饲料的用途。
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