CN111961600B - 固态发酵产香的酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于非酿酒酵母的开发利用技术领域，具体涉及一种固态发酵产香的酵母及其应用。针对目前还没有采用Kazachstania humilis属酵母纯培养菌株用于固态发酵的问题，本发明提供了一种固态发酵产香的酵母，保藏编号为CGMCC 19813。该酵母能够专用于固态发酵，发酵产物丰富，风味物质达到30种，且风味物质总产量为接种酿酒酵母或其他浓香型白酒酿造酵母菌株的2‑26倍，使得发酵产物呈现特有的风味。本发明酵母产乙醇能力与现有酿酒酵母相当，发酵周期可持续发酵至18‑24天，持续发酵能力强。本发明为固态发酵生产风味更丰富的白酒提供了一种新的发酵酵母，拓宽了白酒风味技术手段，具有重要的现实意义。

Description

固态发酵产香的酵母及其应用

技术领域

本发明属于非酿酒酵母的开发利用技术领域，具体涉及一种固态发酵产香的酵母及其应用。

背景技术

浓香型白酒采用传统的混菌自然固态发酵工艺，数百年来经多轮次的续糟发酵，在糟醅中逐渐形成了相对稳定的功能微生物群体，这些功能微生物是我国重要的特色微生物资源，特别是其中的酵母资源，不仅承担了转化还原糖生成乙醇的任务，与其他发酵体系中的酵母相比，其更重要的价值在于通过产醇、酯、酸、酯等多种风味物质影响白酒品质，通过中间代谢产物参与微生物群体共代谢，通过产活性物质影响发酵体系内生态环境。并且，与现有产乙醇量通产超过11％的商业酵母相比，发酵结束后浓香型白酒糟醅中的乙醇含量通常不超过6-7％，糟醅中酵母除产乙醇外的其他功能才是使其区别于其他环境酵母的主要特征，与浓香型白酒品质关联也最为密切，通过选育功能酵母菌株来改善白酒品质一直是行业重点关注的研究领域。

酵母作为使用较为安全的一类微生物，在白酒酿造过程中有重要应用价值，目前已经选育了包括产酯酵母在内的可用于白酒酿造的多种功能酵母，但迄今为止尚未在生产中使用除酿酒酵母外的其他种属的纯培养酵母，且酿酒酵母也仅仅用于复糟酒的生产，这一方面由于产香酵母的固态发酵特性还不确切或不稳定，另一方面，则是考虑到添加外来酵母有可能影响到白酒自然发酵的微生物生态环境，因此，最好是在酿造环境中分离其中本来就有的酵母，并明确其固态发酵特性的基础上，用于白酒固态发酵。

研究表明，白酒糟醅或大曲中的Pichia anomala、P.kudriavzevii、Zygosaccharomyces bailii等多种属酵母与多种香型白酒中的风味物质生成有关，部分种属已经分离到具有特殊酿造功能的纯培养菌株。近两年来的研究发现，Kazachstania属酵母是浓香型白酒糟醅中的优势酵母菌，如杨建刚等应用单链构象多态性分析发现K.exigua是单粮型浓香型白酒糟醅(泸州老窖)在旺盛发酵阶段中的4种优势酵母种之一；张霞等在多粮浓香型白酒糟醅(五粮液)中分离到多株K.humilis酵母菌株，发现该属酵母可被视为揭示浓香型白酒糟醅微环境特征的标志性酵母种属之一，可能具有特殊酿造功能。

但目前，行业内对K.humilis酵母的酿造功能的研究还不够深入，也未见该酵母纯培养菌株用于固态发酵或相关产业的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：目前尚无Kazachstania属酵母纯培养菌株用于固态发酵或相关产业的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种固态发酵产香的酵母，保藏编号为CGMCC 19813。保藏时间为2020年05月13日，保藏中心为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

其中，上述固态发酵产香的酵母的26S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1固态发酵产香的酵母的26S rDNA序列

tacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttgtagagggcgactttggggcggctccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttccgtgtaaagcgctctcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgcgccccccgctcctcgtgggtgggggactctcgcagctcactgggccagcatcagttttggcggccggacaaaactgcaggaacgtagcttgcttcgggaagtgttacagcctgcaggaatacggccagccgggactgaggaatgcgattcgtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtctt。

其中，上述固态发酵产香的酵母可产挥发性风味物质≥30种。

其中，上述固态发酵产香的酵母由五粮液发酵糟醅中分离得到。

其中，上述固态发酵产香的酵母生长条件为温度24-32℃，pH 3.0-6.0。

优选的，上述固态发酵产香的酵母生长条件为温度28℃，pH 5.0。

其中，上述固态发酵产香的酵母的乙醇耐受量为12％Vol。

其中，上述固态发酵产香的酵母生物学特征为：在WL培养基上28℃培养24小时后，形成圆形、光滑、湿润、中间嫩绿色到绿色、边缘米白色的凸起菌落，容易挑取，带花果香气，细胞椭圆形，出芽生殖。

进一步的，所述的WL培养基的组成包括：酵母浸粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，葡萄糖5％，琼脂2％，磷酸二氢钾0.055％，氯化钾00425％，氯化钙0.0125％，氯化铁0.00025％，硫酸镁0.0125％，硫酸锰0.00025％，溴甲酚绿0.0022％，pH值为6.5，121℃灭菌20min。

其中，上述固态发酵产香的酵母采用乳酸YPD培养基保藏培养基组成包括：每1000mL水中酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，乳酸调节pH至5.0，121℃灭菌20min。

其中，上述固态发酵产香的酵母采用斜面传代培养法或冻干法保藏。

本发明还提供了一种上述固态发酵产香的酵母在浓香型、酱香型、清香型或米香型白酒酿造中的用途。

本发明还提供了一种上述固态发酵产香的酵母在制备护肤品或化妆品中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种固态发酵产香的酵母菌株，保藏编号为CGMCC19813。本发明的酵母高度适应白酒固态发酵环境，其最低生长pH为3.0，可正常生长的温度范围为24-32℃，接种到混菌自然发酵糟醅中1天内即可大量增殖，细胞数量在接种8-12天时达到最高值，可持续发酵至18-24天。本发明酵母固态发酵粮食后的乙醇产量为5.5-6.7mL/100g，同时还能产30余种挥发性风味物质(主要以C6以上的多种脂肪酸乙酯、苯乙醇、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯等，还包括特征性的石竹烯、喇叭茶醇等萜烯类风味物质)，并且都具有较高的产量，发酵后的粮食芳香浓郁，易于分辨鉴定。经GC-MS检测，接种本发明酵母发酵后粮食中的挥发性风味物质总量为接种酿酒酵母或其他浓香型白酒酿造酵母菌株的2-26倍。另外，本发明的酵母固态发酵后还能产生具有消炎作用的甘菊蓝，可应用于化妆品领域。本发明为固态发酵生产白酒提供了一种产香丰富的酵母，具有重要的现实意义。

本发明的固态发酵呈花果香风味的酵母于2020年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 19813,保藏地中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为Kazachstania humilis.。

附图说明

图1所示为本发明的产香固态发酵酵母在WL琼脂培养基上28℃培养48小时后的菌落形态。

图2所示为本发明的产香固态发酵酵母在WL琼脂培养基上28℃培养48小时后的细胞形态。

图3所示为本发明的产香固态发酵酵母发酵5种粮食所产的主要挥发性物质总离子图。

具体实施方式

本发明提供了一种固态发酵产香的酵母，保藏编号为CGMCC 19813。保藏时间为2020年05月13日，保藏中心为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

其中，上述固态发酵产香的酵母的26S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

Kazachstania属酵母是面包、酸奶、泡菜等多种传统发酵食品和发酵饲料等乳酸发酵环境中的优势酵母菌，具有可同化乳酸、耐乙酸及不发酵麦芽糖等特性，特别是在面包发酵过程中，该属酵母可水解葡萄糖醛糖苷，代谢产物之一的果糖为异型发酵乳酸菌提供代谢底物，促进其利用果糖产乙酸。并且，除可增加乳酸菌底物供给外，Kazachstaniaturicensis还可通过调节肠道皮肤轴改善特应性皮炎，呈现特殊的益生作用。

目前，还未见有采用K.humilis酵母纯培养菌株用于固态发酵的研究。本发明发明人在五粮液发酵糟醅中分离得到了K.humilis酵母，并发现K.humilis酵母在混菌自然发酵糟醅中的数量达到10⁵数量级，是浓香型白酒发酵旺盛期的6大优势酵母之一，本发明分离培养了该纯种K.humilis酵母，命名为WLY11。研究发现，采用该酵母进行固态发酵能够产生30余种挥发性风味物质，并且都具有较高的产量。风味物质总产量相当于同种其他酵母的2-26倍，相当于酿酒酵母的39倍，为固态发酵后的白酒带来了独特的风味。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例1本发明固态发酵产香的酵母菌株的分离鉴定

分离：取样窖池为宜宾五粮液股份有限公司生产车间中已连续发酵5年以上的窖池。在发酵18d时取样，以专用取样器(中空的双层不锈钢套管)插入窖池，取从窖池表面开始0.5m-1.5m之间、中心及四周5个取样点的糟醅，装入无菌取样袋中，冰盒运回实验室，在取样后1小时内按如下方法分离酵母菌株：糟醅样品加无菌水分别稀释10000、100000、1000000倍后，涂布于用乳酸调节pH至5.0的YPD培养基(配方为：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂，121℃下灭菌20min)。28℃培养36小时，挑取湿润、白色、表面及边缘呈细小绒毛状的菌落，并在相同培养基上纯化3次备用。

鉴定：按照E.Z.N.A Yeast DNA试剂盒(上海伟进生物科技有限公司)的步骤提取DNA，以NL1、NL4为引物(NL1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'(SEQ ID NO:2)；NL4引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'(SEQ ID NO:3))扩增酵母菌株26S rDNA序列。通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，送往上海美吉测序公司进行测序，获得的序列与GenBank中的模式菌株的序列进行BLASTN，将其序列相似性大于99％的序列鉴定为同种，并进一步对比分离酵母与文献记录中的该酵母种的形态特征及生理生化特征，完全吻合则鉴定为该种。

实施例2本发明固态发酵产香的酵母的生理生化特性

在L-YPD琼脂培养基上28℃培养2d，观察其菌落及细胞形态；以葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、赤藓糖、核酮糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、蜜二糖、纤维二糖、乳糖、松三糖为YNB培养基中的唯一碳源培养酵母，观察其生长情况，评价其对糖的同化能力；将酵母菌接种到尿素培养基上，培养24h，根据培养基是否变红色评价酵母利用尿素的能力。5mL菌悬液接种乳酸YPD培养基(pH5.0)，分别在20、24、28、32、36、40℃下以100r/min振荡培养36h，检测其温度耐受性，5mL菌悬液接种至乙醇含量分别为1、2、3、4、5、6、7、8％的乳酸YPD培养基(pH5.0)中，28℃、100r/min振荡培养36h，检测其乙醇耐受性，5mL菌悬液接种至pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的乳酸YPD培养基中，28℃、100r/min振荡培养36h，检测其pH适应性，以OD560增长超过50％视为生长。本发明编号为CGMCC 19813的菌株的生理生化特性如表1所示。

表1菌株CGMCC 19813的生理生化特性

实施例3本发明酵母在浓香型白酒酿造中的应用

首先将斜面保存的酵母菌种利用接种针接种1环到乳酸YPD液体培养基中，28℃培养1天，再对得到的酵母菌悬液在25℃下，3000rpm离心5min，倒去上清液，添加无菌水后混匀再次在相同条件下离心，洗涤菌体，制成浓度为0.5OD左右的酵母菌悬液备用。

该酵母以0.1％接种量接种浓香型白酒入窖粮糟发酵70d，与未接种酵母的自然发酵粮糟(对照)相比，该酵母使粮糟中的乙酸异戊酯含量从0.003g/kg增加至0.241g/kg，β-苯乙醇从0.014g/kg增加至0.187g/kg，C6以上脂肪酸乙酯总含量从0.814g/kg增加至3.241g/kg。针对发酵后的糟醅，由3名具有三级以上白酒品酒师资格证的人员通过嗅闻进行感官品评，主要评价香气的类型、强度以及有无不良气味等，针对发酵蒸馏后的原酒综合样，主要评价原酒香气类型、强度、持久性、纯正性等，结果表明接种本发明酵母发酵后的糟醅及原酒均呈典型的花果香特征，且芳香浓郁，显著优于其他酵母，特别是酿酒酵母(安琪公司，酿酒高活性干酵母，商品名“白酒王”)对照(未接种本发明酵母的糟醅)。

接种本发明酵母菌株固态发酵粮食所产主要风味物质共有30种，如表2所示。感官品评发现，接种本发明酵母发酵后的糟醅风味显著优于对照，呈典型的花果香特征。

表2 CGMCC 19813菌株固态发酵粮食所产主要风味物质

实施例4利用本发明酵母生产浓香型白酒调味酒

酵母菌种的制备方法同实施例2。

该酵母以0.5％的接种量接种入窖粮糟发酵70d，以乙酸正戊酯为内标，对所产风味物质进行半定量，考虑到该检测条件下β-苯乙醇的响应远高于内标，因此针对β-苯乙醇单独采用外标法定量，结果发现接种本发明酵母的糟醅中28种主要风味物质产量为接种酿酒酵母(安琪白酒酵母)的23倍。接种本发明酵母的糟醅中风味物质量与接种酿酒酵母的风味物质量如下表3所示。

表3接种本发明酵母的糟醅中风味物质量与接种酿酒酵母的风味物质量

由上述实施例可看出，本发明分离得到的酵母CGMCC 19813具有很强的产香能力，所产风味物质的总量显著高于现有的酿酒酵母，便于生产得到风味更优异的白酒，具有很好的实用价值。

序列表

<110> 宜宾五粮液股份有限公司

<120> 固态发酵产香的酵母及其应用

<130> A200686K（序）

<141> 2020-08-27

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacggcgagt gaagcggcaa aagctcaaat ttgaaatctg gtaccttcgg tgcccgagtt 60

gtaatttgta gagggcgact ttggggcggc tccttgtcta tgttccttgg aacaggacgt 120

catagagggt gagaatcccg tgtggcgagg agtgcggttc cgtgtaaagc gctctcgaag 180

agtcgagttg tttgggaatg cagctctaag tgggtggtaa attccatcta aagctaaata 240

ttggcgagag accgatagcg aacaagtaca gtgatggaaa gatgaaaaga actttgaaaa 300

gagagtgaaa aagtacgtga aattgttgaa agggaagggc atttgatcag acatggtgtt 360

ttgcgccccc cgctcctcgt gggtggggga ctctcgcagc tcactgggcc agcatcagtt 420

ttggcggccg gacaaaactg caggaacgta gcttgcttcg ggaagtgtta cagcctgcag 480

gaatacggcc agccgggact gaggaatgcg attcgtcaag gatgctggca taatggttat 540

atgccgcccg tctt 554

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcatatcaat aagcggagga aaag 24

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (7)

1.固态发酵产香的酵母，其特征在于：分类命名为Kazachstania humilis.，保藏编号为CGMCC 19813。

2.根据权利要求1所述的固态发酵产香的酵母，其特征在于：所述酵母的26 S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的固态发酵产香的酵母，其特征在于：所述酵母生长条件为温度24-32℃，pH 3.0-6.0。

4.根据权利要求1所述的固态发酵产香的酵母，其特征在于：所述酵母生长条件为温度28℃，pH 5.0。

5.根据权利要求1所述的固态发酵产香的酵母，其特征在于：所述酵母乙醇耐受量为12%Vol。

6.权利要求1-5任一项所述的固态发酵产香的酵母在浓香型白酒酿造中的用途。

7.接种权利要求1-5任一项所述的固态发酵产香的酵母的固态发酵粮食在生产甘菊蓝用于制备护肤品或化妆品中的用途。

Images