CN105695348A - 一种克鲁弗毕赤酵母及其制备无醇杨梅发酵果汁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种克鲁弗毕赤酵母及其制备无醇杨梅发酵果汁的方法，属于微生物发酵技术领域。所述克鲁弗毕赤酵母(Pichiakluyveri)XT110，于2015年10月20日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015626，保藏地址为中国武汉武汉大学。用其制备的无醇杨梅发酵果汁富含发酵香味和原果清香、色泽鲜艳，乙醇含量低(＜0.5％)，口感协调，能较大程度的保持原汁的营养成分和风味，适合女士、老人、儿童和司机等各类人群饮用。
Description
技术领域
本发明涉及一种克鲁弗毕赤酵母及其制备无醇杨梅发酵果汁的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
杨梅(Redbayberry)是我国南方特色水果，其果实球形，色泽艳丽，酸甜多汁，风味浓郁，可食率达到90％以上，富含糖、有机酸和多种维生素，还含有花青素、多酚以及钙、磷、铁、钾等矿物质，具有很高的营养和医疗保健价值。杨梅的消费方式以鲜食为主，由于盛产于梅雨季节且贮藏期短，导致大量积压、腐烂。因此杨梅相关产品的开发非常有必要。市场上的杨梅产品主要有杨梅汁、杨梅浸泡酒、杨梅果酒、杨梅罐头和杨梅果脯等，然而这些产品已不能满足人们对新鲜口感的追求。
目前，人们越来越倾向于富含发酵香味和原果清香的发酵饮料，无醇发酵果汁应运而生。其具有较低的酒精度(<0.5％)，并能较大程度的保持原汁的营养成分、风味和色泽，适合女士、老人、儿童和司机等各类人群。国内对无醇发酵果汁的研究处于起步阶段，目前尚没有关于无醇杨梅发酵果汁的研究。
市售酵母主要是葡萄酒活性干酵母或商业酵母，应用这些酵母酿造时采用的pH普遍较高，一般为3.5左右，其最适发酵pH为4.0以上。而杨梅汁pH一般为3.0左右，当调整发酵pH为3.5时，杨梅花色苷的稳定性会变差，导致杨梅花色苷在酿制过程中大量损失，产品褪色严重，与杨梅汁鲜艳的红色相去甚远，因此在发酵杨梅汁时不宜调整pH值。此外，大部分市售葡萄酒活性干酵母或产香酵母在pH为3.0时不仅发酵性能受抑制，而且产香能力较弱；关于无醇发酵果汁的研究多采用低温发酵(10-20℃)以控制发酵速度和积累发酵香味，导致发酵周期较长，且耗电量较多。为去除果酒中的乙醇以控制乙醇含量小于0.5％，目前大多采用物理方法(蒸馏法、反渗透等)，但是其设备投入和耗电量巨大。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一株克鲁弗毕赤酵母(Pichiakluyveri)XT110，于2015年10月20日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015626，保藏地址为中国武汉武汉大学。
所述克鲁弗毕赤酵母在显微镜下呈椭圆形，大小为(3.0-4.5)μm×(6.0-8.5)μm，生殖方式为多端出芽生殖。菌落为白色，中间凸起，表面干燥有褶皱，边缘不整齐，大小为3.2-4.2mm，有浓郁的果香产生。
所述克鲁弗毕赤酵母在培养温度20-35℃或糖含量30％或pH为2.5的灭菌杨梅汁培养基中，均能在24h内产气充满杜氏管。
所述克鲁弗毕赤酵母在pH5.0，温度28℃条件下，活化9h即达到对数期末期，酵母数为2×108cfu/mL左右，可用于接种。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述克鲁弗毕赤酵母制备无醇杨梅发酵果汁的方法，弥补市场上关于无醇杨梅发酵果汁的空白及克服现有无醇果汁、果酒加工技术的不足，以获得一种色泽鲜艳、酒精度低(<0.5％)、花色苷含量高、果香浓郁、口感协调的无醇杨梅发酵果汁。
所述方法包括以下步骤：
(1)原料处理：以杨梅果作为原料，清洗去核后榨汁并过滤，所得清汁与干杨梅渣灭菌并迅速冷却至室温；
(2)菌种活化：将克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626进行活化，制得种子液；
(3)主发酵：从种子液中收集获得克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626的菌泥，冲洗入灭菌清汁中，15-35℃培养箱中好氧发酵1-10h后，相同温度下厌氧发酵至失重1.0-2.8g/L时停止发酵，倒罐、过滤除去滤渣；
(4)后发酵：将过滤后的发酵液在4-8℃下静止培养20-30d，得到原酒，调整糖酸比后，灭菌即得产品。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)选用成熟度高、无腐烂、色泽较深的杨梅果作为原料。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)清汁与干杨梅渣于100℃灭菌5min并迅速冷却至室温。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)将克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626以YPD培养基进行三级活化。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)将克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626从YPD斜面上挑取到新鲜的YPD平板上，28℃生化培养箱中培养24h后，用接种环挑取3环至50mLpH为5.0的YPD液体培养基中，28℃、150rmp培养12h，再按照10％接种量接种到100mLpH为5.0的YPD液体培养基中，相同条件下活化9h，再用无菌水调整种子液浓度为2×108cfu/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)清汁装液量为50％，干杨梅渣添加量为20-140g/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)干杨梅渣添加量为80g/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)按照5％(v/v)的接种量将克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626的种子液离心获得酵母泥，用灭菌杨梅汁将菌泥冲洗入灭菌培养基中，15-35℃好氧培养1-10h后，相同温度下厌氧发酵至失重为1.0-2.8g/L时停止，倒罐、过滤除渣。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)发酵温度为28℃，好氧发酵4h，厌氧发酵失重为2.3±0.2g/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)后发酵：将过滤后的发酵液转入灭菌容器中，装液量95％，4-8℃下静止培养20-30d，得到原酒，调整糖酸比后，巴氏灭菌即得产品。
与现有技术相比，本发明有以下有益效果：
(1)本发明所提供的克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626对发酵无醇杨梅果汁有较强针对性，可以发酵自然pH(2.8-3.0)下的杨梅汁，发酵过程不需额外加糖，仅利用杨梅汁中的还原糖即可，简化了发酵工艺。而购买的安琪酵母BV818则几乎没有起酵。发酵工艺未优化前，用克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626发酵的无醇杨梅果汁花色苷含量高达106mg/L，比市售的安琪葡萄酒活性干酵母RV171高103.2％；产香能力强，用其发酵的果汁醇香和果香比较浓郁，且杨梅风味突出，而RV171发酵的果汁果香醇香较淡，酒精味相对明显；就口感而言，用其发酵的杨梅果汁杨梅滋味显著，口感纯正，余香明显，而RV171则相对单薄；经过感官评价得出克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626发酵的无醇杨梅发酵果汁比RV171感官分数高25.9分。本发明提供的克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626更适合用于酿制无醇杨梅发酵果汁。
(2)无醇发酵果汁一般通过低温发酵来降低酵母产酒精的能力并通过时间的累积增加发酵果汁中的香气，但是其发酵周期相对较长，可能超过20d或以上。本发明的发酵温度为28℃，发酵时长在24h内，不仅缩短了发酵周期，还节省了大量资金。
(3)一般来讲，果酒在发酵过程均采用厌氧发酵，这样发酵后的果汁酒精度必然会较高，不容易控制，产品香气相对于乙醇会比较弱。本发明在厌氧发酵之前增加好氧发酵阶段，并将好氧时间控制在4h，既利于酵母生长，又利于酵母产香，还可以防止好氧时间过长引起的酯氧化；此外本发明还控制了厌氧发酵的时间，在失重为2.3±0.2g/L时停止发酵，这样就可以使发酵果汁的酒精度控制在0.5％以内。
(4)杨梅酒在发酵过程一般采用清汁发酵，是由于全果发酵时果渣会吸附大量果汁，酵母与果汁接触的面积较小，发酵过程受阻；但是清汁发酵往往由于花色苷结构破坏而使其色泽相对较淡。本发明通过控制杨梅渣添加量既保证发酵果汁有较好的色泽，又能减少杨梅渣对发酵进度的阻碍，还能为发酵汁增加更多的杨梅风味。
综上所述，本发明开发出的适合酿造无醇杨梅发酵果汁的菌种及其酿造方法具有非常大的市场前景。
生物材料保藏
一株克鲁弗毕赤酵母(Pichiakluyveri)XT110，于2015年10月20日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015626，保藏地址为中国武汉武汉大学。
具体实施方式
实施例1克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626的选育
(1)酵母菌的分离：将从无锡雪浪山杨梅果园采集的土壤投入100mL无菌生理盐水中，用旋涡混合器振荡10min后，取1mL上清液加入50mLpH为3.0的YPD液体培养基中，28℃、150r/min振荡培养24h。取1mL浑浊样品的菌液进行10倍梯度稀释并涂布，28℃倒置培养24h。得出有25株具有酵母典型形态特征的菌株，将其划线保存在YPD斜面上。
(2)酵母菌的活化：取斜面上的酵母3环接种至50mLYPD液体培养基中，28℃、150rpm下摇床培养12h，用无菌生理盐水调整至菌液浓度为2×108cfu/mL。
(3)杨梅汁发酵培养基的配制：选用成熟度高、无腐烂、色泽较深的杨梅果作为原料，清洗后去核榨汁并用纱布过滤，装液量为1/2，100℃灭菌5min并迅速冷却至室温；
(4)酵母菌的筛选：
一级筛选(杜氏管法)：将酵母活化后按照10％接种量接种到10mL杨梅汁发酵培养基中(内含杜氏管)，24℃静置发酵48h，每隔12h观察一次产气情况。试验结束后观察发酵液色泽、闻气味。最终筛选出4株酵母发酵液色泽相对较好，气味相对浓郁且能在48h内产气充满杜氏管。
二级筛选(三角瓶发酵法)：将酵母活化后，按照5％接种到灭菌杨梅汁发酵培养基中，24℃加发酵栓静止培养，每隔2h摇动1次，至失重为2.3±0.2g/L时结束(经预实验确定失重为2.8g/L时酒精度为0.5％)。测定酒精度、花色苷含量、残糖和总酸，并结合感官分析对发酵液色泽、香气、滋味和口感进行打分。以安琪葡萄酒活性干酵母RV171和BV818为对照。表1为无醇杨梅发酵果汁的感官评分标准，表2为不同菌株发酵无醇杨梅发酵果汁的理化指标。
表1无醇杨梅发酵果汁感官评分标准
表2不同菌株发酵无醇杨梅果汁的理化指标
由表2可知，前5株菌所发酵的无醇果汁酒精度均为0.4％，小于0.5％，符合无醇果汁的相关规定；花色苷含量具有显著性差异(p<0.05)，以XT103号最佳，达到117mg/L，其次是XT110号，花色苷含量为106mg/L，RV171号最差，为52mg/L；残糖之间无显著性差异(p<0.05)，含量在22-23g/L之间。总酸含量有显著性差异(p<0.05)，以XT103号发酵汁酸度最小，XT112号发酵汁酸度最高；感官评分有显著性差异(p<0.05)，以XT110号分数最高，达到78.6分，XT97号其次，为73.8分。BV818经过24h几乎没有失重，残糖仅下降了9.7％，酒精度仅达到0.1％，色泽相对较好，但是感官评价仅52.7分，说明BV818在该实验条件下没有充分生长并发酵。
根据表1的感官评分标准，就色泽而言，视觉方面前3株无显著性差异，XT112号相对稍浅，RV171呈淡红色，BV818色泽最深，呈杨梅红色；就香气而言，XT97号和XT110号醇香和果香相对浓郁，且有杨梅风味，XT103号香气稍淡，有淡淡的酸味，XT112、RV171和BV818号较差，醇香和果香都比较淡；就滋味而言，六株菌发酵的无醇果汁杨梅汁味均突出，可能因为整体发酵时间比较短，XT110号酸味不明显，而其他五株酸味均比较明显，可能与其产生的有机酸有关；就口感而言，除XT112、RV171和BV818号相对单薄，其他三株均比较纯正，尤其是XT110号余香更为明显。综合以上分析，选择XT110号，即克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626作为发酵无醇杨梅果汁的最佳菌株。
(5)形态学观察：将CCTCCNO:M2015626接种到YPD液体培养基中，28℃培养2d，用水浸法制片于显微镜下观察酵母细胞形态及出芽情况，以目镜测微尺测其营养细胞的大小。将酵母活化后，在YPD琼脂培养基上划线，28℃培养2-3d，观察其菌落形态。观察结果为：细胞在显微镜下呈椭圆形，大小为(3.0-4.5)μm×(6.0-8.5)μm，生殖方式为多端出芽生殖。菌落为白色，中间凸起，表面干燥有褶皱，边缘不整齐，大小为3.2-4.2mm，有浓郁的果香产生。
(6)分子生物学鉴定：将该菌株送至上海生工进行测序。测定结果为：该菌株为克鲁弗毕赤酵母，菌株的26SrDNAD1/D2的基因序列为：
GAGGAAAAGGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGTAAATTGCAGGTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATGTCGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGTTTTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTAGATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGC
(7)耐受性测试：采用杜氏管法，将酵母活化后接种到不同发酵温度(10、15、20、25、30、35℃)、不同糖含量(20％、30％、40％、50％)和不同pH(1.5、2.0、2.5、3.0)的YPD液体培养基中，28℃静置培养96h，每隔24h记录一次产气情况。结果表明：培养温度20-35℃或糖含量30％或pH为2.5的灭菌杨梅汁培养基中，均能在24h内产气充满杜氏管。
(8)生长曲线测定：将该酵母挑取到新鲜的YPD平板上，28℃生化培养箱中培养24h后，用接种环挑取3环至50mLYPD液体培养基中，28℃、150rmp摇床培养12h后，按照10％接种量接种到100mLYPD液体培养基中，测定菌种在不同培养温度(22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃和34℃)和不同培养基pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)中培养12h后的生长情况(OD值)。然后在最佳温度和pH下测定菌株的生长曲线。结果显示：该菌株活化最佳温度为28℃，最佳培养基pH为5.0，在此条件下，活化9h即达到对数期末期，酵母数为2×108cfu/mL左右，可用于接种。
实施例2用克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626制备无醇杨梅发酵果汁的工艺优化：
(1)原料处理:选用成熟度高、无腐烂、色泽较深的杨梅果作为原料，清洗后去核榨汁并用纱布过滤，清汁装液量为发酵瓶体积的1/2，按要求添加一定量的干杨梅渣，100℃灭菌5min并迅速冷却至室温；
(2)菌种活化：将克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626从YPD斜面上挑取到新鲜的YPD平板上，28℃生化培养箱中培养24h后，用接种环挑取3环至50mLpH为5.0的YPD液体培养基中，28℃、150rmp摇床培养12h，再按照10％接种量接种到100mLpH为5.0的YPD液体培养基中，相同条件下活化9h，再用无菌水调整种子液浓度为2×108cfu/mL；
(3)主发酵：按照5％(v/v)的接种量将克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626的种子液装入灭菌的离心管中，5000r/min离心5min获得酵母泥，用灭菌杨梅汁冲洗入灭菌培养基中，盖上灭菌纱布，于一定温度下通氧培养一定时间后，将纱布更换为灭菌发酵栓，相同温度下厌氧发酵至失重为2.3±0.2g/L时停止发酵；
(4)后发酵：将过滤后的发酵液转入灭菌容器中，装液量95％，4-8℃下静止培养20-30d，得到原酒，调整糖酸比后，巴氏灭菌即得产品。
(5)发酵工艺对发酵结果的影响
当发酵温度低于20℃时，菌株产香缓慢且不明显，而高于28℃时发酵速度过快不好控制，且香气随CO2挥发损失较多；当采用清汁发酵时，杨梅汁中花色苷破坏较多，含量为106mg/L左右，营养损失较大，且色泽不太稳定，适当的添加一定量的杨梅渣，不仅能提高花色苷含量，且增加了发酵汁的杨梅风味，榨汁时，每榨取100mL杨梅汁会得到20g的杨梅渣，但是添加量超过80g/L时不仅渣上的色素不能得到有效的浸提，且影响酵母的发酵速率。对于克鲁弗毕赤酵母而言，适当通入一定量的空气，能大大提高酵母的生长速率，且产香能力增强，但通氧时间过长，会引起发酵汁产生异味。
当发酵温度28℃，加渣量80g/L，通氧时间4h，发酵结果如表3所示。
表3无醇杨梅发酵果汁实验结果
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株克鲁弗毕赤酵母(Pichiakluyveri)XT110，于2015年10月20日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015626，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.一种应用权利要求1所述克鲁弗毕赤酵母制备无醇杨梅发酵果汁的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料处理：以杨梅果作为原料，清洗去核后榨汁并过滤，所得清汁与干杨梅渣灭菌并迅速冷却至室温；
(2)菌种活化：将克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626进行活化，制得种子液；
(3)主发酵：从种子液中收集获得克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626的菌泥，冲洗入灭菌清汁中，15-35℃培养箱中好氧发酵1-10h后，相同温度下厌氧发酵至失重1.0-2.8g/L时停止发酵，倒罐、过滤除去滤渣；
(4)后发酵：将过滤后的发酵液在4-8℃下静止培养20-30d，得到原酒，调整糖酸比后，灭菌即得产品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)选用成熟度高、无腐烂、色泽较深的杨梅果作为原料。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)清汁与干杨梅渣于100℃灭菌5min并迅速冷却至室温。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)清汁装液量为50％，干杨梅渣添加量为20-140g/L。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)干杨梅渣添加量为80g/L。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)按照5％(v/v)的接种量将克鲁弗毕赤酵母CCTCCNO:M2015626的种子液离心获得酵母泥，用灭菌杨梅汁将菌泥冲洗入灭菌培养基中，15-35℃好氧培养1-10h后，相同温度下厌氧发酵至失重为1.0-2.8g/L时停止，倒罐、过滤除渣。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)发酵温度为28℃，好氧发酵4h，厌氧发酵失重为2.3±0.2g/L。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)后发酵：将过滤后的发酵液转入灭菌容器中，装液量95％，4-8℃下静止培养20-30d，得到原酒，调整糖酸比后，巴氏灭菌即得产品。
10.权利要求1所述克鲁弗毕赤酵母在制备无醇发酵果汁中的应用。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109609324A (zh) * | 2019-01-23 | 2019-04-12 | 浙江农林大学 | 富含花色苷的糯米杨梅果酒及其制备方法 |
| CN112638173A (zh) * | 2018-08-13 | 2021-04-09 | 科·汉森有限公司 | 用克鲁维毕赤酵母生产不含酒精的发酵蔬菜汁 |
| CN112725204A (zh) * | 2021-01-22 | 2021-04-30 | 宁夏农产品质量标准与检测技术研究所(宁夏农产品质量监测中心) | 一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株HSP11及其应用 |
| CN112914001A (zh) * | 2021-03-25 | 2021-06-08 | 四川大学 | 一种发酵饮料及其制备方法 |
| CN115868625A (zh) * | 2022-12-16 | 2023-03-31 | 江南大学 | 一种由克鲁弗毕赤酵母菌和植物乳杆菌顺序接种共发酵制备复合酵素的方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2712546C1 (ru) * | 2018-10-29 | 2020-01-29 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Горский государственный аграрный университет" | Штамм дрожжей Pichia kluyveri 3-ж 9-2018 ВКПМ Y-4343 - продуцент спирта и микробного белка |
| CN110540916A (zh) * | 2019-10-22 | 2019-12-06 | 中南大学 | 一种无花果果酒的制备方法和无花果果酒 |
| CN112143659B (zh) * | 2020-06-10 | 2022-11-04 | 南京万拓生物科技有限公司 | 一株用于果酒全过程绿色生产的克鲁维毕赤酵母及其应用 |
| CN114208931A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-03-22 | 营口奥雪冷藏储运食品有限公司 | 一种杨梅酵素雪泥及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104479959A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-01 | 江南大学 | 一种梅酒的新型制备方法 |
| CN105349443A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-24 | 江南大学 | 一株酿酒酵母菌株及其高品质杨梅果酒的制备方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4999209A (en) * | 1987-08-17 | 1991-03-12 | Ariel Vineyards, Inc. | Low and non-alcoholic beverages produced by simultaneous double reverse osmosis |
| FR2887257B1 (fr) * | 2005-06-17 | 2007-09-14 | 7 Ind Sa Ab | Procede de preparation d'une boisson fermentee peu alcoolisee |
| CN102883627B (zh) * | 2010-04-27 | 2015-06-10 | 科·汉森有限公司 | 将酵母接种到果汁中的方法 |
| EP2816102A1 (en) * | 2013-06-18 | 2014-12-24 | Anheuser-Busch InBev S.A. | Method for preparing a fermented beverage and beverage thus produced |
-
2016
- 2016-03-10 CN CN201610137565.3A patent/CN105695348B/zh active Active
- 2016-08-13 US US15/236,393 patent/US10405565B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104479959A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-01 | 江南大学 | 一种梅酒的新型制备方法 |
| CN105349443A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-24 | 江南大学 | 一株酿酒酵母菌株及其高品质杨梅果酒的制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 侍崇娟等: "杨梅酒发酵工艺及其风味变化", 《食品工业科技》 * |
| 杜晶等: "杨梅果酒酿造酵母的筛选、鉴定及耐受性研究", 《食品与发酵工业》 * |
| 罗国向等: "低度杨梅果酒的研制", 《食品研究与开发》 * |
| 谭余良等: "无醇及低醇发酵果汁研究进展", 《中国酿造》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112638173A (zh) * | 2018-08-13 | 2021-04-09 | 科·汉森有限公司 | 用克鲁维毕赤酵母生产不含酒精的发酵蔬菜汁 |
| CN109609324A (zh) * | 2019-01-23 | 2019-04-12 | 浙江农林大学 | 富含花色苷的糯米杨梅果酒及其制备方法 |
| CN112725204A (zh) * | 2021-01-22 | 2021-04-30 | 宁夏农产品质量标准与检测技术研究所(宁夏农产品质量监测中心) | 一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株HSP11及其应用 |
| CN112725204B (zh) * | 2021-01-22 | 2021-12-14 | 宁夏农产品质量标准与检测技术研究所(宁夏农产品质量监测中心) | 一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株HSP11及其应用 |
| CN112914001A (zh) * | 2021-03-25 | 2021-06-08 | 四川大学 | 一种发酵饮料及其制备方法 |
| CN115868625A (zh) * | 2022-12-16 | 2023-03-31 | 江南大学 | 一种由克鲁弗毕赤酵母菌和植物乳杆菌顺序接种共发酵制备复合酵素的方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |