CN111662838B - 一种产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株及其应用 - Google Patents

一种产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产酯酶苹果酸‑乳酸发酵乳酸菌菌株及其应用，其分类命名为酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS‑2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 18683，保藏日期为2019年10月14日，本发明的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS‑2接种于酒精发酵结束后葡萄酒样中，在发酵温度为18‑20℃条件下，12‑14d即可完成苹果酸‑乳酸发酵，且发酵性能优良，可显著提高发酵酒样中酯类香气化合物总量，提升水果香味，酿造出风格典型的干红葡萄酒，具有良好的经济效益和应用前景。

Description

一种产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是一种产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株及其应用。
背景技术
香气品质是消费者选择和评价葡萄酒的最关键要素之一。在发酵过程由酵母菌和乳酸菌代谢产生的高级醇、酯、有机酸、醛酮等挥发性化合物，是构成葡萄酒发酵香气的主体成分。酯类化合物约占发酵挥发性物质的30％，大多都具有优雅的水果和花香气味，且含量处于阈值左右，当其成分、含量和比例等发生微小的变化时，都有可能会直接决定酒体的香气类型和优雅度，使葡萄酒展现出不同的个性特征。根据合成方式可将酯类物质分为乙酸乙酯、乙酸异戊酯为主的乙酸酯类和己酸乙酯、乳酸乙酯为代表的乙醇酯类。乙酸酯的分子量较小，挥发性较强，但保留时间较短，并且会在贮藏和藏过程中发生水解，产生高浓度乙酸，严重影响葡萄酒的口感；而乙醇酯主要通过生物酶(酯酶、脂肪酶和醇酰基转移酶)作用产生，虽然含量相对较少，但其较低的气味阈值和较强的持久性使它们具有更高的香气活性。
研究发现酯酶(Esterase,EC 3.1.1.1)是乙醇酯类化合物代谢的关键酶。虽然酿酒酵母在酒精发酵过程中可以分泌酯酶，但在高糖、高酒精、高多酚以及低pH的酿酒工艺条件下无法保持高效的催化活性。苹果酸-乳酸发酵(Malolactic fermentation，MLF)是优质干红和部分干白葡萄酒酿造的必需工艺环节，主导MLF的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)可以合成和释放酯酶，其潜在反应底物特异性(C2>C4>C6>C8>C10)决定了发酵香气中酯类化合物的种类和数量，且含量与碳链长度成反比，即碳链越长，酯类物质含量越低。同时，脂溶性的酯类化合物跨膜转运会随着碳链长度的增加而大幅下降，例如己酸乙酯可以100％释放到细胞外，癸酸乙酯只有8-17％被转移，而只有大量合成且可被成功转移到酒体中的挥发性酯类化合物才能被消费者感知。此外，研究还表明不同的酒酒球菌菌株由于合成释放的酯酶活性和底物特异性不同，进而导致葡萄酒的香气存在差异。因此，采用优良的高产低碳链(C2-C6)酯酶O.oeni菌株进行MLF，对丰富和提升葡萄酒酯类香气化合物十分重要。
甘肃河西走廊属北方冷凉葡萄种植区，酿酒葡萄的含酸量普遍相对较高，客观需要在酿酒过程中进行MLF。目前国内尚无优良本土O.oeni推广应用，企业在生产过程中要么不进行MLF，要么只能选择国外进口的商品发酵剂进行发酵，导致所产酒品标准化、同质化问题十分严重。因此，生产企业急需优良本土发酵菌种，酿造代表产区微生物风土特征的优质葡萄酒。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种能够降酸性能良好、酯酶活性较高的产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株及其应用。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株，其分类命名为酒酒球菌(Oenococcusoeni，O.oeni)GS-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 18683，保藏日期为2019年10月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
另外，本发明还提供了一种产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株的应用，所述酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2用于干红葡萄酒酿造。
进一步，所述酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2接种于酒精发酵结束后葡萄酒样中，在温度为18-20℃条件下进行苹果酸-乳酸发酵，在发酵过程中产生高活性的不同碳链长度底物酯酶C2、C4、C6，在典型的干红葡萄酒MLF条件：在pH值3.4，SO2添加量30mg/L，乙醇浓度12％，发酵温度20℃下，C2酯酶的活性累积量为334.821mU/mL、C4酯酶的活性累积量为213.148mU/mL、C6酯酶的活性累积量为332.497mU/mL。
与现有技术相比，本发明的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2接种于酒精发酵结束后葡萄酒样中，在发酵温度为18-20℃条件下，12-14d即可完成苹果酸-乳酸发酵，且发酵性能优良，可显著提高发酵酒样中酯类香气化合物总量，提升水果香味，酿造出风格典型的干红葡萄酒，具有良好的经济效益和应用前景。
附图说明
图1为本发明的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1的革兰氏染色结果图。
图2为本发明的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1菌落形态图。
图3为本发明实施例2的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1菌株的生长曲线。
图4为本发明实施例3的发酵酒样中L-苹果酸的含量表。
图5为本发明实施例4的初始pH值对酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2菌株在发酵过程中C2-C6酯酶活性累积量的影响。
图6为本发明实施例4的乙醇浓度对酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2菌株在发酵过程中C2-C6酯酶活性累积量的影响。
图7为本发明实施例4的SO2添加量对酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2菌株在发酵过程中C2-C6酯酶活性累积量的影响。
图8为本发明实施例4的发酵温度对酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2菌株在发酵过程中C2-C6酯酶活性累积量的影响。
图9为本发明实施例5的发酵酒样中挥发性酯类香气化合物种类和总含量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
本实施例的一种产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株GS-2，是从甘肃河西走廊葡萄酒产区自然启动苹果酸-乳酸发酵酒样中分离筛选获得的，具体的分离筛选方法是采集生产企业自然启动苹果酸-乳酸发酵的蛇龙珠酒样，先用0.9％NaCl灭菌水稀释至10-4-10-8，充分摇匀后吸取0.1mL稀释液，分别涂布于ATB分离培养基(含有50mg/L放线菌酮)平板，28℃厌氧培养5-7d。待菌落形成后，挑取菌落直径小于1mm、表面较光滑、湿润的白色单菌落，于ATB分离培养基上反复划线分离，直至纯化。将初筛菌株分别接种于含有3种复筛培养基的48孔板中，28℃厌氧培养2d后，跟踪监测菌株转化L-苹果酸的能力及酯酶活性，筛选L-苹果酸能力强且产酯酶活性最优的菌株GS-2。
ATB培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·4H2O 0.05g/L，盐酸半胱氨酸0.5g/L，番茄汁25％(v/v)，液体培养基使用1mol/LNaOH调pH值至4.8，固体培养基调pH值至5.0，并向其中加20g/L的琼脂，121℃灭菌20min。其中葡萄糖于115℃灭菌15min，在超净工作台内按比例混合。
ATB分离培养基：灭菌后的ATB培养基中加入50mg/L放线菌酮。
菌种鉴定：利用理化试验对菌株GS-2进行初步鉴定，通过分子生物学方法进行菌种最终鉴定，具体如下：
形态特性：
如图1所示，菌株GS-2革兰氏染色结果为蓝色(阳性)，细胞呈圆形或椭圆形，不运动，呈对、链、簇状排列。
培养特性
ATB固体培养基28℃厌氧培养5-7d后，可观察到菌落呈乳白色，大小均一、直径1mm左右，形态光滑、湿润、中央凸起，边缘较整齐，如图2所示。
过氧化氢酶试验
挑取1-2环GS-2菌株菌苔涂布于洁净的载玻片上，再滴加约2mL 3％的过氧化氢，30秒后仔细观察载玻片菌液周边有无气泡产生。最终结果显示无气泡产生，表明GS-2菌株为过氧化氢酶阴性。
遗传学特征(菌株16S rDNA序列)
本发明测定了菌株GS-2的16S rDNA序列。将菌株纯培养物委托北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进行序列测定，并对菌株16S rDNA序列结果采用BLAST方法在GenBank数据库搜索比对分析。结果表明，该菌株为酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)。
AGTTGCAGACTCCAGTCCGAACTGAGAGAAGTTTTAAGAGATTAGCTTACCGTCGCCGGTTTGCGACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTGTTGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCCTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAATAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTATCCAATGTTCCGAAAAAAAGCTTTCATTACAAAAGCGATCATTGGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTTTTCGCGTATCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTAAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCTCAGGCGGGGTGCTTAATGCGTTTGCTACGTCACTAGGAGGCGGAAACCTCTTAACAACTAGCAC
CCATCGTTTACGGTATGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAACGTCAGTTACGATCTAGCAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCTTCCACATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTTGCCTCTATCGCACTCAAGTAAATCAGTTTCCAATGCAGTTCCGAGGTTGGGCCTCGGGATTTCACATCAGACTTAATAAACCGTCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGGGACATACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTATTTAGCCATCCCTTTCTGGTAAGGTACCGTCAAGCTGAAAACTTTCTCTGAATTCAGTTATTCTTCCCTTACAACAGTGCTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACACACGCGGCGTCGCTCCGTCACACTTTCGTGCATTGCGGAAAATTCCCTACTGCAGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCAGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGGCCAGTCTCTCAACTCGGCTACGCATCATTGCCTTGGTAGGCTTCTACCCTACCAACAAGCTAATACGCCGCAAGACCATCCTCTAGCGATCCAAAAGGACCTTTCAAACAGATCACATGTGTGATTTGTTGTTACGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTAAAGGGCAGGTTTCTTACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCTAGTCATTGCCTCACTTCACCCGAAGGA。
将上述酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 18683，保藏日期为2019年10月14日。
实施例2
本实施例以酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2作为供试菌株，以商业菌株VP41为对照，测定其在ATB培养基中的生长曲线。具体应用过程如下：
ATB培养基配方同实施例1。
菌株活化：
取冷冻保存的酒酒球菌菌株GS-2，置室温下2h后，从斜面培养基上挑取2环接种至配制好的ATB液体培养基中，于28℃培养箱中培养，备用。
VP41菌粉使用无菌蒸馏水活化，按0.02g/L的添加量酒酒球菌VP41菌株，加入无菌dd H2O中20℃活化15min，再加入等体积ATB培养基25℃活化20min。
生物量测定：
将活化至对数生长期的O.oeni以107CFU/mL接种至装有150mLATB培养基的锥形瓶中，28℃厌氧培养。每隔4h吸取菌悬液用分光光度计测其OD600值，以菌株OD600值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制O.oeni生长曲线。每株菌设置3个重复，
结果分析：
图3为2株酒酒球菌于ATB培养基中的生长曲线。由图可知，前12h为各菌株生长适应期，24h后GS-2和VP41进入对数生长期，在84h后菌株GS-2进入生长稳定期；VP41生长期较长，约96h后达到生长稳定期。
实施例3
本实施例采用酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2作为供试菌株，以商业菌株VP41为对照，测定菌株降解L-苹果酸降解能力，具体应用过程如下：
菌株活化：同实施例2。
葡萄酒模拟汁：葡萄糖1g/L、果糖1g/L、海藻糖1g/L、酒石酸1g/L、L-苹果酸3g/L、柠檬酸1g/L、醋酸钠0.14g/L、酵母浸粉4.0g/L、水解酪蛋白2.5g/L、KH2PO4 0.3g/L、KCl0.22g/L、L-型半胱氨酸盐酸0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.065g/L、MnSO4·4H2O 0.015g/L、CaCl20.065g/L。
L-苹果酸测定：
将2019年采自甘肃武威莫高葡萄酒业有限公司葡萄种植基地的蛇龙珠葡萄，参照干红葡萄酒生产工艺完成酒精发酵后，倒罐分装入2.5L棕色发酵瓶中。将活化后的GS-2菌株以107CFU/mL、VP41菌株按照推荐用量(0.02g/L)分别接入发酵瓶中，以未加O.oeni的酒样作为对照。置于20℃启动MLF，每隔24h取样，当发酵酒样中L-苹果酸含量＜0.3g/L时，结束发酵。
参照爱尔兰Megazyme公司L-苹果酸检测试剂盒推荐的方法测定L-苹果酸含量，分析酒样中L-苹果酸含量的变化。L-苹果酸含量按如下公式计算：
苹果酸含量(g/L)＝0.4980×[(A4-A3)-(A2-A1)]×稀释倍数。
结果分析：
由图4可知，葡萄酒样中L-苹果酸含量均呈下降趋势。其中GS-2菌株进入对数生长期较快(24h，图3)，其诱导发酵的葡萄酒中L-苹果酸含量也下降较快，48h时L-苹果酸含量约从3.423g/L迅速降至2.327g/L，相比VP41菌株降酸速率较高。但从48h至144h的时间段内，GS-2菌株发酵液中L-苹果酸含量下降较为缓慢，而后开始快速降低。当浓度降至约0.200g/L时，供试菌株降酸速率均变得缓慢。在MLF11 d后，GS-2酒样中L-苹果酸含量仅剩0.008g/L，最先完成发酵；而VP-41用时14d。结果表明GS-2菌株(CGMCC 18683)在MLF过程中具有良好的降解L-苹果酸的能力。
实施例4
本实施例采用酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2作为供试菌株，以商业菌株VP41为对照，测定不同MLF酿造条件对菌株在发酵过程中C2-C6酯酶累积活性的影响。具体应用过程如下：
菌株活化：同实施例2。
酶活性测定：在10mL离心管中加入1 820μL的pH为5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液(0.1mol/L柠檬酸和0.2mol/L磷酸氢二钠)，80μL对硝基苯基-(乙、丁、己)酸酯的乙醇溶液(25mmol/L)，200μL菌液，混合均匀。50℃下反应30min后立即取出，并加入200μL的Na2CO3溶液(0.5mol/L)终止反应，离心后取上清液，测定400nm处吸光值。对照组用柠檬酸-磷酸缓冲液代替酶液。
一个单位酯酶活性的定义：50℃条件下，每mL菌体细胞每min释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量。
将GS-2菌株和VP41菌株以107CFU/mL，分别接种于不同初始pH值(3.0、3.2、3.4、3.6、3.8)、乙醇浓度(6％、8％、10％、12％、14％)和SO2添加量(15、30、45、60、75mg/L)的模拟酒中，在不同发酵温度(18℃、20℃、22℃、25℃、28℃)条件下进行MLF，每隔48h测定菌液中不同碳链底物长度(C2-C6)酯酶的活性，共测定7次(14d)，7次测定值之和为酶活性累计量。实验重复3次。
1)初始pH值对酶活性的影响
图5所示为不同初始pH值MLF发酵过程中(14d)C2-C6酯酶活性累积量的变化趋势。由图可知，在不同pH值(3.2-3.8)条件下，供试菌株酯酶累计活性都随着初始pH值升高而增加，但GS-2菌株的酶活性总累积量(C2、C4、C6酯酶活性累积量之和)均显著高于对照VP41菌株的总累计量(P＜0.05)。
2)乙醇浓度对酶活性的影响
图6所示为乙醇浓度MLF发酵过程中(14d)C2-C6酯酶活性累积量的变化趋势。由图可知，在不同乙醇浓度(6％-14％，v/v)条件下，GS-2菌株的酶活性总累积量(C2、C4、C6酯酶活性累积量之和)随乙醇浓度的升高而降低，但在不同水平下均显著高于对照商业菌株VP41的总累计量(P＜0.05)。
3)SO2添加量对酶活性的影响
MLF发酵过程中(14d)SO2添加量对C2-C6酯酶活性累积量的变化趋势见图7。由图可知，在不同SO2添加量(15-75mg/L)条件下，GS-2菌株的酶活性总累积量(C2、C4、C6酯酶活性累积量之和)在不同水平下均显著高于对照商业菌株VP41的总累计量(P＜0.05)。
4)发酵温度对酶活性的影响
MLF发酵过程中(14d)温度对供试菌株C2-C6酯酶活性累积量的变化趋势见图8。由图可知，在不同乙醇浓度(6％-14％，v/v)条件下，GS-2菌株的酶活性总累积量(C2、C4、C6酯酶活性累积量之和)均显著高于对照商业菌株VP41的总累计量(P＜0.05)。
实施例5
将酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2菌株应用于蛇龙珠干红葡萄酒酿造，本实施例采用酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-2作为供试菌株，以商业菌株VP41为对照，具体应用过程如下：
1)葡萄除梗破碎、装罐：：采用人工方式分选蛇龙珠葡萄，去除果梗及青、烂果，手工破碎混匀后的葡萄汁(带皮)，按80％装液量装入5L的棕色发酵瓶中；
2)添加果胶酶及SO2：按30mg/L用量将果胶酶溶于10倍体积蒸馏水中，活化20min后均匀加入葡萄汁中；再添加40mg/L SO2(以偏重亚硫酸钠计)并充分摇匀，25℃浸渍48h；
3)酿酒酵母活化：将酿酒酵母Vintage Red菌粉按说明书推荐方法，加入10倍体积mLdd H2O，37℃水浴活化15min，再加入等体积葡萄汁，30℃水浴活化15min，活化的酵母菌株按0.2g/L的添加量接入葡萄汁中；
4)酒精发酵：恒温25℃发酵，期间定时摇罐，及时压“酒帽”，当总糖≤4.0g/L时(一般需4-6d)，结束酒精发酵，皮渣分离、出罐；
5)苹果酸-乳酸发酵：皮渣分离后的原酒降低发酵温度至20℃，将本发明的酒酒球菌GS-2菌株，按照107CFU/mL接种量接入待发酵酒样中，检测L-苹果酸的含量，当L-苹果酸≤0.3g/L时，结束发酵；
6)发酵后处理：按50mg/L的用量补充SO2，密封满罐储存，定期倒罐去除酒泥，酒样澄清后取样，进行相关指标测定；
7)发酵酒样指标测定：对赤霞珠干红葡萄酒取样进行基本理化检测，结果均符合国标GB/T 15037-2006的要求，见表1。
表1苹果酸-乳酸发酵前后蛇龙珠干红葡萄酒样理化指标
理化指标 MLF前酒样 VP41 GS-2
pH 3.47 3.62 3.74
残糖(g/L) 2.30 1.98 1.76
酒精度(％) 12.27 12.10 12.04
总酸(g/L) 8.39 6.74 6.92
挥发酸(g/L) 0.24 0.38 0.34
总SO<sub>2</sub>(mg/L) 38.17 32.26 33.31
另外，对发酵酒样挥发性香气化合物进行测定：采用GC-MS对MLF发酵结束的蛇龙珠干红葡萄酒和未MLF发酵酒样(CK)进行挥发性香气物质定性、定量分析。在MLF后的蛇龙珠酒样中共鉴定出73种呈香化合物，包括酯类29种、醇类23种、酸类10种、醛酮类7种、其他成分4种；未经过MLF的酒样中鉴定出58种呈香化合物，包括酯类19种、醇类17种、酸类14种、醛酮类4种、其他成分4种。
由图9可知：GS-2菌株发酵酒样共检出酯类26种，总含量5148.56μg/L，与其他酒样中酯类物质含量存在显著性差异(P<0.05)；VP41菌株发酵酒样共检出酯类23种，总含量4738.56μg/L、CK酒样中共检出酯类18种，总含量4187.82μg/L。主要检出的酯类物质包括乙酸己酯、己酸乙酯、己酸-2-苯乙酯、丁二酸单乙酯、甲酸异戊酯、己酸异戊酯、辛酸甲酯、壬酸乙酯、癸酸甲酯、十一烯酸乙酯、乳酸异戊酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯、癸酸异丁酯、癸酸3-甲基丁酯、棕榈酸甲酯等。总体而言，经过GS-2菌株MLF后的酒样中具有花香、果香味的乙酯类化合物含量明显增多，可赋予蛇龙珠干红葡萄酒浓郁的果香，增加了酒体醇厚感、协调性，提高了酒体品质。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 甘肃农业大学
<120> 一种高产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株及其应用
<130> 2020
<141> 2020-01-21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1260
<212> DNA
<213> 酒酒球菌(Oenococcus oeni，O. oeni)
<400> 1
agttgcagac tccagtccga actgagagaa gttttaagag attagcttac cgtcgccggt 60
ttgcgactcg ttgtacttcc cattgtagca cgtgtgttgc ccaggtcata aggggcatga 120
tgatctgacg tcctccccac cttcctccgg tttatcaccg gcagtctcat tagagtgccc 180
aactaaatgc tggcaactaa taacaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc 240
tcacgacacg agctgacgac gaccatgcac cacctgtatc caatgttccg aaaaaaagct 300
ttcattacaa aagcgatcat tggtatgtca agacctggta aggtttttcg cgtatcttcg 360
aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggtccccgtc aattccttta agttttagcc 420
ttgcggccgt actcctcagg cggggtgctt aatgcgtttg ctacgtcact aggaggcgga 480
aacctcttaa caactagcac ccatcgttta cggtatggac taccggggta tctaatcccg 540
tttgctaccc atactttcga gcctcaacgt cagttacgat ctagcaagcc gctttcgcca 600
ctggtgttct tccacatatc tacgcatttc accgctacac atggagttcc acttgcctct 660
atcgcactca agtaaatcag tttccaatgc agttccgagg ttgggcctcg ggatttcaca 720
tcagacttaa taaaccgtct gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggat aacgctcggg 780
acatacgtat taccgcggct gctggcacgt atttagccat ccctttctgg taaggtaccg 840
tcaagctgaa aactttctct gaattcagtt attcttccct tacaacagtg ctttacgacc 900
cgaaagcctt catcacacac gcggcgtcgc tccgtcacac tttcgtgcat tgcggaaaat 960
tccctactgc agcctcccgt aggagtttgg gcagtgtctc agtcccaatg tggccggcca 1020
gtctctcaac tcggctacgc atcattgcct tggtaggctt ctaccctacc aacaagctaa 1080
tacgccgcaa gaccatcctc tagcgatcca aaaggacctt tcaaacagat cacatgtgtg 1140
atttgttgtt acgcggtatt agcatctgtt tccaaatgtt atcccccact aaagggcagg 1200
tttcttacgt gttactcacc agttcgccac tctagtcatt gcctcacttc acccgaagga 1260

Claims (3)

1.一种产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株，其特征在于：其分类命名为酒酒球菌(Oenococcus oeni)GS-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 18683，保藏日期为2019年10月14日。
2.一种如权利要求1所述的产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株的应用，其特征在于：所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)GS-2用于干红葡萄酒酿造。
3.根据权利要求2所述的产酯酶苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株的应用，其特征在于：所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)GS-2接种于酒精发酵结束后葡萄酒样中，在温度为18-20℃条件下进行苹果酸-乳酸发酵，在发酵过程中产生高活性的不同碳链长度底物酯酶C2、C4、C6，在典型的干红葡萄酒MLF条件：在pH值3.4，SO2添加量30mg/L，乙醇浓度12％，发酵温度20℃下，C2酯酶的活性累积量为334.821mU/mL、C4酯酶的活性累积量为213.148mU/mL、C6酯酶的活性累积量为332.497mU/mL。
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