CN103468675A

CN103468675A - 酒酒球菌抗酸相关基因的rapd标记和scar标记及其获得方法

Info

Publication number: CN103468675A
Application number: CN2013103860378A
Authority: CN
Inventors: 刘树文; 李凯; 何玲
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2013-12-25

Abstract

本发明公开了酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记以及基于RAPD标记的SCAR标记，其中SCAR标记是以酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记采用SCAR引物扩增得到的，所用SCAR引物的序列为：SA1：TCTGGACGGACAATATAAGTCA；SA2：TCTGGACGGAACATTGGGAGAT；RAPD标记的序列为序列表1。本发明所得到的SCAR标记是酒酒球菌抗酸基因连锁的稳定遗传标记，为选育优良的酒酒球菌菌株提供了稳定可靠的一级信息源。

Description

酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记和SCAR标记及其获得方法

技术领域

本发明属于酿酒微生物生物技术工程，特别涉及酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记、SCAR标记及其获得方法。

背景技术

苹果酸-乳酸发酵(Malolactic Fermentation，简称MLF)是葡萄酒酿造中非常关键的二次发酵过程，它包括有机酸、糖类代谢、多糖和氨基酸的代谢作用，还涉及到许多酶类，比如糖苷酶、酯酶、蛋白酶等，这些代谢反应产生多样化的挥发性物质，从而改善和修饰葡萄酒的感官特性。MLF过程主要有酒酒球菌主导。酒酒球菌发挥优良特性必须要抵抗葡萄酒中恶劣的生存环境，产生一定的抗胁迫能力，比如抵抗低pH值胁迫、高酒精浓度胁迫、高S0₂浓度胁迫和营养物质匮乏胁迫等。酒酒球菌在葡萄酒中的抗胁迫能力的大小也就是存活量的多少，是影响MLF活性的关键，因此对不良环境的抵抗能力成为优良菌株选育的重要参照指标。

酒酒球菌的抗酸机制可以作为生物化学和分子生物学方法选育优良菌株的理论基础，然而酒酒球菌抵抗胁迫时有相当复杂的反应机制，目前本领域技术人员尚不清楚酒酒球菌在受到酸胁迫时的具体反应机制。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了获得酒酒球菌抗酸相关基因片段的稳定遗传标记的方法，以及基于此方法获得的RAPD标记和SCAR标记。本发明所获得的标记序列是与酒酒球菌抗酸基因连锁的稳定遗传标记，为进一步揭示酒酒球菌抗酸基因的调控机制奠定理论基础，并且作为一级信息源可以用于选育优良的酒酒球菌菌株。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

首先，本发明公开了酒酒球菌菌株的RAPD标记，其序列全长为1000bp，序列的碱基排列见序列表1所示。该序列具有特异性，与酒酒球菌抗酸性状有紧密联系，可以用作酒酒球菌抗酸性研究的标记序列。

其次，在上述RAPD标记的基础上，本发明还公开了酒酒球菌菌株的SCAR标记，将酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记采用SCAR引物扩增得到，其序列如序列表2所示。

其中所用SCAR引物的序列为：SAl：TCTGGACGGACAATATAAGTCA；SA2：TCTGGACGGAACATTGGGAGAT。

相对于RAPD标记，SCAR标记稳定性更好、可重复性强。SCAR标记表现为扩增片断的有无，是一种显性标记，能更方便、快捷用于快速检测大量个体。

其中，上述的RAPD标记到SCAR标记的转化条件为PCR扩增反应，采用Taq酶1.0U、SCAR引物0.4μmol／L、dNTP160μmol／L、Mg²⁺3.0mmol／L、RAPD标记DNA模板10ng；反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸5min。

相应的，在上述基础上，本发明公开了获得酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记的方法，包括下述步骤：

1)以酒酒球菌为实验材料，筛选抗酸和酸敏菌株；

2)以CTAB法提取酒酒球菌的基因组DNA；

3)基于BSA法与RAPD法，获得与酒酒球菌抗酸相关基因连锁的RAPD标记；

4)回收抗酸性RAPD特异片段，与pMD119-T载体连接后测序得到RAPD标记。

其中，步骤1)筛选抗酸和酸敏菌株的方法为将菌株活化复壮后以相同接种量接种到不同pH梯度的培养基中静置培养，测定菌液在600nm下的吸光值，通过吸光值的大小差异筛选抗酸菌株和酸敏菌株。

其中，步骤2)的CTAB法是生物领域常用的用来提取DNA的方法，采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖，在高离子强度的溶液中(>0.7mol／L NaCl)与蛋白质和多聚糖形成复合物，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使DNA分离出来。

其中，步骤3)首先等量混合抗酸群和酸敏群两个近等位群体的基因组DNA，构建两个近等位基因池；然后采用随机引物对两组基因组DNA进行PCR扩增，筛选出在两个近等位基因池之间能扩增出差异条带的随机引物，在单菌株中验证表现两个基因池差异性的随机引物的特异性；重复上述过程直至筛选出只在抗酸菌株和酸敏菌株二者之一中能稳定扩增的引物。

上述过程中，通过大量重复实验后，最终可以得到只能在抗酸菌株中稳定扩增出的特异性条带，以及能够用于该特异性条带扩增的引物，该引物最终命名为S200：TCTGGACGGA。

进一步的，在上述基础上，本发明提供了获得酒酒球菌抗酸相关基因的SCAR标记的方法，以SCAR引物将RAPD标记进行PCR扩增。

其中，PCR扩增反应，采用Taq酶1.0U、SCAR引物0.4μmol／L、dNTP160μmol／L1、Mg2+3.0mmol／L、RAPD标记DNA模板10ng；反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min， 56℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸5min。

通过上述方式，本发明得到了酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记以及基于RAPD标记转化的SCAR标记，上述标记稳定遗传，与抗酸基因连锁。

附图说明

图1为抗性菌株和酸敏菌株的筛选结果；

图2为随机引物的基因池扩增结果；

图3为随机引物S200在单菌株中的验证；

图4为RAPD特异片段测序结果；

图5为引物SA1和SA2的PCR扩增结果。

具体实施方式

在下述实施例和附图中，申请人提供了获得本发明RAPD标记以及SCAR标记的具体实验步骤，仅为示意说明，并不限制本发明必须采用下述详细条件。本领域技术人员在了解本发明原理的基础上更改实验条件依旧属于本发明的保护范围。

本发明的RAPD标记以及SCAR标记获得方法，包括下述步骤：

一：抗酸菌株和株酸敏菌株的筛选

以30株酒酒球菌为实验材料(名称如附图1纵坐标所示)，进行抗酸和酸敏菌株的筛选：先配制1L的ATB液体培养基：量取250ml准备好的番茄汁于1L烧杯中，另称取10g蛋白胨，5g酵母浸出物，10g葡萄糖，0.2gMgSO₄ 0.05g MnSO₄和0.5g盐酸半胱氨酸，加蒸馏水定容到1000mL，用10％NaOH将pH调整至4.8，配好的ATB培养基在沸水中保温30min，12000r／min离心10min，4℃过夜保存，第二天12000r／min再次离心10min，然后将培养基的pH调整为4个梯度(用盐酸)：3.0、3.2和3.4。所有培养基分装到10ml试管中于高压灭菌锅中灭菌(121℃，20min)。

所有供试菌株预先在pH4.8的培养基中活化复壮，然后以相同接种量(5×10⁷cfu／ml)接种到不同pH梯度的培养基中，放入培养箱中静置培养，26℃条件下培养4天，测定菌液在600nm下的吸光值，重复3次。通过吸光值的大小差异来筛选抗酸菌株和酸敏菌株，分类标注。经过筛选，共获得7株抗酸菌株，11株酸敏菌株，如表1所示。

表1抗性菌株和酸敏性菌株

Figure 2013103860378100002DEST_PATH_IMAGE001

Figure 2013103860378100002DEST_PATH_IMAGE002

二：采用CTAB法提取酒酒球菌的基因组DNA，包括下述步骤：

a.收集菌液。取4ml(2ml离心管分两次)处于对数生长期的菌液，4℃条件下离心(8000r／min，5min)，弃上清。

b.将567μL1×TE溶液加入到到收集的细菌沉淀中，重悬均匀后再加入30μL 10％SDS和3μl蛋白酶K(20mg／mL)，37℃水浴1h。

c.加入100μl NaCl(5mol／L)和80μl CTAB-NaCl溶液，充分颠倒混匀，65℃水浴10min。

d.加入3μl RNase(10mg／mL)，37℃水浴1h。

e.加入与反应液等体积(约780μl)的酚-氯仿-异戊醇(体积比为25：24：1)，轻柔颠倒混匀，4℃条件下离心(12000r／min，10min)。将上清液转入至另一干净离心管中。

f.按步骤e重复抽提一次。

g.加入等体积预冷异丙醇和0.1体积醋酸钠，轻轻颠倒混合至有DNA沉淀，4℃离心5min(12000r／min)，弃去上清。

h.加入1ml70％乙醇，使DNA沉淀悬浮起来，洗涤2min，4℃离心5min(8000r／min)，弃上清；洗涤2次。

i.加入60μl的1×TE缓冲液，4℃冰箱中保存备用。

三：基于BSA法与RAPD相结合，获得与酒酒球菌抗酸相关基因连锁的RAPD标记：

参考群体分组分析法(BSA法)，把酒酒球菌按抗酸能力不同分成两个近等位群体，即抗酸群和酸敏两个群体，在两个近等位群体中各随机抽取5株菌株，等量混合它们的基因组DNA，构建成2个近等位基因池。因为分组时只针对菌株的抗酸性状，因此可保证两个群体在其它性状上有基本相同的遗传背景。2个基因池之间在理论上差异主要存在于目标基因区域，这些差异中一定存在与酒酒球菌抗酸性状相关的部分。

采用优化后的RAPD反应体系(25μL)：Taq酶1.0U、随机引物0.4μmol／L、dNTP160 μmol／L、Mg²⁺3.0mmol／L、DNA模板10ng；PCR反应程序见下表2。

表2：RAPD反应体系反应条件

引物筛选：反应模板是抗酸基因池和酸敏基因池的基因组DNA，采用55条随机引物对两组DNA进行PCR扩增，产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

若两个基因池扩增出的多态性条带相同，说明该引物不能表现出两个基因池的差异。筛选出在两个基因池之间能扩增出差异条带的随机引物55条。随机引物中扩增条带清晰、多态性良好的随机引物有22条，扩增结果如图2(A、B、C)(注：M：100bp plus marker；1-22分别是引物S32、S42、S45、S46、S53、S56、S40、S333、S96、S99、S114、S200、S119、S120、S178、S55、S60、S82、S85、S86、S88和S94的扩增结果，前者是抗酸基因池，后者是酸敏基因池)所示。这22条引物扩增的条带在3到9条之间，大小范围是0.3-3.0kbp，22条引物在两个基因池中扩增出基本相同的带型，这能够说明两基因池之间有十分相近的遗传背景，同源性很高；能够反映出抗酸和酸敏基因池之间的差异的随机引物只有8条，这8条引物分别是：S32、S53、S60、S114、S120、S178、S200、S333。

利用筛选出的抗酸菌株和酸敏菌株验证标记的特异性：PCR模板为抗酸和酸敏单菌株的基因组。DNA引物为上述方法筛选出的能表现两个基因池差异性的随机引物，2％琼脂糖凝胶电泳来检测扩增结果。直至筛选出在抗酸菌株中能稳定扩增出某一条带，而在酸敏菌株中不出现该条带；或者在酸敏群体中能稳定扩增出某一条带，而在抗酸菌株中不出现该条带。

在单菌株中验证表现两个基因池差异性的8条随机引物的特异性，大量重复实验验证后，最终只发现S200这条引物能在7个抗酸菌株中稳定扩增出一条1000bp左右的特异性条带，而在11株酸敏性菌株中，均未能扩增出1000bp的特异性条带(扩增结果见图3，其中1-7(抗酸菌株)：SX-1a、SD-2a、SD-2ji、SD-1f、SD-2hg、NX-2f、NX-3f；8-18(酸敏基因池)：NX-2g、NX-2h、SD-1e、NX-3c、NX-3d、NX-3e、SD-2b、NX-3h、NX-4a、NX-4d、NX-4f)，结果表明该特异条带与酒酒球菌抗酸性状有紧密联系，是抗酸连锁基因的1个分子标记，命名该特异性条带为S200-1000，对应S200的引物序列为S200：TCTGGACGGA。

四：RAPD标记测序

将抗酸性RAPD特异片段回收，与pMD19-T载体连接后测序；测序结果显示目的片段的长度为1097bp(见图4，附表1)，测定序列的两端与引物已知序列(下划线序列)部分准确率达100％，结果可靠。

五：获得SCAR标记

根据序列信息设计一对特异性引物，将RAPD标记转化为更加稳定的SCAR标记：根据测序获得的序列信息，用Gen Bank中的B last功能分析该序列片段与已知序列的同源程度和序列特征。根据去除接头后的全序列信息，利用Premier5.0软件设计并合成SCAR引物。上海生工公司对引物进行合成，对模板DNA扩增，反应体系与RAPD相同，将循环减到30次，退火温度升至56℃。

SCAR引物序列如下：

SA1：TCTGGACGGACAATATAAGTCA

SA2：TCTGGACGGAACATTGGGAGAT

扩增结果显示，SCAR引物只在抗酸菌株中扩增出一条1000bp的特异性条带，而在酸敏性菌株中没有任何条带(扩增结果见图5，其中Marker：100bp plus DNA Ladder；1-7(抗酸菌株)：SX-1a、SD-2a、SD-2ji、SD-1f、SD-2hg、NX-2f、NX-3f；8-18(酸敏菌株)：NX-2g、NX-2h、SD-1e、NX-3c、NX-3d、NX-3e、SD-2b、NX-3h、NX-4a、NX-4d、NX-4f)，说明RAPD标记已经成功转化为SCAR标记，同时也反映出该标记与抗酸基因连锁，该SCAR标记的序列如序列表2，长度为1000bp。

Claims

1.酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记，其特征在于所述RAPD标记的序列为序列表1。

2.酒酒球菌抗酸相关基因的SCAR标记，其特征在于以权利要求1的酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记采用SCAR引物扩增得到的，SCAR标记的序列为序列表2。

3.根据权利要求2所述的SCAR标记，其特征在于所用SCAR引物的序列为：SA1：TCTGGACGGACAATATAAGTCA；SA2：TCTGGACGGAACATTGGGAGAT。

4.根据权利要求2所述的SCAR标记，其特征在于上述PCR扩增反应的条件为Taq酶1.0U、引物0.4μmol／L、dNTP160μmol／L、Mg²⁺3.0mmol／L、RAPD标记DNA模板10ng；反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸5min。

5.获得酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记的方法，其特征在于包括下述步骤：

1)以酒酒球菌为实验材料，筛选抗酸和酸敏菌株；

2)以CTAB法提取酒酒球菌的基因组DNA；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤1)筛选抗酸和酸敏菌株的方法为将菌株活化复壮后以相同接种量接种到不同pH梯度的培养基中静置培养，测定菌液在600nm下的吸光值，通过吸光值的大小差异筛选抗酸菌株和酸敏菌株。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤3)首先等量混合抗酸群和酸敏群两个近等位群体的基因组DNA，构建两个近等位基因池；然后采用随机引物对两组基因组DNA进行PCR扩增，筛选出在两个近等位基因池之间能扩增出差异条带的随机引物，在单菌株中验证表现两个基因池差异性的随机引物的特异性；重复上述过程直至筛选出只在抗酸菌株和酸敏菌株二者之一中能稳定扩增的引物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述能稳定扩增的引物序列为S200：TCTGGACGGA。

9.获得酒酒球菌抗酸相关基因的SCAR标记的方法，其特征在于包括下述步骤：以SCAR引物将RAPD标记进行PCR扩增。