CN110295245B - 一种蝉花菌株的scar分子标记鉴定方法 - Google Patents

一种蝉花菌株的scar分子标记鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种蝉花单17‑7‑1菌株的鉴定方法，包括提取待检测菌株的DNA；对待检测菌株DNA采用引物S11‑2‑F3和S11‑2‑R3或S11‑2‑F4和S11‑2‑R4进行PCR扩增；获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的SCAR条带图谱；将获得的待检测菌株SCAR图谱进行分析获得判定结果。采用本发明鉴定方法，可快速、准确的鉴定蝉花单17‑7‑1菌株。

Description

一种蝉花菌株的SCAR分子标记鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种蝉花菌株的鉴定方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
蝉花，别名虫花，是某些蝉若虫受蝉花寄生后的产物，是一种菌虫复合体。此菌于1838年由Miquel定名为蝉棒束孢霉Isaria cicadae。此后出现多种同物异名，如蝉草Cordyceps cicadae，辛克莱球壳孢Sphaeria sinclairii，辛克莱虫草Cordycepssinclairii，辛克莱棒束孢Isaria sinclairii，基生棒束孢Isaria basili，丛生虫壳菌Torrubia caespitosa，哈里棒束孢Isaria hariottii，小蝉茸Cordyceps sobolifera，蒙克苏棒束孢Isaria mokanshawii和多枝棒束孢Isaria arbuscula等等。
常采到的是蝉花及其寄主山蝉若虫寄生后的复合体。根据历史产区浙江的1467份样品的调查，药材蝉花主要是蝉花寄生后的虫菌复合体。蝉花属半知菌类真菌，其子实体自虫体头部长出，单生或丛聚成束，浅黄色，长1.5～8.0cm，前端膨大，呈纺锤形或呈鸡冠花状。
该蝉花采用如下方法进行培养：从液氮中取出蝉花单17-7-1和其他不同地域蝉花的保藏样品，在超净工作台上将其接到PSA斜面培养基上，22℃-25℃培养10d，然后在超净工作台将PSA斜面培养基中长好的蝉花接到SAAY液体培养基中，22℃-25℃摇菌24h，收集菌丝并液氮速冻，-80℃保存备用。
蝉花单17-7-1的主要形态特征为：在PDA培养基上25℃培养10d，菌落圆形，平展，初絮状，后粉状，白色至浅黄色，直径5～6cm。菌丝无色，分枝，具有隔膜，宽1.2～2.5μm。分生孢子梗多分枝，宽3.0～5.5μm，由每轮2～5个个产孢细胞组成轮状分枝。产孢细胞瓶形，基部球状膨大，向上变细窄，4.5～6.5×2.5～3.5μm。分生孢子圆柱形，单细胞，无色，平滑，链生，直或弯曲，6.5～8.8(～11.0)×2.5～3.5μm。
蝉花单17-7-1经实验验证，其培养物具有易于培养、产量高的特点，具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能，因此具有广泛的工业化应用价值。
由于地理来源不同、寄主不同的蝉花，其次生代谢产物方面具有较大的变异性。本专利的目的是利用SCAR分子标记技术鉴定蝉花单17-7-1菌株和其他不同地域蝉花的区别。
发明内容
本发明的目的在于提供蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，该方法包括如下步骤：
步骤1，提取待检测菌株的DNA；
步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用下列引物进行PCR扩增，
S11-2-F3：GTAGACCCGTGTTGTATGACAAACT；
S11-2-R3：GTAGACCCGTAAGGAGACGGAGGAT；
步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的电泳条带图谱；
步骤4，将步骤3获得的待检测菌株图谱进行分析获得判定结果。
其中，步骤2的引物还可以是：
S11-2-F4：CCTCCCGTCGCTCATTGTT；
S11-2-R4：TCGGGCAAATTTCAAGCGCC A；
进一步的，所述步骤2所采用的PCR扩增反应体系如下：
Figure BDA0001606059650000021
进一步的，所述步骤2所采用的PCR扩增反应条件如下：先95℃5分钟；然后依次95℃30秒，55℃30秒，72℃2.5分钟，共循环35次；然后72℃延伸10分钟，最后降温至4℃保存。
进一步的，所述步骤4中，将步骤3获得的SCAR条带图谱进行分析，发现单17-7-1具有特异条带，而其他不同地域蝉花没有该特异条带，则鉴定出蝉花菌株单17-7-1。
本发明涉及的蝉花菌株为浙江泛亚生物医药股份有限公司所有，编号为单17-7-1已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No.3453。
本发明有益效果：
本发明通过筛选大量的随机引物最终获得本发明引物，该引物具有非常高的特异性，具有唯一的特异性条带(片段长度分别为2414bp和2222bp)，能很好的区分生产菌株单17-7-1和其他不同地域蝉花。
由于目前其他菌株并未进行过全基因组测序，如果要从整个基因组区分不同地域蝉花分子水平的不同，则需要对其他不同地域蝉花进行重测序(每个样至少还需要三次重复)，再进行个体差异性分析，需要消耗大量的金钱，大量的时间。相对于以往的蝉花全基因组测序结果，本发明SCAR分子标记技术只需通过PCR和电泳就能得到结果，具有耗时短，价格低，操作简便的特点。
附图说明
图1为引物S11-2-F1和S11-2-R1对应的SCAR条带图谱。
图2为引物S11-2-F2和S11-2-R2对应的SCAR条带图谱。
图3为引物S11-10-F1和S11-10-R1对应的SCAR条带图谱。
图4为引物S11-10-F2和S11-10-R2对应的SCAR条带图谱。
图5为引物S11-7-F2和S11-7-R2对应的SCAR条带图谱。
图6为引物S11-10-F3和S11-10-R3对应的SCAR条带图谱。
图7为引物S11-11-F2和S11-11-R2对应的SCAR条带图谱。
图8为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱。
图9为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱。
以上图1-7中，泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ8的PCR结果，泳道3为15JJ10的PCR结果，泳道4为15JJ14的PCR结果，泳道5为15JJ18的PCR结果，泳道6为15AX27的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15AX30的PCR结果，泳道10为15AX36的PCR结果，泳道11为15AX39的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果；
以上图8-9中，泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果。
图10为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱；
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
泳道1为单17-7-1的条带大小为2414bp；
泳道2为15JJ5的条带大小估算为无；
泳道3为15JJ7的条带大小估算为无；
泳道4为15JJ8的条带大小估算为无；
泳道5为15JJ10的条带大小估算为无；
泳道6为15JJ14的条带大小估算为3000bp左右；
泳道8为单17-7-1的条带大小为2414bp；
泳道9为15JJ17的条带大小估算为无；
泳道10为15JJ18的条带大小估算为无；
泳道11为15AX22的条带大小估算为无；
泳道12为15AX27的条带大小估算为无；
泳道13为15AX30的条带大小估算为无。
图11为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱；
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
泳道1为单17-7-1的条带大小为2414bp；
泳道2为15AX33的条带大小估算为无；
泳道3为15AX34的条带大小估算为无；
泳道4为15AX36的条带大小估算为无；
泳道5为15AX38的条带大小估算为无；
泳道6为15AX39的条带大小估算为无；
泳道8为单17-7-1的条带大小为2414bp；
泳道9为15JGS2的条带大小估算为无；
泳道10为15JGS4的条带大小估算为无；
泳道11为15JGS11的条带大小估算为无；
泳道12为15JGS35的条带大小估算为无；
泳道13为15JGS38的条带大小估算为无。
图12为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱；
泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为14DBS50的PCR结果，泳道7为15LQ4的PCR结果，泳道8为阴性对照，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
泳道2为单17-7-1的条带大小为2414bp；
泳道3为15FY8的条带大小估算为无；
泳道4为15FY13的条带大小估算为无；
泳道5为15FY14的条带大小估算为无；
泳道6为14DBS50的条带大小估算为无；
泳道7为15LQ4的条带大小估算为无；
泳道8为阴性对照，无条带。
图13为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱；
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
泳道1为单17-7-1的条带大小为2222bp；
泳道2为15JJ5的条带大小估算为无；
泳道3为15JJ7的条带大小估算为无；
泳道4为15JJ8的条带大小估算为无；
泳道5为15JJ10的条带大小估算为无；
泳道6为15JJ14的条带大小估算为无；
泳道8为单17-7-1的条带大小为2222bp；
泳道9为15JJ17的条带大小估算为无；
泳道10为15JJ18的条带大小估算为无；
泳道11为15AX22的条带大小估算为无；
泳道12为15AX27的条带大小估算为无；
泳道13为15AX30的条带大小估算为无。
图14为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱；
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
泳道1为单17-7-1的条带大小为2222bp；
泳道2为15AX33的条带大小估算为无；
泳道3为15AX34的条带大小估算为无；
泳道4为15AX36的条带大小估算为无；
泳道5为15AX38的条带大小估算为无；
泳道6为15AX39的条带大小估算为无；
泳道8为单17-7-1的条带大小为2222bp；
泳道9为15JGS2的条带大小估算为无；
泳道10为15JGS4的条带大小估算为无；
泳道11为15JGS11的条带大小估算为无；
泳道12为15JGS35的条带大小估算为无；
泳道13为15JGS38的条带大小估算为无。
图15为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱；
泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为14DBS50的PCR结果，泳道7为15LQ4的PCR结果，泳道8为阴性对照，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
泳道2为单17-7-1的条带大小为2222bp；
泳道3为15FY8的条带大小估算为无；
泳道4为15FY13的条带大小估算为无；
泳道5为15FY14的条带大小估算为无；
泳道6为14DBS50的条带大小估算为无；
泳道7为15LQ4的条带大小估算为无；
泳道8为阴性对照，无条带。
图16为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
泳道1为单17-7-1的条带大小为2414bp。
泳道2为15JJ5的条带大小估算为无。
泳道3为15JJ7的条带大小估算为无。
泳道4为15JJ8的条带大小估算为无。
泳道5为15JJ10的条带大小估算为无。
泳道6为15JJ14的条带大小估算为3000bp左右。
泳道8为单17-7-1的条带大小为2414bp。
泳道9为15JJ17的条带大小估算为无。
泳道10为15JJ18的条带大小估算为无。
泳道11为15AX22的条带大小估算为无。
泳道12为15AX27的条带大小估算为无。
泳道13为15AX30的条带大小估算为无。
图17为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
泳道1为单17-7-1的条带大小为2414bp。
泳道2为15AX33的条带大小估算为无。
泳道3为15AX34的条带大小估算为无。
泳道4为15AX36的条带大小估算为无。
泳道5为15AX38的条带大小估算为无。
泳道6为15AX39的条带大小估算为无。
泳道8为单17-7-1的条带大小为2414bp。
泳道9为15JGS2的条带大小估算为无。
泳道10为15JGS4的条带大小估算为无。
泳道11为15JGS11的条带大小估算为无。
泳道12为15JGS35的条带大小估算为无。
泳道13为15JGS38的条带大小估算为无。
图18为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱
泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为14DBS50的PCR结果，泳道7为15LQ4的PCR结果，泳道8为阴性对照，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
泳道2为单17-7-1的条带大小为2414bp。
泳道3为15FY8的条带大小估算为无。
泳道4为15FY13的条带大小估算为无。
泳道5为15FY14的条带大小估算为无。
泳道6为14DBS50的条带大小估算为无。
泳道7为15LQ4的条带大小估算为无。
泳道8为阴性对照，无条带。
图19为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
泳道1为单17-7-1的条带大小为2222bp。
泳道2为15JJ5的条带大小估算为无。
泳道3为15JJ7的条带大小估算为无。
泳道4为15JJ8的条带大小估算为无。
泳道5为15JJ10的条带大小估算为无。
泳道6为15JJ14的条带大小估算为无。
泳道8为单17-7-1的条带大小为2222bp。
泳道9为15JJ17的条带大小估算为无。
泳道10为15JJ18的条带大小估算为无。
泳道11为15AX22的条带大小估算为无。
泳道12为15AX27的条带大小估算为无。
泳道13为15AX30的条带大小估算为无。
图20为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
泳道1为单17-7-1的条带大小为2222bp。
泳道2为15AX33的条带大小估算为无。
泳道3为15AX34的条带大小估算为无。
泳道4为15AX36的条带大小估算为无。
泳道5为15AX38的条带大小估算为无。
泳道6为15AX39的条带大小估算为无。
泳道8为单17-7-1的条带大小为2222bp。
泳道9为15JGS2的条带大小估算为无。
泳道10为15JGS4的条带大小估算为无。
泳道11为15JGS11的条带大小估算为无。
泳道12为15JGS35的条带大小估算为无。
泳道13为15JGS38的条带大小估算为无。
图21为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱
泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为14DBS50的PCR结果，泳道7为15LQ4的PCR结果，泳道8为阴性对照，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
泳道2为单17-7-1的条带大小为2222bp。
泳道3为15FY8的条带大小估算为无。
泳道4为15FY13的条带大小估算为无。
泳道5为15FY14的条带大小估算为无。
泳道6为14DBS50的条带大小估算为无。
泳道7为15LQ4的条带大小估算为无。
泳道8为阴性对照，无条带。
具体实施方式
以下实施例所用蝉花单17-7-1菌株于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No.3453；其他不同地域蝉花分别采集自安溪(编号分别为：15AX22，15AX27，15AX30，15AX33，15AX34，15AX36，15AX38，15AX39)、九江(编号分别为：15JJ5，15JJ7，15JJ8，15JJ10，15JJ14，15JJ17，15JJ18)、井冈山(编号分别为：15JGS2，15JGS4，15JGS11，15JGS35，15JGS38)、富阳(编号分别为：15FY8，15FY13，15FY14)、大别山(编号为：14DBS50)、乐清(编号为：15LQ4)。上菌株均为蝉棒束孢。
实施例1
基于SCAR分子标记技术，先人工合成多个随机多态核苷酸序列作为引物，所述引物序列见表1。
表1引物序列
编号 引物名称 序列(5'到3')
SEQ ID NO：1 S11-2-F3 GTAGACCCGTGTTGTATGACAAACT
SEQ ID NO：2 S11-2-R3 GTAGACCCGTAAGGAGACGGAGGAT
SEQ ID NO：3 S11-2-F4 CCTCCCGTCGCTCATTGTT
SEQ ID NO：4 S11-2-R4 TCGGGCAAATTTCAAGCGCCA
SEQ ID NO：5 S11-2-F1 GCCCACAAGCCTCCTCAAGAT
SEQ ID NO：6 S11-2-R1 GGACACCCATACTGGCACGA
SEQ ID NO：7 S11-2-F2 CCCACAAGCCTCCTCAAGAT
SEQ ID NO：8 S11-2-R2 TCGCCAGAGGGTCATACATTTT
SEQ ID NO：9 S11-7-F1 GGCTCAGAACAACTCGGGAATG
SEQ ID NO：10 S11-7-R1 TACGAGACGACGGAAGAAGGAT
SEQ ID NO：11 S11-10-F1 CATAGGTGAAACCTGCGGACTGT
SEQ ID NO：12 S11-10-R1 TGGAACATTGGGAGAAGGGCTA
SEQ ID NO：13 S11-10-F2 GTCAACTGGCTCACCAATGTCA
SEQ ID NO：14 S11-10-R2 AATTCAACAGCCTCATACGATGTCT
SEQ ID NO：15 S11-11-F1 GAAGACGAAATCGACGAACAGT
SEQ ID NO：16 S11-11-R1 GTAAATGCGGCTCAGAACAACT
SEQ ID NO：17 S11-7-F2 GTAGACCCGTTGCAGAATACTAATG
SEQ ID NO：18 S11-7-R2 GTAGACCCGTCGATATTGATGAAGAT
SEQ ID NO：19 S11-10-F3 CTGGGGGTCAATTCGGCTCAT
SEQ ID NO：20 S11-10-R3 GTAGACCCGTTGTTAAGTTGGAGATT
SEQ ID NO：21 S11-11-F2 GCTCGGACGCTCAAGGTATC
SEQ ID NO：22 S11-11-R2 GTAGACCCGTTGCAGAATACTAATG
采用CTAB法提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用上述引物进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测电泳条带。
PCR反应条件如下：
Figure BDA0001606059650000141
PCR反应程序：95℃ 5min；95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min 30sec，共循环35次；72℃ 10min，4℃保存。
1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V 40min；凝胶成像仪(Alphamager)拍摄。
检测结果见图1-9。由电泳图可以看出，除引物S11-2-F3和S11-2-R3(图8)、S11-2-F4和S11-2-R4外(图9)，其他引物的电泳图中不同地域蝉花与单17-7-1菌株都具有一条或者多条相同的电泳条带，其中S11-7-F1和S11-7-R1、S11-11-F1和S11-11-R1PCR结果无条带；只有引物S11-2-F3和S11-2-R3、S11-2-F4和S11-2-R4的电泳图中，蝉花单17-7-1具有一条特异的条带，其片段长度分别为2414bp和2222bp，而其他不同地域的蝉花并不具有，可以明显的区分蝉花单17-7-1与其他不同地域蝉花。
实施例2
以实施例1筛选得到的引物S11-2-F3和S11-2-R3、S11-2-F4和S11-2-R4对蝉花单17-7-1建立对蝉花单17-7-1的鉴定方法。
SCAR分子标记稳定性实验1：
试验操作：
1.CTAB法提取同一批次蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用引物S11-2-F3和S11-2-R3、S11-2-F4和S11-2-R4进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测电泳条带。
2.PCR反应条件如下：
Figure BDA0001606059650000151
PCR反应程序：95℃ 5min；95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min 30sec，共循环35次；72℃ 10min，4℃保存。
3.1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V 40min。
4.凝胶成像仪(Alphamager)拍摄。
实验结果：
以S11-2-F3和S11-2-R3为引物，对同一批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱(图10、图11、图12所示)。
以S11-2-F4和S11-2-R4为引物，对同一批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱(图13、图14、图15所示)。
从电泳图谱上看，以同一批次抽提的DNA为模板，并重复3次，得到主要的扩增片段是一致的。
从以上试验结果可以得出，SCAR标记检测同一批次的DNA多态性是一种稳定的、可靠的方法。
SCAR分子标记稳定性实验2：
试验操作：
1.CTAB法提取不同批次蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用引物S11-2-F3和S11-2-R3、S11-2-F4和S11-2-R4进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测电泳条带。
2.PCR反应条件如下：
Figure BDA0001606059650000161
PCR反应程序：95℃ 5min；95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min 30sec，共循环35次；72℃ 10min，4℃保存。
3.1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V 40min。
4.凝胶成像仪(Alphamager)拍摄。
实验结果：
以S11-2-F3和S11-2-R3为引物，对不同批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱(图16、图17、图18所示)。
以S11-2-F4和S11-2-R4为引物，对不同批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱(图19、图20、图21所示)。
从电泳图谱上看，以不同批次抽提的DNA为模板，并重复3次，得到主要的扩增片段基本是一致的。
从以上试验结果可以得出，SCAR标记检测不同样本DNA多态性是一种稳定的、可靠的方法。
从中可见采用引物S11-2-F3和S11-2-R3、S11-2-F4和S11-2-R4，可以明显的区分蝉花单17-7-1与其他不同地域蝉花的不同，因此利用SCAR分子标记技术并以引物S11作为鉴定蝉花单17-7-1的方法非常可行。
序列表
<110> 浙江泛亚生物医药股份有限公司
<120> 一种蝉花菌株的SCAR分子标记鉴定方法
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtagacccgt gttgtatgac aaact 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtagacccgt aaggagacgg aggat 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctcccgtcg ctcattgtt 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgggcaaat ttcaagcgcc a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcccacaagc ctcctcaaga t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggacacccat actggcacga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccacaagcc tcctcaagat 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcgccagagg gtcatacatt tt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggctcagaac aactcgggaa tg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tacgagacga cggaagaagg at 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cataggtgaa acctgcggac tgt 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggaacattg ggagaagggc ta 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcaactggc tcaccaatgt ca 22
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aattcaacag cctcatacga tgtct 25
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaagacgaaa tcgacgaaca gt 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtaaatgcgg ctcagaacaa ct 22
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtagacccgt tgcagaatac taatg 25
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtagacccgt cgatattgat gaagat 26
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgggggtca attcggctca t 21
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtagacccgt tgttaagttg gagatt 26
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gctcggacgc tcaaggtatc 20
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtagacccgt tgcagaatac taatg 25

Claims (5)

1.一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1，提取待检测菌株的DNA；
步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用下列引物进行PCR扩增：
SEQ ID NO：1：GTAGACCCGTGTTGTATGACAAACT；
SEQ ID NO：2：GTAGACCCGTAAGGAGACGGAGGAT；
步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的电泳条带图谱；
步骤4，将步骤3获得的待检测菌株图谱进行分析获得判定结果；
所述蝉花单17-7-1菌株的保藏号为CGMCC No. 3453。
2.一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1，提取待检测菌株的DNA；
步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用下列引物进行PCR扩增：
SEQ ID NO：3：CCTCCCGTCGCTCATTGTT；
SEQ ID NO：4：TCGGGCAAATTTCAAGCGCCA；
步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的电泳条带图谱；
步骤4，将步骤3获得的待检测菌株图谱进行分析获得判定结果；
所述蝉花单17-7-1菌株的保藏号为CGMCC No. 3453。
3.如权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2所采用的PCR扩增反应体系为：
Figure QLYQS_1
。
4.如权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2所采用的PCR扩增反应条件如下：先95℃5分钟；然后依次95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 2.5分钟，共循环35次；然后72℃延伸10分钟，最后降温至4℃保存。
5. 如权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4中，将步骤3获得的SCAR条带图谱进行分析，待检测菌株在3000bp ~2000bp之间具有一条条带，鉴定待检测菌株为蝉花菌株单17-7-1菌株。
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Genetic diversity of Sinojackia dolichocarpa(Styracaceae),a species endangered and endemic to China,detected by inter-simple sequence repeat(ISSR);Cao PJ等;Biochemical systematics and ecology;全文 *

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