CN105695620A - 一种快速检测冬虫夏草的方法 - Google Patents

一种快速检测冬虫夏草的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种正品冬虫夏草的检测方法，它包括如下步骤：a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA；b，基因扩增：用SEQ ID NO：1～2所示的引物对对待检样本中的DNA进行扩增；c，结果检测：对DNA扩增结果进行检测。本发明正品冬虫夏草的检测方法准确度高，操作方便，成本低廉。

Description

一种快速检测冬虫夏草的方法
技术领域
本发明涉及快速检测冬虫夏草的方法。
背景技术
冬虫夏草Cordyceps是麦角菌科真菌冬虫夏草菌Ophiocordycepssinensis寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫虫体的干燥复合体，具有补肺益肾、止血化痰带的功效，用于治疗肾虚精亏，阳痿遗精，腰膝酸痛，久咳虚喘，劳嗽咯血等症[i]，首载于《本草从新》，是我国名贵中药之一。《本草纲目拾遗》记载为“味甘性温，益气秘精，专补命门，功同人参”。而现代研究表明其具有抗氧化，免疫调节，抑制肿瘤，抗衰老，提高免疫力等作用。
冬虫夏草仅产于海拔3000米以上的高山草甸及灌木丛下，野生资源有限，然而市场需求巨大，导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象严重。常见混淆品有古尼虫草Cordycepsgunnii(Berk.)Berk、蛹虫草Cordycepsmilitaris、凉山虫草CordycepsliangshanensisZang，LiuetHu和蝉花IsariacicadaeMiquel等近缘属种，以及地蚕、白僵蚕等经非法加工染色处理后在形态上与冬虫夏草极其相似的伪品。采用传统的形态鉴别手段难以有效区分，加工品和粉末更是不易鉴别。
如何快速、有效地鉴别真伪，是保证冬虫夏草临床用药安全有效亟需解决的首要问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种正品冬虫夏草的检测方法。
本发明正品冬虫夏草的检测方法，它包括如下步骤：
a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA；
b，基因扩增：用SEQIDNO：1～2所示的引物对对待检样本中的DNA进行扩增；
c，结果检测：对DNA扩增结果进行检测。
步骤a中，提取待检样本DNA的方法为碱裂解法。
所述碱裂解法的步骤为：
取待检样本的粉末，加入8倍体积的碱裂解液，涡旋混匀，100℃孵育30s，所述碱裂解液为添加有1％(v/v)的浓度为1％的TritonX-100溶液、1％(w/v)PVP-40的浓度为0.5mol·L-1的NaOH溶液；加入200μL0.1MTris-HCl溶液涡旋混匀后，12000rpm离心5min；取上清液，即可。
步骤b中，扩增的方法如下：
反应体系为25μL，其中包括模板1μL，2×TaqPCRmastermix12.5μL，引物1μL，ddH2O补足至25μL；
反应程序：94℃预变性1min；94℃变性30s，67℃复性30s，共30个循环。
步骤c中，采用琼脂糖凝胶电泳检测或者荧光检测。
琼脂糖凝胶电泳的步骤为：取扩增产物与1/5体积的6×Loadingbuffer混匀，用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶成像系统拍照观察，即可。
荧光检测的步骤为：取扩增产物，加入1/10体积的100×SYBRGreenI混匀，置紫外灯下观察，即可。
所述待检样本是冬虫夏草、蛹虫草、古尼虫草、凉山虫草和/或蝉花。
本发明方法可以准确检测待检样品是否正品冬虫夏草，准确度高，且检测方法简单、快速，特异性好，灵敏度高，可以替代传统检测方法。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1ITS4/ITS5通用引物PCR，M：DL2000maker；1～9：冬虫夏草；10～13:凉山虫草；14～17：古尼虫草；18～21：蛹虫草；22～24：蝉花；CK：阴性对照；
图2冬虫夏草特异引物扩增。M:DL2000maker；1～2：冬虫夏草；3～4：凉山虫草；5～6：古尼虫草；7～8：蛹虫草；9：蝉花；10：阴性对照；
图3特异引物荧光检视。M:DL2000maker；1～2：冬虫夏草；3～4：凉山虫草；5～6：古尼虫草；7～8：蛹虫草；9：蝉花；CK：阴性对照。
具体实施方式
实验例1本发明检测方法的
1材料
1.1实验材料
冬虫夏草、蛹虫草、古尼虫草、凉山虫草、蝉花，均由成都中医药大学国锦琳教授鉴定，具体见表1，凭证标本保存于成都中医药大学中药资源与鉴定实验室。
表1样品信息表
物种 采集地 鉴定人
冬虫夏草Cordyceps sinensis 四川甘孜 国锦琳
蛹虫草C.militaris 四川绵阳 国锦琳
古尼虫草C.gunni 湖南常德 国锦琳
凉山虫草C.liangshanensis 四川雷波 国锦琳
蝉花C.cicadae 四川成都 国锦琳
1.2实验试剂
氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)购自成都市科龙化工试剂厂；三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-aldrich)；核酸染料gelview购自北京百泰克生物有限公司(Bioteke)；琼脂糖、2×TaqPCRmastermix、6×Loadingbuffer、DNAmaker购自天根生化科技(北京)有限公司，TritonX-100，购自上海索莱宝生物科技有限公司，PVP-40，购自上海江莱生物科技有限公司，100×SYBRGreenI，购自英潍捷基(上海)股份有限责任公司。
1.3实验仪器
HHS-S恒温金属浴，上海光地仪器设备有限公司；ND2000微量核酸蛋白测定仪，美国Thermo中国公司；IcyclePCR扩增仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司(BIO-RAD)；GELDOCEQ凝胶成像系统，伯乐生命医学产品(上海)有限公司(BIO-RAD)；DYY-III-12B型核酸电泳仪，北京六一仪器厂；WH-2微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；ZF-1三用紫外分析仪，上海驰唐电子有限公司。
2实验方法
2.1引物设计
本研究以冬虫夏草ITS序列为目标序列，用MEGA5.0进行序列比对，并利用Primer5.0进行引物设计，同时利用Primer-blast进行引物特异性检验。本研究共设计9对引物，通过筛选得到能特异鉴定冬虫夏草的引物1对，
SI-F6:5’-TTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATT-3’，
SI-R6:5’-GCTTGCTTCTTGACTGAGAGGTGCC-3’。
该对引物的扩增片段长度为174bp。引物由英潍捷基(上海)股份有限责任公司合成，选择PAGE纯化。
2.2基因组DNA的提取及质量检测
取冬虫夏草，使用碱裂解法快速提取总DNA。
碱裂解法快速提取总DNA的方法为：取冬虫夏草样品粉末10mg于1.5mLEP管中，加入80μL碱裂解液(0.5mol·L-1的NaOH，1％(v/v)的1％TritonX-100，1％(0.01g/ml)的PVP-40)涡旋混匀，100℃孵育30s；加入200μL0.1MTris-HCl(pH＝8.0)涡旋混匀后，12000rpm离心5min；取上清液200μL，作模板DNA备用。
使用通用引物ITS4/ITS5(ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3；ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')对模板DNA的质量进行检测。
PCR反应体系为25μL，其中包含10μL2×TaqPCRmastermix、引物1μL模板1μL，ddH2O补足至25μL。反应在BIO-RAD公司的Icycler型PCR仪上进行。反应结束后，取5μL扩增产物与1μL6×Loadingbuffer混匀后用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶成像系统拍照观察并保存。
2.3PCR反应条件考察
利用冬虫夏草特异鉴别引物Si-F6/Si-R6进行SS-PCR反应，并分别考察退火温度；PCR循环数；DNA模板用量；引物浓度；Taqmastermix：Tiangen天根北京生物有限公司、Bioteke百泰克生物有限公司、Sangon生工上海生物有限公司；Bio-Rad公司生产的不同型号PCR仪：T100TMThermalCycler型PCR仪、Icycler型PCR仪、Mycycler型PCR仪对PCR反应稳定性的影响。
2.4SS-PCR引物的种特异性检验
分别以凉山虫草，古尼虫草，蛹虫草，蝉花的DNA为模板，以冬虫夏草DNA为阳性对照，检验冬虫夏草特异片段扩增引物SI-F6和SI-R6的种特异性。反应体系为25μL其中包括，模板1μL，2×TaqPCRmastermix12.5μL，引物1μL，ddH2O补足至25μL。反应程序：94℃预变性1min；94℃变性30s，67℃复性30s，共30个循环。反应在Icycler型PCR仪(BIO-RAD)上进行。反应结束后，取5μL反应产物加入1μL6×Loadingbuffer混匀后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统(BIO-RAD公司)拍照观察并保存。剩余20μL中加入2μL100×SYBRGreenI混匀后，置紫外灯下观察。
2.5灵敏度检测
取冬虫夏草DNA，对模板进行稀释，稀释后进行检测。反应体系为25μL其中包括，模板1μL，2×TaqPCRmastermix12.5μL，引物1μL，ddH2O补足至25μL。反应程序：94℃预变性1min；94℃变性30s，67℃复性30s，共30个循环。反应在Icycler型PCR仪(BIO-RAD)上进行。反应结束后，取5μL反应产物加入1μL6×Loadingbuffer混匀后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统(BIO-RAD公司)拍照观察并保存。
2.6PCR产物序列分析
将特异引物PCR扩增的产物委托英潍捷基(上海)股份有限责任公司进行序列测定，测序结果拼接后与原模板序列采用DNAMAN进行相似性比对分析，检查所得产物是否为ITS序列特异性产物。
3结果与分析
3.1DNA质量检查
为避免假阴性现象的出现，所提取的DNA均使用真菌通用引物进行扩增，以检测DNA提取成功与否。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，利用ITS4/ITS5引物，冬虫夏草及其4个常见混伪品均获得500～750bp大小的扩增产物(图1)，说明提取到的DNA均可满足PCR扩增的要求。
3.2PCR反应条件的确定
实验表明，PCR循环数、退火温度、DNA模板用量、引物用量对SS-PCR反应稳定性有一定的影响，而不同公司的Taqmastermix，不同型号的PCR仪对PCR反应稳定性影响不大，见表2。
表2不同PCR反应条件对冬虫夏草SS-PCR的影响
＊：+：亮条带；Δ：暗条带；-：无条带。
3.3引物特异性验证
本研究针对冬虫夏草ITS序列共设计了9对引物，最后筛选获得特异性最强的快速鉴定引物1对。采用该引物同时扩增不同产地的冬虫夏草和4种常见混伪品，取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，仅冬虫夏草扩增出条带，4种常见混伪品均未扩增出条带(图2)。在扩增产物中加入2μL100×SYBRGreenI，混匀后在紫外下检测，冬虫夏草显示出明亮的绿色荧光，而混伪品不发出荧光(图3)。
3.4灵敏度检测
实验结果现实，在DNA模板浓度为10ng/ml及以上时，可扩增出目的条带，在DNA模板浓度小于1ng/ml时，扩增条带不清晰。
3.5SS-PCR产物测序
通过对SS-PCR扩增产物的双向测序并拼接，将该序列与原模板序列采用DNAMAN进行相似性比对，相似性100％，说明PCR产物的测序结果与原序列一致，该结果可靠。
4讨论
SS-PCR是一种基于序列间差异的基因分型方法，由于该方法只需要进行一次PCR，PCR完成后取产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳条带的有无及所在位置来判断所扩增的DNA模板是否为目的物种。具有操作简单、省时省钱的特点，非常适于中药材尤其是贵重中药材的鉴别。本研究筛选出1对可靠的冬虫夏草的SS-PCR特异引物Si-F6/SiR6，并证明该方法能准确区分冬虫夏草与凉山虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花等。同时在PCR扩增时，因引物退火温度较高，且序列较短，将退火延伸合为一步，采用两步法进行PCR扩增，该结果与三步法一致，进一步缩短了PCR反应时间，整个PCR反应可在1h内完成。
SYBRGreenI是一种结合于dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBRGreenI只有微弱的荧光，与双链DNA结合，荧光大大增强，其荧光信号强度与双链DNA的浓度相关，常用于荧光定量PCR，扩增成功的产物加入SYBRGreenI在紫外下应显示荧光，而未扩增成功的产物则不显示荧光。本研究通过加入SYBRGreenI来检测PCR扩增成功与否，其结果与琼脂糖凝胶电泳检测结果一致。故而可通过加入SYBRGreenI荧光指示剂来代替琼脂糖凝胶电泳检测，进一步节约了时间。该方法摆脱了传统PCR对电泳系统，凝胶成像系统的依赖，同时缩短了整个鉴定的时间，为中药现场鉴定提供了可能。
采用荧光检视代替琼脂糖凝胶电泳检测的关键在于该引物在PCR反应过程中无非特异扩增，同时不产生引物二聚体。只要PCR产物中有dsDNA双链，SYBRGreenI均能与之结合并发出荧光，这就导致若在PCR产物中有引物二聚体的存在，那么采用SYBRGreenI进行荧光检视时则会出现假阳性，这时仍须采用琼脂糖凝胶电泳进行特异片段大小检测来鉴定真伪。
综上，本发明方法有效准确鉴定冬虫夏草的真伪，操作简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高，应用前景良好。

Claims (8)

1.一种正品冬虫夏草的检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA；
b，基因扩增：用SEQIDNO：1～2所示的引物对对待检样本中的DNA进行扩增；
c，结果检测：对DNA扩增结果进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，提取待检样本DNA的方法为碱裂解法。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述碱裂解法的步骤为：
取待检样本粉末，加入8倍体积的碱裂解液，涡旋混匀，100℃孵育30s，所述碱裂解液为添加有1％(v/v)的浓度为1％的TritonX-100溶液、1％(w/v)PVP-40的浓度为0.5mol·L-1的NaOH溶液；加入200μL0.1MTris-HCl溶液涡旋混匀后，12000rpm离心5min；取上清液，即可。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中，扩增的方法如下：
反应体系为25μL，其中包括模板1μL，2×TaqPCRmastermix12.5μL，引物1μL，ddH2O补足至25μL；
反应程序：94℃预变性1min；94℃变性30s，67℃复性30s，共30个循环。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，采用琼脂糖凝胶电泳检测或者荧光检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：琼脂糖凝胶电泳的步骤为：取扩增产物与1/5体积的6×Loadingbuffer混匀，用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶成像系统拍照观察，即可。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：荧光检测的步骤为：取扩增产物，加入1/10体积的100×SYBRGreenI混匀，置紫外灯下观察，即可。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待检样本是冬虫夏草、蛹虫草、古尼虫草、凉山虫草和/或蝉花。
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