CN105063028B - Ssr引物组及利用该引物组构建麦芽指纹图谱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssr10148、HVM68、HVWAXYG和EBmac755；其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP‑M13引物。本发明还提供了一种利用上述SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，包括以下步骤：提取供试样品的DNA、用3条进行引物PCR扩增、毛细管电泳荧光检测、数据分析及图谱构建。利用上述麦芽标准指纹图谱可以进行麦芽品种的鉴定。本发明建立了毛细管电泳技术与SSR荧光标记相结合的高通道麦芽纯度鉴定方法，结果准确可靠，检测效率提高，杜绝麦芽掺假和售假行为出现，从源头上保障啤酒生产企业的产品质量。
Description
技术领域
本发明创造属于生物技术领域，具体涉及一种构建麦芽指纹图谱的方法，尤其涉及一种利用SSR引物构建麦芽指纹图谱，进而进行麦芽品种鉴定的方法。
背景技术
啤酒是以麦芽、酒花、水为主要原料，经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的低酒精度酒。麦芽作为啤酒的主要原料，是大麦经浸麦、发芽、干燥和焙焦等工艺制得的，麦芽的质量直接决定啤酒的质量。麦芽的品种鉴定是评价大麦质量和麦芽质量最重要的指标，二者均是保证啤酒品质的重要指标。由于缺乏麦芽品种鉴定的技术手段，啤酒企业在麦芽采购时不仅蒙受巨大的经济损失，而且掺假的麦芽由于均一性差，将直接影响糖化、过滤和酿造性能，降低啤酒品质，最终影响啤酒企业的品牌形象。因此啤酒行业内急需开发一种麦芽品种的鉴定技术，进而从源头上保障啤酒原料的品质。
近年来以微卫星(SSR)分子标记为基础的大麦、小麦等农作物DNA指纹库的构建已逐步开展，基于聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)技术在大麦遗传多样性及纯度鉴定等方面的研究也有相关报道。传统的SSR操作通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)配合银染分析进行基因多态性分析，方法成熟，却耗时、耗力、非自动化，尤其是进行大规模、多批次的数据收集和分析时，该方法存在相当大的难度：(1)不能准确读出扩增片段大小；(2)不同等位基因的变异难以准确识别；(3)不同批次反应数据难以统一处理。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，毛细管电泳具有高灵敏度、高分辨率、快速、自动化、样品少、应用范围广等优点。毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳在检测时要求引物必须携带荧光检测器能识别的荧光染料，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，通过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小。发明专利ZL201310119954.X公开了“一种小麦SSR指纹图谱构建方法”。所述小麦SSR指纹图谱构建方法包括如下步骤：首先提取供试品种的DNA，然后用13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增；PCR产物经五色荧光毛细管电泳检测构建小麦品种的SSR指纹图谱。该方法提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。然而，与普通引物仅30-50元的成本相比，目前1OD荧光引物的成本过高，约600-1000元。
TP-M13-SSR技术是基于荧光测序技术的SSR扩增产物检测体系，也是SSR技术与荧光自动测序技术的完美整合。M13荧光引物具有通用性，只需合成一次。如果试验中需要增加新的SSR引物时，只要合成普通引物即可，不用再合成新的荧光引物，因此试验成本大幅降低。因此，TP-M13-SSR技术结合了SSR技术与荧光检测的优点——简便、可靠、低成本。发明专利ZL201310127570.2公开了“一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法”。该本发明所述的构建方法，包括如下步骤：1)提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA；2)以亲本材料筛选SSR引物；3)分别利用上述SSR引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA 为模版，进行PCR扩增；4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建枣树SSR标记分子遗传图谱。该发明建立了枣树SSR标记技术体系，获得的SSR标记和核心引物组，具有高效性、稳定性和共显性等优点。但目前还未见关于应用基于毛细管电泳技术的SSR分子标记进行麦芽品种鉴定的报道。
发明内容
针对目前麦芽品种鉴定缺少成本低、灵敏、准确定量检测手段的问题，本发明提供了SSR 引物组以及利用所述SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，该方法基于TP-M13-SSR标记结合毛细管电泳技术，并利用所构建的SSR指纹图谱进行麦芽品种鉴定。
本发明的技术方案是：
SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssr10148、HVM68、HVWAXYG和EBmac755；其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物。所述4对核心SSR引物序列如下：
利用上述SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，包括以下步骤：
(1)提取供试样品的DNA：
取单粒麦芽样品于1.5ml离心管中，约25-45mg，加入7-8mm钢珠，利用ThmorganCK1000D高通量组织研磨仪进行粉碎。样品中加入65℃预热的CTAB提取缓冲液600ul，涡旋混匀裂解样品。由于麦芽中富含蛋白质、多糖、多酚等物质，分离难度大，因此添加4ulβ- 巯基乙醇和1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，防止多酚氧化褐变和DNA降解，有效去除多酚和多糖。65℃水浴15min，期间轻轻摇动混匀。加600ul氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋剧烈混匀20s，使成乳状液。室温下，10000rpm离心10分钟，吸取300ul的上清液到新离心管中，加10ul 的RNaseA放置20min。小心抽取上清液加入预冷的等体积的异丙醇，直至白色线状DNA形成块状沉淀。-20℃条件下放置20分钟以上，10000rpm离心3分钟收集沉淀。加650ul的70％乙醇冲洗液，轻摇几分钟，10000rpm离心2min，弃滤液。打开盖，平放洁净场所挥发乙醇。加适量TE缓冲液溶解DNA，2-8℃保存DNA。
(2)用3条引物PCR扩增：
第1条引物是SSR正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13 引物；第2条引物为正常的SSR反向引物；第3条引物是5'端标记有Alexa Fluor 680荧光的 M13通用引物。所述M13通用引物的引物序列为TGTAAAACGACGGCCAGT。
PCR体系反应体积为20μL，含MgCl2 2.5mmol/L，dNTP 0.20mmol/L，带有M13尾巴序列的特异正向引物0.04μmol/L、反向引物0.16μmol/L，M13荧光引物0.12μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5单位，2×PCR缓冲液(不含Mg2+)，样品DNA10-50ng。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
(3)毛细管电泳荧光检测：
a、制备SLS/DSS混合液：取0.5μl的DSS-400分子量内标，加入39.5μl的SLS甲酰胺上样缓冲液,在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中；
b、样品孔中加入1μl稀释后的PCR产物，加一滴石蜡油覆盖样品；
c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；
d、将上样板和缓冲板放入BECKMAN GeXP遗传分析系统仪(BECKMAN公司，美国)中，进样电压2.0kV，时间30sec；90℃变性120sec；分离电压6.0kV，时间50min。在毛细管凝胶电泳过程中，PCR产物与DSS-400分子量内标的荧光信号均由基因分析仪自动保存。
(4)数据分析和图谱构建：
用GeneMapper-V3.0软件对BECKMAN GeXP遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出不同麦芽的SSR标记片段。利用软件将SSR标记片段与DSS-400分子量内标比较，得到SSR标记片段长度大小，从而构建麦芽品种的标准指纹图谱。
一种利用上述麦芽标准指纹图谱进行麦芽品种鉴定的方法，将待测样品每粒麦芽DNA 的4对SSR引物扩增的电泳图谱分别与麦芽标准指纹图谱相比较，如果待测样品的电泳图谱与已知麦芽品种的标准指纹图谱数据一致，可判定二者为相同品种；如果待测样品的电泳图谱与已知麦芽品种的标准指纹图谱数据有差异，则判定二者为不同麦芽品种。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于TP-M13-SSR标记结合毛细管电泳技术构建麦芽品种指纹图谱的方法，并利用所构建的SSR指纹图谱进行麦芽品种鉴定。本发明为SSR 分子标记技术在麦芽品种鉴定中的推广和应用提供了技术支持，并且提高了品种鉴定的准确性。
(1)该法结合了SSR标记与毛细管荧光检测的优点，克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳的不足，不仅能准确读出产物片段的大小，精确度达到1bp之内，而且成本低廉，极具应用价值。本发明所述的方法只需对M13通用引物标记一次荧光，其他引物都按普通引物合成，大大降低了合成荧光引物的成本。如果试验中需要增加新的SSR引物，不用再合成新的荧光引物，引物数量越多则试验成本降低越显著。
(2)本发明采用特异性的SSR引物组进行麦芽品种鉴定，特异性高，扩增效率好，能快速鉴定麦芽的不同品种，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。该方法可以防止麦芽掺假问题的出现，从源头上保障麦芽的品质，进而保证啤酒的品质，维护啤酒企业的品牌形象。
附图说明
图1为引物scssr10148时麦芽Copeland毛细管电泳图谱；
图2为引物HVM68时麦芽Copeland毛细管电泳图谱；
图3为引物HVWAXYG时麦芽Copeland毛细管电泳图谱；
图4为引物EBmac755时麦芽Copeland毛细管电泳图谱；
图5为引物scssr10148时麦芽Gairdner毛细管电泳图谱；
图6为引物HVM68时麦芽Gairdner毛细管电泳图谱；
图7为引物HVWAXYG时麦芽Gairdner毛细管电泳图谱；
图8为引物EBmac755时麦芽Gairdner毛细管电泳图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
实施例1：构建麦芽SSR指纹图谱
选择21种不同产地的大麦样品，经发芽、干燥后制成麦芽，见表1。
表1.21种麦芽样品
SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssr10148、HVM68、HVWAXYG和EBmac755；其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物。所述4对核心SSR引物序列如下：
利用上述SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，包括以下步骤：
(1)提取供试样品DNA
取单粒麦芽样品于1.5ml离心管中，约25-45mg，加入7-8mm钢珠，利用ThmorganCK1000D高通量组织研磨仪进行粉碎。样品中加入65℃预热的CTAB提取缓冲液600ul，涡旋混匀裂解样品。由于麦芽中富含蛋白质、多糖、多酚等物质，分离难度大，因此添加4ulβ- 巯基乙醇和1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，防止多酚氧化褐变和DNA降解，有效去除多酚和多糖。65℃水浴15min，期间轻轻摇动混匀。加600ul氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋剧烈混匀20s，使成乳状液。室温下，10000rpm离心10分钟，吸取300ul的上清液到新离心管中，加10ul 的RNaseA放置20min。小心抽取上清液加入预冷的等体积的异丙醇，直至白色线状DNA形成块状沉淀。-20℃条件下放置20分钟以上，10000rpm离心3分钟收集沉淀。加650ul的70％乙醇冲洗液，轻摇几分钟，10000rpm离心2min，弃滤液。打开盖，平放洁净场所挥发乙醇。加适量TE缓冲液溶解DNA，2-8℃保存DNA。
(2)PCR扩增：
用3条引物进行PCR扩增，第1条引物是SSR正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物；第2条引物为正常的SSR反向引物；第3条引物是 5'端标记有Alexa Fluor 680荧光的M13通用引物。
PCR体系反应体积为20μL，含MgCl2 2.5mmol/L，dNTP 0.20mmol/L，带有M13尾巴序列的特异正向引物0.04μmol/L、反向引物0.16μmol/L，M13荧光引物0.12μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5单位，2×PCR缓冲液(不含Mg2+)，样品DNA10-50ng。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
(3)毛细管电泳荧光检测：
a、制备SLS/DSS混合液:取0.5μl的DSS-400分子量内标，加入39.5μl的SLS甲酰胺上样缓冲液,在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中；
b、样品孔中加入1μl稀释后的PCR产物,加一滴石蜡油覆盖样品；
c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；
d、将上样板和缓冲板放入BECKMAN GeXP遗传分析系统仪(BECKMAN公司，美国)中，进样电压2.0kV，时间30sec；90℃变性120sec；分离电压6.0kV，时间50min。在毛细管凝胶电泳过程中，PCR产物与DSS-400分子量内标的荧光信号均由基因分析仪自动保存。
(4)数据分析：
用GeneMapper-V3.0软件对BECKMAN GeXP遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出不同麦芽的SSR标记片段。利用软件将SSR标记片段与DSS-400分子量内标比较，得到SSR标记片段长度大小。
(5)图谱构建：根据步骤(4)数据分析的结果，构建21种麦芽样品的SSR指纹图谱(表2)。
分析毛细管电泳结果，根据麦芽样品扩增片段大小确定该位点的等位变异大小。纯合位点的等位变异记录为X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异记录为0/0。由表2可知，4对SSR引物完全可以将21种麦芽分开，如麦芽品种Copeland和Metcalfe高度相似，二者在引物scssr10148、HVWAXYG和EBmac755的扩增上大小完全一致，无法区分，但在HVM68 的扩增产物上大小分别为242/283和242/277，因此可以分开。而麦芽品种Copeland和Baudin 差异很大，4对引物中的任何一对都可以直接把这个两个品种分开，鉴定起来非常容易。因此，对于高度相似的品种可能需要3-4对引物的组合才能分开，而对于差异性很大的品种只需要1-2对引物就可以分开。因此，本发明基于TP-M13-SSR技术结合毛细管电泳技术，成功构建了麦芽品种的SSR标准指纹图谱，利用该指纹图谱可以进行商业麦芽的品种鉴定。该法结果准确可靠，为从源头上保障啤酒企业产品质量提供了技术支持。
表2.21种麦芽样品的SSR标准指纹图谱
实施例2：Copland麦芽品种鉴定
抽检本公司的采购麦芽样品，进行麦芽品种鉴定，确定该样品是否为采购合同规定的 Copeland，随机取样8粒麦芽进行品种鉴定。
SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssr10148、HVM68、HVWAXYG和EBmac755；其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物。所述4对核心SSR引物序列如下：
利用上述SSR引物组进行麦芽品种鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)对样品进行麦芽DNA制备，TP-M13-SSR标记PCR扩增，毛细管电泳检测，数据分析，具体实施步骤如实施例1的步骤(1)-(4)。
(2)结果分析：由图1-4可知，待鉴定的8粒麦芽在4对引物上扩增片段的大小分别一致。其中，引物scssr10148扩增片段大小均为241bp，HVM68扩增片段大小均为242/283，HVWAXYG扩增片段大小均为214bp，EBmac755扩增片段大小均为164bp，四对引物扩增片段大小与Copland的SSR指纹数据完全一致，由此可确定待鉴定的8粒麦芽全部为Copeland。
实施例3：Gairdner麦芽品种鉴定
与实施例2不同的是，
样品本公司抽检的采购麦芽样品，进行麦芽品种鉴定，确定该样品是否为采购合同规定的Gairdner，随机取样8粒麦芽进行品种鉴定。
(1)对样品进行麦芽DNA制备，TP-M13-SSR标记PCR扩增，毛细管电泳检测，数据分析，具体实施步骤如实施例1的步骤(1)-(4)。
(2)结果分析：由图5-8可知，待鉴定的8粒麦芽在4对引物上扩增片段的大小分别一致。其中，引物scssr10148扩增片段大小均为241bp，HVM68扩增片段大小均为202/277，HVWAXYG扩增片段大小均为201bp，EBmac755扩增片段大小均为176bp，四对引物扩增片段大小与Gairdner的SSR指纹数据完全一致，由此可确定8粒待鉴定麦芽品种全部为 Gairdner。
序列表
<110> 青岛啤酒股份有限公司
<120> SSR引物组及利用该引物组构建麦芽指纹图谱的方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> Scssr10148F-M13
<400> 1
TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGCGGCGTGGCGTGTACC 38
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Scssr10148R
<400> 2
TGCTGCGGCTCTGATGCTCC 20
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> HVM68F-M13
<400> 3
TGTAAAACGACGGCCAGTAGGACCGGATGTTGCTGTCG 38
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> HVM68R
<400> 4
GCGTTCTTCGCGCGAGGCT 19
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> HVWAXYGF-M13
<400> 5
TGTAAAACGACGGCCAGTTCCAATGGCATCTACAGGACGGCCAA 44
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> HVWAXYGR
<400> 6
GCAGGTTGAGCTGCGCAAAGTCGTCG 26
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> EBmac755F-M13
<400> 7
TGTAAAACGACGGCCAGTAGCCTTGTGTATCAGGACA 37
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> EBmac755R
<400> 8
CTGCTGGTGTTCTCTAAAAGT 21
Claims (7)
1.利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：
包括以下步骤：(1)提取供试样品的DNA；(2)用3条引物PCR扩增：第1条引物为TP-M13引物；第2条引物为正常的SSR反向引物；第3条引物是5'端标记荧光的M13通用引物；所述M13通用引物的引物序列为TGTAAAACGACGGCCAGT；(3)毛细管电泳荧光检测；(4)数据分析和图谱构建；
其中，所述SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssr10148、HVM68、HVWAXYG和EBmac755；其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物；所述4对核心SSR引物序列如下：
麦芽包括以下20种麦芽：
2.根据权利要求1所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：所述PCR扩增体系反应体积为20μL，含MgCl2 2.5mmol/L，dNTP 0.20mmol/L，带有M13尾巴序列的特异正向引物0.04μmol/L，反向引物0.16μmol/L，M13荧光引物0.12μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5单位，2×PCR缓冲液，所述缓冲液中不含Mg2+，样品DNA10-50ng。
4.根据权利要求1所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：所述步骤(3)包括以下几个步骤：
a、制备SLS/DSS混合液:取0.5μl的DSS-400分子量内标，加入39.5μl的SLS甲酰胺上样缓冲液,在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中；
b、样品孔中加入1μl稀释后的PCR产物,加一滴石蜡油覆盖样品；
c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；
d、将上样板和缓冲板放入BECKMAN GeXP遗传分析系统仪中，进样电压2.0kV，时间30sec；90℃变性120sec；分离电压6.0kV，时间50min。
5.根据权利要求4所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：所述步骤(4)数据分析和图谱构建为：对BECKMAN GeXP遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，得出不同品种麦芽的SSR标记片段；将SSR标记片段与DSS-400分子量内标比较，得到SSR标记片段长度大小，从而构建麦芽品种指纹图谱。
6.根据权利要求1所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：所述第3条引物是5'端标记有Alexa Fluor 680荧光的M13通用引物。
7.一种利用权利要求1所述的方法进行麦芽品种鉴定的方法，其特征在于：将待测样品每粒麦芽DNA的4对SSR引物扩增的电泳图谱分别与麦芽标准指纹图谱相比较，如果待测麦芽的电泳图谱与已知麦芽品种的标准指纹图谱数据一致，可判定二者为相同品种；如果待测麦芽的电泳图谱与已知麦芽品种的标准指纹图谱的数据有差异，则判定二者为不同的麦芽品种。
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