CN106282398B - 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用 - Google Patents

柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106282398B
CN106282398B CN201610982640.6A CN201610982640A CN106282398B CN 106282398 B CN106282398 B CN 106282398B CN 201610982640 A CN201610982640 A CN 201610982640A CN 106282398 B CN106282398 B CN 106282398B
Authority
CN
China
Prior art keywords
citrus
foot rot
probe
primer
rot pathogen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610982640.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106282398A (zh
Inventor
程保平
彭埃天
赵弘巍
宋晓兵
凌金锋
陈霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences filed Critical Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201610982640.6A priority Critical patent/CN106282398B/zh
Publication of CN106282398A publication Critical patent/CN106282398A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106282398B publication Critical patent/CN106282398B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用。本发明设计了柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的双重数字PCR定量检测试剂组合物。该试剂盒包含：柑橘病样DNA提取试剂、数字PCR反应试剂、柑橘炭疽病和柑橘脚腐病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板。应用本发明试剂盒检测柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌具有特异性强、抗杂质干扰更好、简便快速、检测灵敏度与实时荧光定量PCR检测方法相当等优点，可用于柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的早期定性、定量检测以及流行病学调查等。

Description

柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于植物病害检测技术领域，具体涉及一种柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用。
技术背景
柑橘炭疽病和柑橘脚腐病是柑橘上的两种重要病害，其病原均为菌丝状病原菌。Colletotrichum gloeosporioides为炭疽菌属真菌，该菌不仅可使柑橘地上部分的各个部位发病，造成柑橘树势衰弱及减产减收，还可引起贮藏期果实大量腐烂。Phytophthora capsici为疫霉属卵菌，可导致柑橘茎基腐、流胶、叶斑、技梢枯及根腐等症状。近期调研发现此二种病原菌在我国柑橘产区的发病率不断上升（B. P. Cheng et al. 2014, PlantDisease; 陈国庆. 2010），二者复合侵染的情况越来越多，针对此二种病害建立快速定量检测方法有助于掌握其在我国的流行趋势和危害程度，及时发出病害预警，从而为我国柑橘产业的健康、持续发展提供保障。
针对Colletotrichum gloeosporioides的检测，目前已有核酸杂交和脉冲场电泳的方法，但非常繁琐，普通PCR可用于该菌的检测，但检测灵敏度不足。Phytophthora capsici的检测，目前已有普通PCR、环介导等温扩增技术和实时荧光定量PCR的方法。但普通PCR检测灵敏度不足，环介导等温扩增技术无法精确定量，而实时荧光定量PCR方法在定量分析时，需要依赖标准物质和标准曲线，仅能实现相对定量分析；另外，实时荧光定量PCR对反应扩增效率要求很高，且易受柑橘样品DNA纯度和PCR抑制因子等因素的影响，导致对目标序列定量的不准确估计。此外，基于实时荧光定量PCR的复合多靶标体系的优化非常困难，定量分析通量较低。因此，现有方法已不能完全满足柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌高灵敏度定量检测的需求。
本发明开发了一套柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法，与现有技术相比，新开发的检测方法具有如下几个方面的优点。1.可进行简便可靠的绝对定量：本方法所使用的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法采用了数字检测芯片系统，其数字PCR的检测芯片微孔数远大于样品中病原菌的靶标拷贝数，该方法通过样品极限稀释、泊松分布和终点法PCR，来实现核酸的绝对定量，因此本方法的靶标定量检测不依赖于扩增曲线的阈值，不受PCR扩增效率的影响，也不需建立标准曲线，不需进行复杂的转化运算，因此更加简便的实现绝对定量分析，并具有更好的检测准确度和重现性。2.抗杂质干扰能力强，检测灵敏度高：本发明的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法，可将每个样品分成20,000多个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，这种方法可在很大程度上把柑橘样品中的杂质及柑橘基因组与病原菌靶标隔离开，极大的减少了其他物质的干扰；由于该技术使每一出现阳性荧光的微孔对应一个病原菌靶标拷贝，因此即使检测体系中仅有一个靶标拷贝也可以很好的检出。3.高特异性：本发明根据柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的特有序列设计了特异性引物和特异探针，其特异性高，且非常稳定，保证了反应的顺利进行，进一步确保柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌检出的特异性。4.功能更多：本发明同时使用柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的特异性引物和不同荧光标记的特异探针，结果读取时使用两个不同的荧光检测通道，可在一次实验可同时检出2种病原菌，减少了实验时间和步骤。5.检测速度快：本发明提供的方法和试剂盒方便快捷，整个检测时间仅需要数小时，节省大量人力成本和时间成本。
根据检索相关的研究及专利文献,未见有柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测的相关文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强、扩增效果好的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测引物及其检测试剂盒；通过如下技术方案实现：
柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌检测引物，其核苷酸序列为：
（1）柑橘炭疽病菌的特异引物及探针为：
上游引物TJB1-F：5'-CAGCCGATGTAGGCCCTC-3'
下游引物TJB1-R：5'-AGGTCAACCTTTGGAAAATTG-3'
探针TJB1-P：FAM 5’-AGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATC-3’ BHQ
所述探针5’ 端荧光报告基因为FAM，3’ 端淬灭基团为BHQ；
（2）柑橘脚腐病菌的特异引物及探针为：
上游引物JFB1-F：5'-TGTTACGGACCAAGAGTCTTTC-3'
下游引物JFB1 -R：5'-GCAATAGTTAGCTCCCTTCTGTA -3'
探针JFB1 -P：HEX 5'-CAAGCAGTGGCTGCATGAGATCG-3' BHQ
所述探针5’端荧光报告基因为HEX，3’端淬灭基团为BHQ。
本发明的另一目的在于，提供一种柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒。该试剂盒含有上述柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌引物对；其具体组分为：病样DNA提取试剂盒、数字PCR反应试剂；
（1）病样DNA提取试剂盒：2% CTAB 溶液、巯基乙醇、酚/氯仿溶液以及无水乙醇溶液；
（2）数字PCR反应试剂：1mL的ddH2O 1支，1mL 的2×3D Digital PCR Master Mix3支，200μL 浓度为10μmol/L的引物TJB1-F、TJB1-R、JFB1-F、JFB1-R各1支，200μL 浓度为10μmol/L的探针TJB1-P以及JFB1-P各1支，1mL柑橘炭疽病阳性对照样品模板、柑橘脚腐病阳性对照样品模板以及阴性对照样品模板各1支。
该试剂盒的具体使用步骤为：
（1） 提取柑橘病样DNA：
a)采集柑橘病样200mg，加液氮研磨成粉末状；
b)研磨粉末加入500μl的CTAB提取缓冲液及5μL巯基乙醇，震荡混匀，65℃水浴20分钟，12000 r/min,离心10 分钟；
c) 吸取上清液，加入等体积的酚/氯仿溶液,混匀，4℃，12000 r/min，离心10min；
d)吸取上清，加入等体积无水乙醇，12000 r/min,离心10 min；
e)弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
f)室温下干燥沉淀，溶于40μl去离子水，即提取得到样品DNA。
（2）配置数字PCR反应体系：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针TJB1-P、JFB1-P各0.3μL，10μM的引物TJB1-F、TJB1-R、JFB1-F、JFB1-R各0.6μL，柑橘病样DNA模板3μL，其余用ddH2O补足至16μL。
（3）PCR扩增：96℃预变性10min；98℃，变性30s，60℃延伸2min，共进行40个循环；最后10℃停止反应。
（4）检测扩增产物的荧光信号，确定柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的靶标的拷贝数：扩增产物荧光信号的检测方式为读取FAM与VIC通道的荧光信号，通过QuantStudio™3D Digital PCR机载软件进行定量分析，计算靶标拷贝数。
本发明的有益效果在于：
（1）可进行简便可靠的绝对定量：本方法所使用的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法采用了数字检测芯片系统，其数字PCR的检测芯片微孔数远大于样品中病原菌的靶标拷贝数，该方法通过样品极限稀释、泊松分布和终点法PCR，来实现核酸的绝对定量，因此本方法的靶标定量检测不依赖于扩增曲线的阈值，不受PCR扩增效率的影响，也不需建立标准曲线，不需进行复杂的转化运算，因此更加简便的实现绝对定量分析，并具有更好的检测准确度和重现性。
（2）抗杂质干扰能力强，检测灵敏度高：本方法的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法，可将每个样品分成20,000多个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，这种方法可在很大程度上把柑橘样品中的杂质及柑橘基因组与病原菌靶标隔离开，极大的减少了其他物质的干扰，由于该技术使每一出现阳性荧光的微孔对应一个病原菌靶标拷贝，因此即使检测体系中仅有一个靶标拷贝也可以很好的检出。
（3）高特异性：本发明根据柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的特有序列设计了特异性引物和特异探针，其特异性高，且非常稳定，保证了反应的顺利进行，进一步确保柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌检出的特异性。
（4）功能更多：本发明同时使用柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的特异性引物和不同荧光标记的特异探针，结果读取时使用两个不同的荧光检测通道，可在一次实验可同时检出2种病原菌，减少了实验时间和步骤。
（5）检测速度快：本发明提供的方法和试剂盒方便快捷，整个检测时间仅需要数小时，节省大量人力成本和时间成本。
综上，本发明试剂盒和方法可以满足柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的早期、准确、定量分析的要求，可为柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的早期、精确和定量检测、流行病学调查提供科学依据，具有良好的发展应用前景。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体的实施例做进一步说明，下列具体实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1：引物初步筛选及检测。
利用primer primer5软件检测引物间的互补性及引物退火温度，选择退火温度适宜、扩增的目的片段易于区分的引物对。本发明针对柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌各设计2对引物和探针。
本实施例给出了筛选最佳引物的过程，用于筛选的备选引物如下，见表1。
表1 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的备选引物序列
用于备选的引物及探针组合包括：TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，TJB 2-F+ TJB2-R+ TJB 2-P，JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P，JFB 2-F+ JFB 2-R+ JFB2-P，使用探针法荧光定量PCR分别进行特异性分析，20μL的反应体系，Premix Ex Taq缓冲液10μL、模板3μL，引物终浓度500 nM，探针终浓度250 nM，补ddH2O至20 μL。PCR反应程序：95℃预变性20s，然后95℃ 5s，60℃ 40s，40个循环，最后10℃停止反应。其Ct值如表2所示，因此根据实验结果选择检测效果更好的TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，和JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P的引物与探针组合。
表2 不同引物对荧光定量PCR中的Ct值
实施例2：引物特异性分析
为验证本发明定量检测方法对柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌检测的特异性，分别运用TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，和JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P的引物与探针组合对柑橘炭疽病和柑橘脚腐病病样进行检测。运用数字定量PCR体系配方：2×3D Digital PCRMaster Mix 8.0μL，10μM的探针和引物TJB 1-F、TJB 1-R、TJB 1-P、JFB1-F、JFB 1-R、JFB1-P各0.2μL，柑橘病样DNA模板3μL，其余用ddH2O 补足至16μL。数字PCR扩增反应程序为：96℃预变性10min；98℃变性30s；60℃延伸2min，共进行40个循环，最后10℃停止反应。在FAM通道下检测本研究室保存的柑橘溃疡病病样、柑橘炭疽病病样、柑橘脚腐病病样、柑橘衰退病病样、柑橘裂皮病病样、柑橘黄龙病病样、柑橘炭疽病阳性对照样品、健康柑橘阴性对照样品的荧光信号，结果显示：柑橘炭疽病病样与柑橘炭疽病阳性对照样品为阳性，其余样品显示阴性。在VIC通道下检测本研究室保存的柑橘溃疡病病样、柑橘炭疽病病样、柑橘脚腐病病样、柑橘衰退病病样、柑橘裂皮病病样、柑橘黄龙病病样、柑橘脚腐病阳性对照样品、健康柑橘阴性对照样品的荧光信号，结果显示：柑橘脚腐病病样和脚腐病阳性对照样品为阳性，其余样品显示阴性，实验结果见表3。该实验表明TJB1-F+TJB1-R+TJB1-P，和JFB1-F+JFB1-R+JFB1-P的引物与探针组合有较好的检测特异性。
表3 数字PCR定量检测方法的检测特异性验证
实施例3：不同退火温度对柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR反应的影响.
运用TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，和JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P的引物与探针组合。运用数字定量PCR体系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针和引物TJB 1-F、TJB 1-R、TJB 1-P、JFB1-F、JFB 1-R、JFB 1-P各0.2μL，柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌复合侵染病样DNA模板3μL，其余用ddH2O补足至16μL。PCR扩增反应程序为：96℃预变性10min，98℃变性30s，然后分别在温度梯度（56，58，60，62）下退火延伸2min，共进行40个循环；最后10℃停止反应。
结果：不同退火温度下，FAM信号通道或VIC检测通道中的检测值差异不大，根据实验结果选择60℃的退火延伸温度。
实施例4：不同引物和探针浓度对柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR反应的影响.
运用不同浓度组合的TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，和JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P进行数字PCR检测。运用数字定量PCR体系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，引物探针TJB 1-F、TJB 1-R、TJB 1-P、JFB1-F、JFB 1-R、JFB 1-P浓度均为10μmol/L，加入不同体积的引物和探针，柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌复合侵染病样DNA模板3μL，其余用ddH2O 补足至16μL。PCR扩增反应程序为：96℃预变性10min；98℃，变性30s；60℃退火延伸2min，共进行40个循环，最后10℃停止反应。所使用的引物、探针量以及试验结果如表4所示。
表4 双重PCR体系中不同浓度的引物与探针组合。
根据实验结果，选择最佳的第3个组合。
实施例5：柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法的建立
1、双重数字PCR定量检测试剂盒的组装
柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测试剂盒，该试剂盒包含：柑橘病样DNA提取试剂、数字PCR反应试剂。
所述DNA提取液包括：2% CTAB 溶液 [2% CTAB (w/v), 100 mM Tris-HCl (pH8.5), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1% (v/v) PVP]；巯基乙醇；酚/氯仿溶液；无水乙醇溶液。
所述PCR反应试剂包括：1mL的ddH2O 1支，1mL 的2×3D Digital PCR Master Mix3支，200μL 浓度为10μmol/L的引物TJB1-F、TJB1-R、JFB1-F、JFB1-R各1支，200μL 浓度为10μmol/L的探针TJB1-P以及JFB1-P各1支，1mL柑橘炭疽病阳性对照样品模板、柑橘脚腐病阳性对照样品模板以及阴性对照样品模板各1支。
所述引物与探针的序列为：
柑橘炭疽病菌的特异引物及探针为：
上游引物TJB1-F：5'-CAGCCGATGTAGGCCCTC -3'
下游引物TJB1-R：5'-AGGTCAACCTTTGGAAAATTG-3'
探针TJB1-P：FAM 5’-AGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATC-3’ BHQ
所述探针5’ 端荧光报告基因为FAM，3’ 端淬灭基团为BHQ；
柑橘脚腐病菌的特异引物及探针为：
上游引物JFB1-F：5'-TGTTACGGACCAAGAGTCTTTC-3'
下游引物JFB1 -R：5'-GCAATAGTTAGCTCCCTTCTGTA -3'
探针JFB1 -P：HEX 5'-CAAGCAGTGGCTGCATGAGATCG-3' BHQ
所述探针5’端荧光报告基因为HEX，3’端淬灭基团为BHQ。
2、一种柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法，其具体检测方法包括如下步骤：
（1）提取柑橘病样DNA：
a)采集柑橘病样200mg，加液氮研磨成粉末状；
b)研磨粉末加入500μl的CTAB提取缓冲液及5μL巯基乙醇，震荡混匀，65℃水浴20min，12000 r/min,离心10 min；
c)吸取上清液，加入等体积的酚/氯仿溶液,混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min；
d)吸取上清，加入等体积无水乙醇，12000 r/min,离心10 min；
e) 弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
f)室温下干燥沉淀，溶于40μl去离子水，即提取得到样品DNA。
（2）配置数字PCR反应体系：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针TJB1-P、JFB1-P各0.3μL，10μM的探针TJB1-F、TJB1-R、JFB1-F、JFB1-R、各0.6μL，柑橘病样DNA模板3μL，其余用ddH2O补足至16μL。
（3）PCR扩增：96℃预变性10min；98℃，变性30s，60℃延伸2min，共进行40个循环；最后10℃停止反应。
（4）检测扩增产物的荧光信号，确定柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的靶标的拷贝数：扩增产物荧光信号的检测方式为读取FAM与VIC通道的荧光信号，通过QuantStudio™3D Digital PCR机载软件进行定量分析，计算靶标拷贝数。
实施例6柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法与荧光定量PCR检测方法的对比分析
为比较本检测方法与荧光定量PCR检测方法的检测效果，提取柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌复合侵染样品的DNA模板，然后10 倍梯度稀释为10-1至10-4等系列稀释液，作为PCR的模板。以本试剂盒中二个病害病样的阴性对照模板和阳性对照模板为参照，使用柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法对两种病原菌进行同时检测，实验检测方法及体系参照本发明前述说明。同时作为对照，分别使用柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌荧光定量PCR检测方法对两种病原菌进行分别检测，所用的引物及探针组合为：TJB 1-F+TJB 1-R+ TJB 1-P，和JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P，16μL的反应体系，Premix Ex Taq缓冲液8μL、模板3μL，10μmol/L引物各0.6 μL，10μmol/L探针各0.3μL，补ddH2O至16μL。PCR反应程序：95℃预变性20s，然后95℃ 5s，60℃ 40s，40个循环，最后10℃停止反应。实验结束后，记录检测结果。
结果发现：两类检测方法均对柑橘炭疽病和柑橘脚腐病罹病样品检出阳性结果。本发明所用的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法在样品稀释梯度为10-1至10-3的3个DNA模板中可检出阳性结果(表5)；柑橘炭疽病菌荧光定量PCR检测方法和和柑橘脚腐病菌荧光定量PCR检测方法同样可在10-1至10-3的3个稀释度DNA 模板中检出阳性结果。其中，在10-3稀释的cDNA模板中每微升可检到约4.637个柑橘炭疽病菌靶标和3.813个柑橘脚腐病菌靶标拷贝。以上结果表明本发明所采用的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法的检测灵敏度与柑橘炭疽病菌及柑橘脚腐病菌荧光定量PCR检测方法相当，但与柑橘炭疽病菌及柑橘脚腐病菌荧光定量PCR检测方法相比，本发明所用的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法的优点在于：1. 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病实时荧光定量PCR方法在定量分析时，需要依赖标准物质和标准曲线，仅能实现相对定量分析，本发明所用的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法通过样品极限稀释、泊松分布和终点法PCR，来实现核酸的绝对定量，因此本方法的靶标定量检测不依赖于扩增曲线的阈值，不受PCR扩增效率的影响，也不需建立标准曲线，不需进行复杂的转化运算，因此更加简便的实现绝对定量分析。2. 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌荧光定量PCR检测只能分别检测两种病原菌。如果把两种病原菌的引物和探针混杂在一起，会产生较大的互相干扰，因此其复合多靶标体系的优化非常困难；而本方法的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法，可将每个反应体系分成20,000多个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，这种方法可把两个病原菌的引物和探针进行较大的分割，显著减少了引物间的相互干扰，因此复合多靶标体系容易优化，从而实现两种病原菌的同时检测。
表5 两种病原菌检测方法的检测灵敏度对比研究。
实施例7. 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法对田间实际样品的检测
于广东柑橘产区采集疑似柑橘炭疽病和柑橘脚腐病的5个柑橘病样，参照实施例5，提取病样DNA作为模板，并用本发明所述的柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重数字PCR定量检测方法进行检测，同时设置柑橘炭疽病和柑橘脚腐病阳性对照样品及健康柑橘阴性对照，结果表明：1、4号病样复合感染柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌，2、3、5号样品仅感染柑橘炭疽病菌；柑橘炭疽病和柑橘脚腐病阳性对照及健康柑橘阴性对照可正确检测；进一步通过柑橘炭疽病菌荧光定量PCR检测方法和柑橘脚腐病菌荧光定量PCR检测方法进行验证，结果完全一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院植物保护研究所
<120> 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用
<130> 12
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> TJB1-F
<400> 1
cagccgatgt aggccctc 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> TJB1-R
<400> 2
aggtcaacct ttggaaaatt g 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> TJB1-P
<400> 3
agtaacttta cgtctcgcac tgggatc 27
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> JFB1-F
<400> 4
tgttacggac caagagtctt tc 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> JFB1 -R
<400> 5
gcaatagtta gctcccttct gta 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> JFB1 -P
<400> 6
caagcagtgg ctgcatgaga tcg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> TJB2-F
<400> 7
catcgaatct ttgaacgcac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> TJB2-R
<400> 8
cccaacacca agcagagctt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> TJB2-P
<400> 9
agcattctgg cgggcatgcc t 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> JFB2-F
<400> 10
ttgtgctaat tatcttgtgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> JFB2-R
<400> 11
tcttggtccg taacatcgta 20
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> JFB2-P
<400> 12
ccgcacaatt actagcagct actacc 26

Claims (5)

1.柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌检测引物及探针，其特征在于，其核苷酸序列为：
柑橘炭疽病菌的特异引物及探针为：
上游引物TJB1-F：5'-CAGCCGATGTAGGCCCTC-3'
下游引物TJB1-R：5'-AGGTCAACCTTTGGAAAATTG-3'
探针TJB1-P：FAM 5’-AGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATC-3’ BHQ
所述探针5’ 端荧光报告基因为FAM，3’ 端淬灭基团为BHQ；
柑橘脚腐病菌的特异引物及探针为：
上游引物JFB1-F：5'-TGTTACGGACCAAGAGTCTTTC-3'
下游引物JFB1 -R：5'-GCAATAGTTAGCTCCCTTCTGTA -3'
探针JFB1 -P：HEX 5'-CAAGCAGTGGCTGCATGAGATCG-3' BHQ
所述探针5’端荧光报告基因为HEX，3’端淬灭基团为BHQ。
2.一种柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1所述的引物及探针；其具体组分为： 病样DNA提取试剂盒、数字PCR反应试剂；
(1) 病样DNA提取试剂盒：2% CTAB 溶液、巯基乙醇、酚/氯仿溶液以及无水乙醇溶液；
(2) 数字PCR反应试剂：1mL的ddH2O 1支，1mL 的2×3D Digital PCR Master Mix 3支，200μL 浓度为10μmol/L的引物TJB1-F、TJB1-R、JFB1-F、JFB1-R各1支，200μL 浓度为10μmol/L的探针TJB1-P以及JFB1-P各1支，1mL柑橘炭疽病阳性对照样品模板、柑橘脚腐病阳性对照样品模板以及阴性对照样品模板各1支。
3.如权利要求2所述的一种柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒的应用，其特征在于，其具体检测方法包括如下步骤：
（1）提取柑橘病样DNA；
（2）配置数字PCR反应体系；
（3）数字PCR扩增；
（4）检测扩增产物的荧光信号，确定柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌的靶标的拷贝数。
4.如权利要求3所述的一种柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒的应用，其特征在于，所述数字PCR的反应条件为：96℃预变性10min；98℃，变性30s，60℃延伸2min，共进行40个循环；最后10℃停止反应。
5.如权利要求3所述的一种柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒的应用，其特征在于，所述扩增产物荧光信号的检测方式为读取FAM与HEX通道的荧光信号，进行定量分析，计算靶标拷贝数。
CN201610982640.6A 2016-11-09 2016-11-09 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用 Active CN106282398B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610982640.6A CN106282398B (zh) 2016-11-09 2016-11-09 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610982640.6A CN106282398B (zh) 2016-11-09 2016-11-09 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106282398A CN106282398A (zh) 2017-01-04
CN106282398B true CN106282398B (zh) 2019-05-21

Family

ID=57721050

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610982640.6A Active CN106282398B (zh) 2016-11-09 2016-11-09 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106282398B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113699033A (zh) * 2021-08-10 2021-11-26 上海交通大学 一种基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置和分析方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974651A (zh) * 2010-12-02 2011-02-16 中国农业科学院植物保护研究所 辣椒疫霉荧光定量pcr检测法及检测试剂盒
CN104846094A (zh) * 2015-05-13 2015-08-19 青岛农业大学 草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974651A (zh) * 2010-12-02 2011-02-16 中国农业科学院植物保护研究所 辣椒疫霉荧光定量pcr检测法及检测试剂盒
CN104846094A (zh) * 2015-05-13 2015-08-19 青岛农业大学 草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
柑橘脚腐病菌的鉴定及柑橘种质的抗性测定;闫化学等;《热带农业科学》;20160115;第36卷(第1期);30-34 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106282398A (zh) 2017-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112501268A (zh) 一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用
CN108504778A (zh) 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及应用
CN106399547B (zh) 柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重检测试剂盒及其应用
CN112359125A (zh) 一种快速检测格特隐球菌的方法
CN109593847B (zh) 检测微卫星nr24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
CN106148484B (zh) 一种诊断y染色体微缺失的试剂盒
CN106282398B (zh) 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用
CN106399536A (zh) 体液循环dna定量检测方法及试剂盒
CN105567874A (zh) 猪德尔塔冠状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及非诊断性检测方法
CN110499370A (zh) 一种基于rpa技术检测爪哇根结线虫的引物和探针
CN110564882B (zh) 一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法
CN107475253B (zh) 微卫星不稳定性位点-bat26位点的检测引物、扩增体系及检测试剂盒
CN105200122B (zh) 小麦条锈菌的定量检测试剂盒及其应用
CN107385067A (zh) 一种基于TaqMan探针实时荧光定量PCR技术的川贝母物种特异性检测的方法
CN110551837A (zh) 一种马梨形虫病巢式pcr检测方法
CN102899397B (zh) 基于dna分析的羊毛羊绒定量检测方法
CN106244732B (zh) 柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒及其应用
CN110643730B (zh) 一种用于检测小麦赤霉病病原禾谷镰孢菌的rpa引物、探针及检测方法
CN101974621A (zh) 一种牛巴贝斯虫lamp检测方法
CN106755392B (zh) 藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法
CN107435064B (zh) 小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法
CN117025807B (zh) RPA-CRISPR/Cas12a引物组、gRNA和探针、试剂盒和检测方法
CN109504772A (zh) 一种基于数字pcr平台pole基因突变的检测方法
CN114908084B (zh) 尖端赛多孢子菌、土曲霉、构巢曲霉的引物探针及其应用
CN113564263B (zh) 一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20170104

Assignee: Dongyuan County Shenlan Agricultural Technology Development Co.,Ltd.

Assignor: PLANT PROTECTION Research Institute GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2022440000120

Denomination of invention: Dual detection kit for citrus anthracnose and citrus foot rot and its application

Granted publication date: 20190521

License type: Common License

Record date: 20220907

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract