CN110499370A - 一种基于rpa技术检测爪哇根结线虫的引物和探针 - Google Patents

一种基于rpa技术检测爪哇根结线虫的引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供1套利用RPA快速技术检测爪哇根结线的引物、探针及方法，其中1对引物序列如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示，探针序列如SEQ ID No:7所示。利用本发明的引物和探针进行RPA反应后检测爪哇根结线虫，不仅快速、简便、易操作，检测结果可视化，而且可以摆脱对PCR仪等精密仪器和专业技术背景的依赖，本发明在爪哇根结线虫的田间快速诊断、病原鉴定方面广阔的应用前景。

Description

一种基于RPA技术检测爪哇根结线虫的引物和探针
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一套利用重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase plolymerase amplification，RPA)结合侧向试流试纸条(Lateral flowstrips)检测爪哇根结线虫的引物、探针及方法。
背景技术
爪哇根结线虫(Meloidogyne.javanica)是危害最严重的根结线虫之一，在我国的广东、海南、广西、云南等地分布较广。根结线虫的寄主范围很广，可寄生蔬菜、中草药、果树等2000多种植物。线虫寄生植物根系，在植物根系形成巨大的根结，不仅掠夺植物营养，影响植物正常发育，而且容易引起其他根部病害的复合侵染。
传统上根结线虫的检测和鉴定主要基于形态学、同工酶技术以及PCR技术，这些技术对操作人员的专业素质要求高，需要高级显微镜、PCR仪等昂贵仪器，且耗时长，难以应用于田间快速诊断。RPA(Recombinase Polymerase Amplifcation) 是一项利用重组酶聚合酶等温扩增的技术，该技术可以在37℃至42℃的恒温条件下，利用1对引物在算时间内实现核酸靶标片段的快速扩增，结合侧向试纸条检测，可以无需任何精密仪器，实现核酸的扩增和结果的可视化检测，相比另一种环等温扩增扩增技术LAMP，其反应时间更短，反应温度低，且扩增后产生单一目的条带，具有十分广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用RPA技术检测爪哇根结线虫的特异性引物、探针及方法，不依赖精密的科学仪器和专业技术背景，实现对爪哇根结线虫的快速可视化检测。
本发明提供的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No:3所示，反向引物如SEQID No:4所示，探针序列如SEQ ID No:7所示。
所述反向引物的5’端标记生物素Biotin基团；所述探针5’端标记荧光素 FAM基团，第33位的鸟嘌呤被替换为dSpacer，3’端添加C3Spacer。
本发明还提供了一种利用重组酶聚合酶等温扩增技术结合侧向试纸条检测技术快速检测爪哇根结线虫的方法：RPA反应使用nfo kit，反应总体系为50μL，首先在0.2ml的PCR管中加入缓冲液29.5μL，10μM的上下游引物各2.1μL，10μM的探针0.6μL，DNA模板1μL，ddH2O 12.2μL，混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的反应管中混匀，加入280mM的MgAc溶液2.5μL，将反应管置于金属浴中，38℃反应30分钟，反应产物使用侧向流试纸条进行检测。
本发明根据通过比对不同根结线虫基因组序列设计并筛选出一套利用RPA 特异性检测爪哇根结线虫的引物和探针，利用该引物和探针，以爪哇根结线虫 DNA为模板进行反应，反应产物使用侧向流试纸条检测，阳性指示带显色；利用本发明提供的方法，检测其他线虫DNA，阳性指示条带不显色，表明本发明提供的RPA检测方法特异性高；同时，本发明提供的RPA检测的灵敏度为 10pg/μL。
附图说明
图1为爪哇根结线虫RPA检测引物和探针的设计和筛选
A为引物的筛选，M：DL2000 DNA Marker；1-3：引物MJ1RPAF/MJ1RPAR， MJ2RPAF/MJ2RPAR，MJ3RPAF/MJ3RPAR扩增结果。
B为加入探针后使用侧向流试纸条检测结果。CK为清水对照；1-3：爪哇根结线虫DNA为模板的检测结果。
图2为引物和探针特异性检测。其中CK为清水对照；1-2：爪哇根结线(Mj1， Mj2)；3-11：南方根结线虫(Mi1，Mi2)，花生根结线虫(Ma1，Ma2)，禾谷孢囊线虫(Ha1)，菲利普孢囊线虫(Hf1)，大豆孢囊线虫(Hg1)，贝西滑刃线虫 (Ab1)，落选短体线虫(Pn1)。
图3为引物灵敏度检测结果。
A为RPA检测结果。CK：清水对照；1-6：DNA模板浓度1ng/μL，100pg/μL， 10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL。
B为普通PCR检测结果；M：DL2000 DNA Marker；1-7：DNA模板浓度 1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL，阴性对照(清水)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步阐述本发明，但并不是对本发明的限制，仅作为实例。
实施例1爪哇根结线虫RPA扩增引物的设计和检测方法的建立
1.1爪哇根结线虫RPA引物的设计和筛选根据爪哇根结线虫基因组序列，设计了3对适用RPA反应的引物(表1)。
表1：用于RPA检测爪哇根结线虫引物的筛选
1.2爪哇根结线虫DNA模板的制备：收集爪哇根结线虫2龄幼虫入1.5mL离心管中，经5000rpm离心10分钟后，使用移液器尽量吸去管中的水，将离心管放入液氮中速冻30s后，使用研磨杵进行研磨，研磨后的匀浆使用动物基因组DNA 快速抽提试剂盒(上海生工)提取线虫DNA。
1.3 RPA反应体系：反应使用Basic kit，反应总体系为50μL，首先在0.2ml的PCR管中加入缓冲液29.5μL，10μM的上下游引物各2.4μL，DNA模板1μL，ddH2O 12.2μL，用移液器吸打混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的反应管中，并用移液器混匀，最后加入280mM的MgAc溶液2.5μL。
1.4 RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于39℃的金属浴中孵育30min，得到RPA扩增产物。
1.5 RPA扩增产物的电泳检测
RPA反应结束后，使用PCR产物纯化试剂盒(OMEGA)对扩增产物进行简单纯化，取5μL回收产物，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用凝胶成像仪进行结果观察。
1.6结果
RPA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1A所示，以爪哇根结线虫DNA为模板，引物Mj2RPAF、Mj2RPAR扩增后能得到单一明亮的条带。
实施案2探针的设计和快速检测方法的建立
2.1探针的设计根据引物Mj2RPAF和Mj2RPAR扩增序列的信息，进一步设计适用于侧向流试纸条检测的探针MjProbe(SEQ ID No:7)，探针序列为：CCTTCACTAATAGAAGCCCATCTCTAATATAAGCCCACTCAAGGAGGCC，其中探针5’端标记荧光素FAM基团，第33位的鸟嘌呤被替换为dSpacer，3’端的添加C3Spacer；同时下游引物Mj2RPAR的5'端标记生物素Biotin基团，探针和引物由上海生工合成。
2.2 RPA反应体系：RPA反应使用nfo kit，反应总体系为50μL：缓冲液29.5μL，上下游引物(10μM)各2.1μL，探针0.6μL(10μM)1μL，DNA模板1μL，ddH2O 12.2μL，各组分混合物用移液器吸打混匀后，加入到含有RPA 冻干酶粉的反应管中，充分混匀后，加入MgAc(280mM)2.5μL，阴性对照模板使用ddH2O。
2.3 RPA反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于38℃的金属浴中孵育 30min，得到RPA扩增产物。
2.4侧向流试纸条检测：检测使用的使用的侧向流试纸条为Milenia Hybridtech 1，将RPA扩增产物加入100μL缓冲液，吸取5μL，滴加至试纸条加样区，再滴加 30μL缓冲液，2min至3min后，观察指示条带显色情况。
2.5结果：结果如图1B所示，以爪哇根结线虫DNA为模板RPA反应产物使用侧向流试纸条检测，指示条带和质控条带均显色，而阴性对照未显色。
实施例3引物特异性检测
收集爪哇根结线虫、花生根结线虫、南方根结线虫、禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫，大豆孢囊线虫、贝西滑刃线虫、落选短体线虫共11个种群(表2)，提取不同群体线虫DNA作为模板，以ddH2O为阴性对照，按照2.2、2.3、2.4 所述反应体系添加个反应物，进行RPA反应并检测。图2结果显示，仅有添加爪哇根结线虫DNA为模板的反应产物经侧向流试纸条检测后，阳性指示条带和质控条带均显色，结果表明本发明所提供的引物和探针具有很高的特异性。
表2供试的其他线虫种群名称及来源
实施例4爪哇根结线虫RPA灵敏度检测
RPA检测：将1.2所述的线虫DNA模板梯度稀释至1ng/μL，100pg/μL， 10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL，按2.2、2.3、2.4所述反应体系添加个反应物，进行RPA反应并检测；
PCR检测：以上述梯度稀释的DNA模板，扩增体系为25μL，DNA模板 1μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2.5μL，dNTP Mix(10mM)2μL，浓度为20μM 的引物MjF和MjR各1μL，ExTaq 0.5μL，ddH2O13μL。扩增程序为：94℃4min； 94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像仪进行结果观察。
MjF和MjR引物序列如下：
MjF：ACGCTAGAATTCGACCCTGG
MjR：GGTACCAGAAGCAGCCATGC
结果如图3A和图3B所示，普通PCR检测的爪哇根结线虫DNA最低浓度为1pg/μL，本发明所检测的最低浓度为10pg/μL。
SEQUENCE LISTING
<110>安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所
<120> 一种应用RPA技术检测爪哇根结线虫的引物和探针
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 上游引物
<400> 1
ataccgtaaa agctctaatt aaagcccggt tc 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 下游引物
<400> 2
ccatttccga tttccgacag ttcccatttc cg 32
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 探针
<400> 3
ccttcactaa tagaagccca tctctaatat aagcccactc aaggaggcc 49

Claims (7)

1.所述1个引物对及1条探针，其中正向引物序列为SEQ ID No:3，反向引物序列为SEQID No:4，探针序列为SEQ ID No:7。
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述反向引物的5’端标记生物素Biotin基团。
3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针5’端标记荧光素FAM基团。
4.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针第33位的鸟嘌呤被替换为dSpacer。
5.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针3’端的添加1个C3Spacer。
6.权利要求1所述的引物和探针在检测或辅助诊断爪哇根结线虫，或制备检测或辅助检测爪哇根结线虫的产品中的应用。
7.一种通过RPA技术快速检测、鉴定爪哇根结根结线虫的方法包括：提取待检样品中DNA的作为模板，利用权利要求1所述的引物和探针进行RPA反应，反应产物使用侧向流试纸条进行检测，如果质控条带和阳性指示条带同时显色，则说明所检测样品中含有爪哇根结线虫，如果仅有质控条带显色，说明待测样品中不含有爪哇根结线虫。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110863058A (zh) * 2019-12-05 2020-03-06 河北省农林科学院植物保护研究所 用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的rpa引物及其应用
CN110951838A (zh) * 2019-12-24 2020-04-03 中国农业科学院麻类研究所 基于rpa-lfd技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用
CN114507743A (zh) * 2022-01-28 2022-05-17 中国农业科学院植物保护研究所 一种快速检测菲利普孢囊线虫的rpa引物和探针、试剂盒及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1661108A (zh) * 2003-07-28 2005-08-31 南京农业大学 爪哇根结线虫分子检测引物及其用法
AU2012247038A1 (en) * 2005-07-25 2012-11-29 Abbott Diagnostics Scarborough, Inc. Methods for Multiplexing Recombinase Polymerase Amplification
CN106868166A (zh) * 2017-03-23 2017-06-20 山东师范大学 用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒
CN107653325A (zh) * 2017-08-29 2018-02-02 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒
CN107815490A (zh) * 2017-11-14 2018-03-20 云南省烟草农业科学研究院 一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒及其使用方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1661108A (zh) * 2003-07-28 2005-08-31 南京农业大学 爪哇根结线虫分子检测引物及其用法
AU2012247038A1 (en) * 2005-07-25 2012-11-29 Abbott Diagnostics Scarborough, Inc. Methods for Multiplexing Recombinase Polymerase Amplification
CN106868166A (zh) * 2017-03-23 2017-06-20 山东师范大学 用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒
CN107653325A (zh) * 2017-08-29 2018-02-02 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒
CN107815490A (zh) * 2017-11-14 2018-03-20 云南省烟草农业科学研究院 一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒及其使用方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUAN-KAI CHI ET AL.: "Evaluation of Recombinase polymerase amplification assay for detecting Meloidogyne javanica", 《PLANT DISEASE》 *
景志刚 等: "重组酶聚合酶扩增技术研究进展", 《生物技术通报》 *
迟元凯 等: "爪哇根结线虫RPA-LFD检测方法的建立", 《中国植物病理学会2018年学术年会论文集》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110863058A (zh) * 2019-12-05 2020-03-06 河北省农林科学院植物保护研究所 用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的rpa引物及其应用
CN110951838A (zh) * 2019-12-24 2020-04-03 中国农业科学院麻类研究所 基于rpa-lfd技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用
CN110951838B (zh) * 2019-12-24 2023-08-18 中国农业科学院麻类研究所 基于rpa-lfd技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用
CN114507743A (zh) * 2022-01-28 2022-05-17 中国农业科学院植物保护研究所 一种快速检测菲利普孢囊线虫的rpa引物和探针、试剂盒及应用
CN114507743B (zh) * 2022-01-28 2022-11-25 中国农业科学院植物保护研究所 一种快速检测菲利普孢囊线虫的rpa引物和探针、试剂盒及应用

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