CN114231603A

CN114231603A - 一种鉴别勃氏牡丹的引物、试剂、鉴别方法及试剂盒

Info

Publication number: CN114231603A
Application number: CN202210014166.3A
Authority: CN
Inventors: 李井干; 吴晶; 刘晓宇; 伏建国; 余本渊; 杨晓军
Original assignee: Nanjing Customs Animal And Plant And Food Testing Center
Current assignee: Nanjing Customs Animal And Plant And Food Testing Center
Priority date: 2022-01-06
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2042-01-06
Also published as: CN114231603B

Abstract

本发明涉及鉴别领域，特别是涉及濒危野生动植物的鉴别领域，更为具体的说是涉及一种鉴别勃氏牡丹的引物、试剂、鉴别方法及试剂盒，通过对岩牡丹属植物进行转录组测序和分析，发现勃氏牡丹与其他的岩牡丹属植物相比较，在PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)功能基因序列上存在11个碱基的突变位点。进一步筛选其中的9个碱基的突变位点进行设计，从而获得勃氏牡丹的实时荧光定量PCR的特异性引物和荧光探针，用于研究勃氏牡丹的分子鉴别方法，并检测该方法的灵敏度，为濒危物种的鉴别提供新的技术路线。

Description

一种鉴别勃氏牡丹的引物、试剂、鉴别方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及鉴别领域，特别是涉及濒危野生动植物的鉴别领域，更为具体的说是涉及一种鉴别勃氏牡丹的引物、试剂、鉴别方法及试剂盒。

背景技术

勃氏牡丹Ariocarpus bravoanus属仙人掌科岩牡丹属，原产墨西哥。勃氏牡丹在世界自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录中被评为“濒危”级别，同时被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(简称为《公约》)。

对于勃氏牡丹的鉴别目前仍以形态学为主，而生态学鉴别对于专业鉴别人员的依赖性很重，这就导致各海关口岸无法在鉴别过程中需要配备大量的形态鉴别专家。人才短缺，以及形态学鉴别中依赖人工观察，对于与勃氏牡丹形态上较为相似的龟甲牡丹、龙舌兰牡丹的干扰，使得勃氏牡丹的鉴别成为海关口岸查验工作的亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何突破勃氏牡丹鉴别中对形态学专家的依赖性，提供一种新的鉴别方法，从而缓解人才压力，同时避免人工鉴别中由于人为因素造成的误判。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鉴别勃氏牡丹的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物为5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′ (SEQ ID NO：1)，下游引物为5′-GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ ID NO：2)。

进一步地，在本发明中还进一步公开了一种鉴别勃氏牡丹的试剂，所述的试剂中包括有PCR引物及荧光探针，其中PCR引物包括上游引物和下游引物，上游引物为5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′(SEQ ID NO：1)，下游引物为5′ -GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ ID NO：2)，探针序列为5′ TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC-3′(SEQ ID NO：3)。

优选地，所述荧光探针5′端含有FAM荧光报告基团，3′端含有不发荧光的淬灭基团BHQ1。

进一步地，在本发明中还公开了鉴别勃氏牡丹的方法，包括以下步骤：

S1：提取样品植物DNA；

S2：以前述上游引物、下游引物及探针形成的PCR反应体系对S1中提取的样品植物DNA进行扩增反应；

S3：如果有典型的扩增曲线，表明该待测的样品植物为勃氏牡丹；如果没有典型的扩增曲线，说明该待测的样品植物不为勃氏牡丹。

优选地，在本发明中还公开了前述两个扩增反应S2中的退火温度为60℃。

进一步优选地，本发明中还公开了前述两个扩增反应S2中PCR反应参数为 94℃，15s；60℃，1min；40个循环。

同时，在本发明中还公开了鉴别勃氏牡丹的试剂盒，所述试剂盒中包括上游引物5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′(SEQ ID NO：1)，下游引物5′- GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ ID NO：2)，荧光探针5′-FAM- TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC-BHQ1-3′。

进一步优选地，所述试剂盒的反应体系为上游引物(10mol/L)0.8μL；下游引物(10mol/L)0.8μL；探针(10mol/L)0.4μL；ROX 0.4μL；DNA模板2.0μL 余量为水，总体积20.0μL。

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、重复性好及高通量等特点。目前实时荧光定量PCR技术主要应用于遗传学、育种学、营养学和医学等研究领域。本申请的发明人创造性地将该方法应用在濒危物种的鉴别方面。特别地，发明人通过对岩牡丹属植物进行转录组测序和分析，发现岩牡丹属植物存在PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)功能基因序列(SEQ ID NO：4)，并且勃氏牡丹与其他的岩牡丹属植物相比较，在该功能基因序列上存在11个碱基的突变位点。据此发现我们进一步选择其中的9个突变位点设计勃氏牡丹的实时荧光定量PCR的特异性引物和荧光探针，用于研究勃氏牡丹的分子鉴别方法，并检测该方法的灵敏度，为濒危物种的鉴别提供新的技术路线。

附图说明

图1为待测样品的内源基因实时荧光PCR扩增结果示意图。

图2为勃氏牡丹的实时荧光定量PCR特异性扩增结果示意图。

图3为实时荧光PCR检测灵敏度测定结果示意图。

图4为实时荧光PCR扩增标准曲线示意图。

图5为选择的9个碱基突变位点示意图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例1

试验材料：所用岩牡丹属6种23份试验材料来自江苏南京(南京中山植物园)和海关口岸查获，均由相关专家鉴定，采集新鲜植株叶片或花瓣进行试验。样品的详细信息见表1。

表1植物材料及来源

分别将供试样品进行表面消毒，用液氮将植物叶片研磨成粉，参照DNeasy PlantMini Kit试剂盒说明书上的步骤方法，提取实验样品基因组DNA，并按照表1中所列，将其编号。提取后基因组DNA放4℃保存备用。

首先用通用植物内源基因18SrRNA(内源基因参照SN/T 1204-2016中18SrRNA 序列)对所提取的23种岩牡丹属植物基因组DNA样品进行实时荧光PCR测试。扩增结果如图1所示，全部待测样品均有典型的扩增曲线，其Ct值在11-20之间。说明所有样品DNA提取质量没有问题。

下面进行特异性检测。

按照表2所示的实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR检测；

表2实时荧光PCR反应体系

其中上游引物5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′(SEQ ID NO：1)，下游引物5′-GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ ID NO：2)，荧光探针5′-FAM-TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC-BHQ1-3′。

实时荧光定量PCR的反应参数为：94℃15s，60℃1min，40个循环。

将所有样品放入实时荧光定量PCR仪，按照设定反应条件进行扩增，观察反应体系的特异性，结果如图2所示，只有4份勃氏牡丹样品出现典型的扩增曲线，表明所设计的引物和荧光探针对勃氏牡丹具有良好的特异性。

下面进行灵敏度测试。

提取勃氏牡丹样品Ar07基因组DNA后，测定核酸浓度为50ng/μL。将该样品DNA进行10倍梯度稀释，以检测实时荧光定量PCR方法的灵敏度。扩增结果如图3所示，核酸原液与10^-1～10^-4倍稀释液样本均能够得到典型扩增曲线，根据阴性对照设置阈值线，得到其Ct值分别为23.853、27.321、30.941、34.945、37.124。 10^-5、10^-6和10^-7DNA稀释液样本未得到典型的扩增曲线，判定为阴性，然后绘制扩增标准曲线，如图4所示，该灵敏度试验的标准曲线的相关系数为0.996，检测限量为5×10^-3ng/μL。

应用设计的特异性引物和荧光探针，对23份样品DNA进行实时荧光定量PCR 检测，结果显示只有4份勃氏牡丹样品出现典型的扩增曲线(见图2)。表明所设计的引物和荧光探针对勃氏牡丹具有良好的特异性。

在本发明中，发明人发现岩牡丹属植物存在PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)功能基因序列(SEQ ID NO：4)，并且勃氏牡丹与其他岩牡丹属植物相比较，存在11个碱基的突变位点(未被选择的2个碱基突变位点以下划线标出)。在此基础上，本发明的发明人选择其中的9个碱基的突变位点(图5框内所示)进一步设计引物及探针，可以突破勃氏牡丹鉴别中对形态学专家的依赖性，提供一种新的鉴别方法，缓解人才压力，同时避免人工鉴别中由于人为因素造成的误判。

以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京海关动植物与食品检测中心

<120> 一种鉴别勃氏牡丹的引物、试剂、鉴别方法及试剂盒

<130> 202210001

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctggatttct cttgagctgt ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaaggaaat agaatgtggg tt 22

<210> 3

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtatcctat taggctatta cctgacacc 29

<210> 4

<211> 687

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggatactga aacactatcg gctgcgacaa atttcatttt ggtaatggtc gagagaattt 60

aaaggaagat tttcacatat tgataagcta aatccccttt tttccatatc tgatgcggtt 120

ttacatcaga ccatagatag tatttgacag ctacgaaact aatggctcag taatttgtat 180

tggaactgaa caagtgggac tcgtgtttgg ggcgggtcag ttgcattcaa attgaagccc 240

tccaccaagc tcatgaagaa aatgaagtgt gagtcttgtt ggttgggttg ggtcaactgg 300

atttctcttg agctgtgata ttgggtttgg ttaaagtata tggtgtcagg taatagccta 360

ataggataca atttagtctt gccaaaccaa cccacattct atttccttcc aagaataatt 420

caaatcatga aatatctcta ctacctgccc gagttctaca aagtacaaac caagcccgac 480

tgacctaaat ttccattgta tttttgcagg tcgtcgggca caaggagctg cttgaaggag 540

atccttacac gaaacagagg ctccatattc gagatccata ccttacaatc cttaatgtct 600

tccaagcaaa tactctcaag cgtattcgtg agccaaactt ccacgtaaca cagaacccac 660

gatcatccaa ggaaattgcg gaatcca 687

Claims

1.一种鉴别勃氏牡丹的引物，其特征在于：所述鉴别勃氏牡丹的引物包括包括上游引物和下游引物，上游引物为5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′(SEQ ID NO：1)，下游引物为5′-GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ ID NO：2)。

2.一种鉴别勃氏牡丹的试剂，其特征在于：包括权利要求1所述的引物，还包括有荧光探针，所述荧光探针的序列为5′TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC-3′(SEQ ID NO：3)。

3.根据权利要求2所述的鉴别勃氏牡丹的试剂，其特征在于：探针5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记不发荧光的淬灭基团BHQ1。

4.鉴别勃氏牡丹的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提取样品植物DNA；

S2：以权利要求2或3所述的上游引物、下游引物及探针形成的PCR反应体系对S1中提取的样品植物DNA进行扩增反应；

5.根据权利要求4所述的鉴别勃氏牡丹的方法，其特征在于：S2中的退火温度为60℃。

6.根据权利要求4或5所述的鉴别勃氏牡丹的方法，其特征在于：S2中PCR反应参数为94℃，15s；60℃，1min；40个循环。

7.鉴别勃氏牡丹的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括上游引物5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′(SEQ ID NO：1)，下游引物5′-GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ ID NO：2)，荧光探针5′-FAM-TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC-BHQ1-3′。

8.根据权利要求7所述的鉴别勃氏牡丹的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应体系为上游引物(10mol/L)0.8μL；下游引物(10mol/L)0.8μL；探针(10mol/L)0.4μL；ROX 0.4μL；DNA模板2.0μL；余量为水，总体积20.0μL。