CN106282331A - 一种检测纯黄丝衣霉菌的试剂、实时荧光pcr试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种检测纯黄丝衣霉菌的试剂、实时荧光pcr试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamys fulva)的试剂、实时荧光PCR试剂盒及检测方法。该试剂包括：上游引物、下游引物、荧光探针，上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′‑TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT‑3′，下游引物：5′‑GCGGAGCGTCTTATTGCAAT‑3′，荧光探针：5′‑TAM‑CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT‑BHQ2‑3′；试剂盒主要包括上游引物、下游引物、荧光探针、PCR缓冲溶液、dNTP、DNA聚合酶和MgCl2；其检测方法包括：基因组DNA的提取、实时荧光PCR检测体系及实时荧光PCR检测。本发明的有益效果主要体现在：能够准确的从待测样品中检测出纯黄丝衣霉菌，具有特异性强、灵敏度高，还能实时直观地监测PCR扩增过程等优点。

Description

一种检测纯黄丝衣霉菌的试剂、实时荧光PCR试剂盒和检测 方法
技术领域
本发明涉及一种检测纯黄丝衣霉菌的试剂、实时荧光PCR试剂盒和检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
纯黄丝衣霉菌(Byssochlamys fulva)是果汁生产过程中易污染的耐热霉菌之一，其抗热力比其他霉菌要强得多，在85℃下经30分钟或87.7℃下经10分钟还能生存。纯黄丝衣霉菌能在氧气不足的环境中生长，还能分解食品中的脂肪、蛋白质、碳水化合物等，有强烈破坏果胶质的作用，可使果实软化和解体，并且产生二氧化碳气体和有毒有害物质，引起产品变质。被耐热霉菌污染的果汁在贮存过程中易出现腐败变质、分层沉淀、甚至胖听爆裂等现象，出现产品质量问题。
纯黄丝衣霉目前主要通过传统的培养、分离和生化方法进行鉴定，整个检测过程周期长，操作繁琐耗时，不能满足企业生产环节产品质量的快速监控，和进出口时果汁产品快速准确检测的需要。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamys fulva)的试剂，能够运用于实时荧光PCR检测。为此，本发明采用以下技术方案：
一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamys fulva)的试剂，其特征在于它包括上游引物、下游引物和荧光探针；所述上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′
下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′
荧光探针：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′
其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。
本发明的第二个目的是提供一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamys fulva)的实时荧光PCR试剂盒，通过根据纯黄丝衣霉的Beta tubulin的部分基因序列设计特定的引物和TaqMan荧光探针，实现实时荧光PCR检测试剂盒的制备，并通过检测试剂盒，能对纯黄丝衣霉菌进行快速、准确、特异的检测。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测纯黄丝衣霉菌的实时荧光PCR试剂盒，包括：上游引物、下游引物、荧光探针、PCR缓冲溶液、dNTP、DNA聚合酶和MgCl2，其特征在于所述上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′
下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′
荧光探针：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′
其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。
本发明的关键在于上游引物、下游引物和探针序列的设计及检测方法，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作纯黄丝衣霉菌的定性检测。
本发明还提供了一种检测纯黄丝衣霉菌的实时荧光PCR方法，包括步骤：
（1）提取待测样品DNA，通常采用DNA提取试剂盒。
（2）采用上述实时荧光PCR试剂盒，对样本DNA和阴性对照样品，进行目的基因的实时荧光PCR反应，并进行荧光检测；
（3）选择TAM荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，Ct值小于35，则判断为阳性。
所述步骤（2）中的阴性对照品，可按本领域常规方法选择，通常选择不含靶基因的非靶菌，即选择非纯黄丝衣霉菌DNA样本，如雪白丝衣霉菌、宛氏拟青霉菌等。
所述步骤（3）中的Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
所述实时荧光PCR检测体系终浓度组成如下：
DNA模板，1～102ng/μL； PCR反应缓冲液，1×；上游引物，0.2～0.4μmol/L；下游引物，0.2～0.4μmol/L；探针，0.2～0.4μmol/L；dNTP，0.2～0.4mmol/L ；DNA聚合酶，1～3U/反应；MgCl2，2.0～3.5mmol/L；ROX染料，0.05～0.8μmol/L；溶剂为无菌超纯水。
所述PCR缓冲溶液为10×PCR（Mg2+free）缓冲溶液，其反应体系中终浓度为1×，缓冲溶液的组成参见Takara公司的10×PCR Buffer（Mg2+free），Code：A6901A。所述PCR缓冲溶液在PCR反应体系中终浓度为1×。
实际使用中，通常选用将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTP、Mg2+等试剂预混在一起的Premix Type试剂（如TaqMan 2×PCR Master Mix，Applied Biosystems，K00062），进行实验时，PCR反应液的配制简单方便。
所述PCR反应条件可为：95℃预变性3min；95℃变性15s，59℃退火40s，40个循环扩增。
发明建立了利用TaqMan荧光PCR技术检测纯黄丝衣霉菌的方法，经检测模拟果汁污染样本，表明该方法切实可行。
本发明的一种检测纯黄丝衣霉菌的试剂、实时荧光PCR试剂盒和检测方法，具有快速、准确检测，敏感性高，特异性好的特点；与常规PCR检测技术相比，实时荧光PCR由于探针的应用和采用完全闭管检测等，具有特异性大大提高、避免了交叉污染、降低常规PCR扩增的假阳性率、实时监测PCR扩增等优点。
附图说明
图1 为实时荧光PCR的特异性检测结果图。
图2 为实时荧光PCR的灵敏度检测结果图。纯黄丝衣霉DNA浓度1-6依次为：7.2×101，7.2×100，7.2×10＿1，7.2×10＿2，7.2×10＿3，7.2×10＿4 ng/μL。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：特异引物、荧光探针
1、材料：
PCR反应缓冲液（10×）（Mg2+free）、dNTP、DNA聚合酶、MgCl2均购自Takara公司；
ROX染料购自上海位点生物科技有限公司。
ABI7300实时荧光PCR仪为美国Applied Biosystems公司产品。
2、引物及探针设计与合成：
以纯黄丝衣霉菌Beta tubulin基因序列为模板，使用PrimerExpressTM(V3.0，美国ABI公司)软件分析引物和TaqMan探针位点，从中选择最佳组合：
上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′
下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′
荧光探针：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′
其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。
均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。
实施例2：纯黄丝衣霉实时荧光PCR法灵敏度和特异性评价
1、菌株检测：
用2株纯黄丝衣霉标准株（ATCC24474、ATCC24008）、以及雪白丝衣霉（ATCC22260、ATCC18742）、费氏新萨托菌（ATCC66640、ATCC66641）、宛氏拟青霉（CICC4024、CICC4025）、黑曲霉（ATCC16404）、烟曲霉（ATCC10894）、酿酒酵母（ATCC26603）、宋内志贺菌（ATCC25931）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、副溶血性弧菌（本实验室分离保存）、大肠埃希氏菌（ATCC25922）等非纯黄丝衣霉菌菌悬液，提取DNA，然后用检测用上下游引物及探针在美国ABI公司ABI7300型实时荧光PCR仪上进行PCR扩增，特异性检测结果参见图1。
（1）DNA提取：应用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取培养菌株中真菌基因组DNA；应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养菌株中细菌基因组DNA。
（2）总反应体系包括：
DNA模板（约100ng/μL），1.5μL；10×PCR反应缓冲液，2.5μL；上游引物（10μΜ），1μL；下游引物（10μΜ），1μL；探针（10μΜ），1μL；dNTP（2.5mM），1.0μL；DNA聚合酶（5U/μL），0.2μL；MgCl2（25mM），2.0μL；ROX染料（10μΜ），0.8μL；无菌超纯水补足25μL。
用ABI7300实时荧光PCR反应系统进行检测，其中PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，59℃退火40s，40个循环扩增。
以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，Ct值小于35，测判断为阳性。
同时在相同条件下对不同DNA浓度的纯黄丝衣霉菌（ATCC24474）进行实时荧光PCR检测，DNA浓度分别为：7.2×101，7.2×100，7.2×10-1，7.2×10-2，7.2×10-3，7.2×10-4 ng/μL，灵敏度检测结果参加图2。
2、样品检测结果
纯黄丝衣霉菌（ATCC24474）不同DNA浓度的实时荧光PCR检测结果参见图1，结果显示最低7.2×10-4ng/μL的DNA能够被扩增，Ct值小于35，而更低稀释度的DNA没有信号增长。
特异性结果显示2株纯黄丝衣霉菌Ct值均小于35，而非纯黄丝衣霉菌Ct值均大于35或无对数扩增曲线出现。
本发明应用于无需ROX染料校正的实时荧光PCR仪器时，可不加ROX，其他步骤相同。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
<110> 浙江省质量检测科学研究院
<120> 一种检测纯黄丝衣霉菌的试剂、实时荧光PCR试剂盒和检测方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttggaaggtc tatgagatga ggaat 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcggagcgtc ttattgcaat 20
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caacttagct acaatggcac ctccgacct 29
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttggaaggtc tatgagatga ggaat 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcggagcgtc ttattgcaat 20
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caacttagct acaatggcac ctccgacct 29

Claims (7)

1.一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamys fulva)的试剂，其特征在于它包括上游引物、下游引物和荧光探针；所述上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′
下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′
荧光探针：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′
其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。
2.一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamys fulva)的实时荧光PCR试剂盒，所述试剂盒主要包括上游引物、下游引物、荧光探针、PCR缓冲溶液、dNTP、DNA聚合酶和MgCl2，其特征在于所述上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′
下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′
荧光探针：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′
其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。
3.一种检测纯黄丝衣霉菌的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括步骤：
（1）提取待测样品DNA；
（2）采用如权利要求2所述的实时荧光PCR试剂盒，对样本DNA和阴性对照样品，进行实时荧光PCR反应，并进行荧光检测；
（3）选择TAM荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，Ct值小于35，则判断为阳性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的阴性对照品，为非纯黄丝衣霉菌DNA样本。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（3）中实时荧光PCR检测体系终浓度组成如下：
DNA模板，1～102ng/μL； PCR反应缓冲液，1×；上游引物，0.2～0.4μmol/L；下游引物，0.2～0.4μmol/L；探针，0.2～0.4μmol/L；dNTP，0.2～0.4mmol/L ；DNA聚合酶，1～3U/反应；MgCl2，2.0～3.5mmol/L；ROX染料，0.05～0.8μmol/L；溶剂为无菌超纯水。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（4）中PCR反应条件如下：
95℃预变性3min；95℃变性15s，59℃退火40s，40个循环扩增。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（4）中PCR反应体系中加有ROX染料，可适用于需要使用ROX校正染料的实时荧光PCR仪器。
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