CN108085396A - 基于荧光定量pcr检测银鲳的引物和探针及其试剂盒与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于定量PCR技术快速鉴别银鲳的检测引物和探针，以及采用了该引物和探针的检测试剂盒和检测方法。检测引物组包括上游引物FP、下游引物BP和探针；检测试剂盒包括引物液、PCR MIX反应液、去离子水、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品DNA，利用荧光定量PCR技术对待检样品DNA进行快速检测，通过实时扩增曲线判断待检样品是否为银鲳。本发明具有快速、灵敏、特异、易操作等优点，适于推广应用等优点。

Description

基于荧光定量PCR检测银鲳的引物和探针及其试剂盒与方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于荧光定量PCR检测银鲳的引物和探针及其试剂盒与方法。
背景技术
银鲳(Pampus argenteu)，属于硬骨鱼纲，辐鳍亚纲，鲈形目，是我国主要的海产经济鱼类之一，广泛分布于我国沿海地区，北起渤海南至南海均有银鲳分布。由于银鲳具有较高的经济食用价值，不少商家为了谋求高额利润，在海产品捕捞、加工处理、市场流通等环节，存在以次充好(如用便宜的金鲳代替银鲳)、乱贴标签的现象。目前关于鉴定银鲳的报道较少，主要依赖于传统的形态学鉴别法，但需要从业人员具备较强的专业背景知识，受主观判断影响大，易出错。而以分子生物学为基础的检测方法主要包括微卫星分子标记、随机引物扩增多态性、限制性长度多态性等，但这些方法存在耗时长、操作复杂、重复性差和误差大等弊端。为了对鱼肉及其制品进行溯源，亟需快速、精准、高效的鉴定方法。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于荧光定量PCR检测银鲳的引物和探针。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量PCR检测银鲳的试剂盒。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量PCR检测银鲳的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种基于荧光定量PCR检测银鲳的引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分别如下所示：
FP：5-GCCTATTTACCCAGTTTTC-3；
BP：5-GGTCAGGATCTCATTGTA-3；
Probe：5-FAM-TCATTCCGAGCAGCCTAGTAGC-TAMRA-3，其中5端标记的荧光基团是FAM，3端标记的淬灭基团是TAMRA。
优选地，扩增反应时，FP引物、BP引物和探针的摩尔比为：2：2：1。
另一方面，本发明还公开了一种基于荧光定量PCR检测银鲳的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2中所述的检测引物和探针。
优选地，该基于荧光定量PCR检测银鲳的试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)PCR MIX反应液；(2)去离子水；(3)阳性对照和阴性对照。
优选地，所述的PCR MIX反应液含有：5U Taq酶，2.5mM dNTPs，25mM MgCl2，2×PCRbuffer。
优选地，阳性对照为含有银鲳特异性基因片段的T载体克隆，阴性对照为不含有银鲳特异性基因片段的水或其他溶剂。
再有，本发明还公开了一种基于荧光定量PCR检测银鲳的方法，包括如下步骤：
(1)待检样品DNA的提取；
(2)荧光定量PCR反应体系的配制：将步骤(1)中提取的待检样品DNA 加入荧光定量PCR反应体系，混匀后离心，所述荧光定量PCR反应体系中含有如权利要求1或2中所述的引物和探针；
(3)荧光定量PCR反应：设置阳性对照和阴性对照，将配好的荧光定量PCR 反应体系置于荧光定量PCR仪后开始反应，反应程序如下：95℃反应10min；
95℃反应15sec，60℃反应60sec，45个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号；
(4)结果判断：通过观察荧光定量PCR的扩增曲线判断扩增结果。
优选地，荧光定量PCR反应体系为25μL反应体系，其含有10μmol/L FP 和BP引物各1μL，10μmol/L探针0.5μL，PCR MIX反应液12.5μL，模板5μL，用去离子水补齐到25μL。
本发明的方案是基于荧光定量PCR技术实现对银鲳快速检测，从原理上讲，荧光定量PCR技术是利用扩增过程中Taq酶的5端核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，该探针5端标记荧光报告集团，3端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针在PCR过程中延伸，当引物延伸至寡核苷酸结合位置时， Taq酶可以将其切割成小片段，使报告集团和淬灭基团分开并发出荧光，经过检测伴随扩增产物增加过程中荧光强度的增加对样本进行定量分析。该方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作方便等优点。本发明以荧光定量PCR 技术为依托，开发一种可快速鉴别银鲳的试剂盒及检测方法。目前尚未有将荧光定量PCR技术应用于快速鉴别银鲳的试剂盒。本试剂盒能够在短时间内实现银鲳的快速、精准鉴定，完成鱼肉及其制品的种质溯源，为食品安全监督管理部门和第三方食品加工企业等单位提供有力的技术支持，同时有利于提升我国水产行业的属种鉴定能力，有着广阔的应用前景和产业化前景。
因此，结合上述原理及本发明实施例中的技术效果可知，本发明至少包含如下有益效果：
(1)检测时间短：在60min内可实现将对银鲳的鉴定；
(2)可实时监控：通过监测荧光信号，实现实时在线监控，更加直观得观察产物的增加；
(3)特异性强：引入荧光探针，使引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了其特异性；
(4)操作简便：仅需完成配液、上机和结果读取这三个步骤，无需进行跑胶、酶切等复杂操作，使得操作人员更容易接受，有利于方法推广；
(5)污染少：采用闭管检测，无需后续对PCR产物进行开盖处理，避免了气溶胶污染。
因此，本方法克服了传统种属鉴定操作复杂，时间长等局限，可实现快速、精准得鉴定银鱼。
附图说明
图1是本发明实施例3中特异性实验的检测结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1基于荧光定量PCR技术快速鉴别银鲳检测试剂盒的建立
基于荧光定量PCR技术快速鉴别银鲳的检测试剂盒，包括引物组、PCR MIX 反应液、去离子水、阳性对照和阴性对照。
(1)荧光定量PCR扩增引物设计：以银鲳特异性保守序列为靶基因进行引物的设计。引物序列见表1。
表1引物序列表
(2)荧光定量PCR MIX反应液含有：5U Taq酶，2.5mM dNTPs，25mM MgCl2，2×PCRbuffer。
(3)阳性对照为含有银鲳特异性基因片段的T载体克隆，其制备方法为： DNA模板来源于银鲳，利用表1中的FP和BP引物(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)对模版DNA进行PCR扩增反应，得到含靶基因序列的DNA，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
(4)阴性对照为去离子水。
实施例2基于荧光定量PCR技术快速鉴别银鲳的检测方法
利用实施例1的试剂盒检测银鲳的方法，包括如下步骤：
(1)待检样品DNA的提取；
(2)荧光定量PCR反应体系：25μL反应体系中含有10μmol/L FP和BP 引物各1μL，10μmol/L探针0.5μL，PCR MIX反应液12.5μL，模板5μL，用去离子水补齐到25μL；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，放置荧光PCR仪(如ABI7500)进行反应。
(3)反应程序如下：95℃反应10min；95℃反应15sec，60℃反应60sec， 45个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号。
(4)结果判断：观察荧光定量PCR仪扩增CT判断扩增结果，如果CT值小于35且出现“S”型曲线则为阳性，即检测样品为银鲳；反之，则为阴性。
实施例3特异性实验
本发明检测方对实际样本的检测，样本来自广州某水产市场以及某生鲜网站，包括青石斑鱼、鸭嘴鱼、黄花鱼、鲈鱼、银鲳、三文鱼、金鲳鱼、舟山鲳鱼、武汉草鱼、阿拉斯加黄金鲽鱼、南美灰鲳、多宝鱼、马拉西亚银鲳、东海带鱼、鳜鱼、武汉桂鱼、俄罗斯秋刀鱼、东海鲳、鲫鱼等33个样品，所有样品均经过测序法验证其属种，检测结果见图1。由图中的检测接过来看，本发明方案具有良好的特异性。
另外，利用本发明的方法及试剂盒对实际检测样本的的检测，选取来自检验检疫部门和质检部门多个检测站提供的535个样本鱼类的检测，除一个样本误检外，其余样本均能够检测出正确的结果，通过本发明的方案确定待检测鱼类是否为银鲳，并通过测序或者其他检测方法的验证，准确性高于99.5％，且方便快捷。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种基于荧光定量PCR检测银鲳的引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分别如下所示：
FP：5-GCCTATTTACCCAGTTTTC-3；
BP：5-GGTCAGGATCTCATTGTA-3；
Probe：5-FAM-TCATTCCGAGCAGCCTAGTAGC-TAMRA-3，其中5端标记的荧光基团是FAM，3端标记的淬灭基团是TAMRA。
2.如权利要求1所述的基于荧光定量PCR检测银鲳的引物和探针，其特征在于：扩增反应时，FP引物、BP引物和探针的摩尔比为：2：2：1。
3.一种基于荧光定量PCR检测银鲳的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1或2中所述的检测引物和探针。
4.根据权利要求3所述的基于荧光定量PCR检测银鲳的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)PCR MIX反应液；(2)去离子水；(3)阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的基于荧光定量PCR检测银鲳的试剂盒，其特征在于：所述的PCRMIX反应液含有：5U Taq酶，2.5mM dNTPs，25mM MgCl2，2×PCR buffer。
6.根据权利要求4所述的基于荧光定量PCR检测银鲳的试剂盒，其特征在于：阳性对照为含有银鲳特异性基因片段的T载体克隆，阴性对照为不含有银鲳特异性基因片段的水或其他溶剂。
7.一种基于荧光定量PCR检测银鲳的方法，包括如下步骤：
(1)待检样品DNA的提取；
(2)荧光定量PCR反应体系的配制：将步骤(1)中提取的待检样品DNA加入荧光定量PCR反应体系，混匀后离心，所述荧光定量PCR反应体系中含有如权利要求1或2中所述的引物和探针；
(3)荧光定量PCR反应：设置阳性对照和阴性对照，将配好的荧光定量PCR反应体系置于荧光定量PCR仪后开始反应，反应程序如下：95℃反应10min；95℃反应15sec，60℃反应60sec，45个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号；
(4)结果判断：通过观察荧光定量PCR的扩增曲线判断扩增结果。
8.如权利要求7所述的基于荧光定量PCR检测银鲳的方法，其特征在于：荧光定量PCR反应体系为25μL反应体系，其含有10μmol/L FP和BP引物各1μL，10μmol/L探针0.5μL，PCR MIX反应液12.5μL，模板5μL，用去离子水补齐到25μL。
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