CN105525022A - 利用荧光定量pcr鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，包括以下步骤：①、待测鱿鱼样品中基因组DNA的提取；②、对常见鱿鱼特异性鉴定引物与探针的设计；4种常见鱿鱼为：北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼以及日本海鱿鱼；③、荧光定量PCR扩增体系设置；以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物和探针，进行实时荧光PCR检测；④、根据实时荧光PCR检测结果进行判断。采用本发明的方法能对鱿鱼以及深加工鱿鱼产品种类进行快速鉴定。

Description

利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法
技术领域
本发明涉及一种适用于鱿鱼及其深加工产品种类的荧光定量PCR检测方法。
背景技术
鱿鱼(Squid)，又称句公、柔鱼或枪乌贼，是头足纲(Cephalopoda)、枪形目(Teuthida)中多种10腕头足类软体动物的俗称。其身体狭长，呈枪形。嗅觉突由两个突起组成，眼眶外覆盖透明角膜，环口附肢10腕。喷水推进能力强，适于快速游泳。鱿鱼广泛分布于世界各大洋，已知分布水层为0～3000m。市场上常见的鱿鱼一般是开眼亚目(Oegopsida)的柔鱼科(Ommastrephidae)品种和闭眼亚目(Myopsida)的枪乌贼科(Loliginidae)品种。在中国本土市场，最常见的鱿鱼是柔鱼科的秘鲁鱿鱼(Dosidicusgigas)、阿根廷鱿鱼(Illexargentinus)、日本海鱿鱼(Todarodespacificus)和北太平洋鱿鱼(Ommastrephesbartramii)。
鱿鱼类的平均可食用部分约占85％，比一般鱼类高约25％。肉质鲜美，富含蛋白质、牛磺酸、钙、磷、铁等人体必需的成分，且必需氨基酸组成接近全蛋蛋白，营养价值非常高。市场上的鱿鱼除了直接鲜销，还会经加工来供应市场。常见的鱿鱼加工形式有：冻品，如冻鱿鱼胴片、冻鱿鱼圈等；干品，如鱿鱼鲞、鱿鱼耳等；熟食产品，如鱿鱼丝、鱿鱼仔、鱿鱼罐头等。日本和欧盟是鱿鱼的主要消费市场，日本以进口冷冻和干制品为主，欧盟则大部分进口冷冻品。近年来，美国、中国等国家或地区的鱿鱼市场也逐渐扩大。
因为产地、营养成分、口味的差异，不同鱿鱼品种的市场价相差巨大。例如，阿根廷鱿鱼肉质肥厚、口感鲜嫩，所以价格较高；秘鲁鱿鱼资源丰富，个体大，但含有特殊酸味且肉质较差，所以价格较低。而当鱿鱼进行切片、熟制等加工过程，其可供鉴别的形态学特征基本不存在，这可能会导致不法商贩以次充好的欺诈行为。虽然很多国家、地区和组织都有相应的法规，规定在水产品的标签中明确其种类和来源，但是掺假造假的判定和标签制度的有效实施，必须是建立在快速、准确的鱿鱼品种鉴定的基础上的。目前该领域国内的研究还在起步阶段。因此，为了规范鱿鱼市场，维护消费者的知情权，迫切需要建立灵敏、可靠的检测方法和检测体系来鉴定鱿鱼类产品原鱼料的品种。
目前，已报道的鱿鱼种类鉴定的方法有传统形态学法、蛋白质电泳法和DNA分子遗传标记方法。形态学方法依赖于专业人士的长期工作经验，对亲缘关系相近的相似种的判断并非有效。而且对于市面上常见的加工过鱿鱼产品(鱿鱼丝、罐头等)，可供种类鉴别的形态学特征几乎不存在；蛋白质分析方法不适用于深加工产品，因为产品加工过程中的热处理使蛋白质的生化特性及其结构完整性都被破坏；而基于DNA技术的分子生物学方法，就显示出明显优势：1)DNA比蛋白质耐热性强；尽管DNA在加工过程中也会被降解，但是仍然能提取出小片段的DNA；2)作为生物体的遗传物质，DNA分子能够提供更多信息；3)DNA分子稳定，不受组织类型、年龄及生理状态等因素的影响。
DNA分子技术用于种类鉴定有多种常见方法，如限制性片段长度多态性(RFLP)标记、单碱基多态性(SNP)标记、微卫星(microsatellite)标记、DNA条形码技术(DNAbarcode)、荧光定量PCR技术等。
RFLP首先需要对目标DNA片段进行PCR扩增，然后选择合适的限制性内切酶切割扩增片段，通过琼脂糖凝胶电泳获得不同物种的限制性酶切片段图谱。该方法花费低，操作简单，但也存在诸多缺点：1)、由于存在种内变异以及不同密码子的简并性特征，同一物种不同个体可能存在不同的限制片段酶切图谱；2)、除生鲜鱿鱼和冷冻鱿鱼外，鱿鱼深加工产品(如鱿鱼丝、鱿鱼饼、鱿鱼罐头等)在加工过程中通常使用长时间(>15min)高温(>115℃)处理，DNA分子常降解为100-200bp的小片段，这可能严重影响酶切片段的多态性的判断。
SNP和microsatellite标记常用于鱿鱼类的群体分析。DNAbarcode是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行快速物种鉴定的技术，由Hebert等(2003)首先提出。2003年，海洋生物普查研究首次将DNABarcode技术用于标本编码。2004年，生命条形码联盟(theConsortiumfortheBarcodeofLife,CBOL)成立，支持生物DNA条形码研究的发展。至今，该组织下的鱼类DNA条码(FishBarcodeofLifecampaign,FISH-BOL)已经获得了10267个种的DNA条形码记录,包含97％的鱼类品种。该方法在新物种的发掘和物种系统进化分析方面非常高效，但其缺点是混合样品中通常有多种成分被同时扩增,会造成测序结果的杂乱，因此不适用于混合样品的鉴定。
荧光定量PCR技术是近年来发展起来的新的核酸定量检测方法，它在常规的PCR基础上加入荧光信号物质(探针或染料)，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过扩增曲线的Ct值(荧光信号强度达到基础信号(BaseLine)时的循环数，表明PCR开始进入指数扩增期)对未知模板进行定量分析。它集中了核酸杂交特异性强和PCR扩增灵敏度高的优点，检测范围广(≥7个数量级)、检测极限低(1c/r)，可同时对多个样品进行快速准确分析，被认为是目前最可靠的核酸定量检测技术。在我国进出口食品的检验检疫方面，已广泛应用于病原体检测、有害生物风险分析以及转基因产品的监管等多个方面。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鱿鱼或其深加工产品种类鉴定的荧光定量PCR检测方法中所用的特异性引物和探针，采用本发明的方法能对鱿鱼以及深加工鱿鱼产品种类进行快速鉴定。
为解决上述技术问题，本发明提供鱿鱼或其深加工产品种类鉴定的荧光定量PCR检测方法中所用的特异性引物和探针，其特征是：
所述特异性引物和探针的序列由柔鱼科以及北太平洋鱿鱼(Ommastrephesbartramii)、秘鲁鱿鱼(Dosidicusgigas)、阿根廷鱿鱼(Illexargentinus)以及日本海鱿鱼(Todarodespacificus)中的至少任意一种以及柔鱼科组成：
具体如表1所述；
表1
备注说明：
上述柔鱼科R-P中：Y:C/T，R:A/G，H：A/T/C。
本发明还同时提供了利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，包括以下步骤：
①、待测鱿鱼样品中基因组DNA的提取；
②、对常见鱿鱼特异性鉴定引物与探针的设计；
4种常见鱿鱼为：北太平洋鱿鱼(Ommastrephesbartramii)、秘鲁鱿鱼(Dosidicusgigas)、阿根廷鱿鱼(Illexargentinus)以及日本海鱿鱼(Todarodespacificus)；
③、荧光定量PCR扩增体系设置；
以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物和探针，进行实时荧光PCR检测；
④、根据实时荧光PCR检测结果进行判断(即，对市售鱿鱼样品的种类鉴定，判断是否与标签所述相符)。
作为本发明的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法的改进：
所述步骤②是对4种常见鱿鱼的12SrDNA及Cytb、COI、ATPase6基因的序列进行荧光定量PCR检测的特异性鉴定引物与探针的设计。
作为本发明的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法的进一步改进：所述探针的5’端标记有报告荧光染料，所述报告荧光染料为FAM、HEX，探针的3’端标记有淬灭荧光染料，所述淬灭荧光染料为TAMRA。
作为本发明的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法的进一步改进：所述步骤②中的特异性引物和探针的序列如表1所述。
作为本发明的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法的进一步改进：所述步骤③荧光定量PCR扩增体系设置：
反应体系为：20μL总体积中含有AceQTMqPCRProbeMasterMix10μL，鱿鱼/柔鱼科的上下游引物(10μM)各0.4μL，鱿鱼/柔鱼科的探针(10μM)0.2μL，DNA模板1.5μL，补水至20μL；
备注：每个反应重复3次，同时以1.5μL灭菌蒸馏水为模板的作为空白对照组。
上述鱿鱼是指“北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼”中的任意一种；DNA模板的浓度为1.514×10-2ng/μL–4.08ng/μL。
荧光定量PCR扩增体系参数分成如下2种：
第一种，为对于区分柔鱼科与非柔鱼科品种的Probe-12SrDNA体系：95℃预变性5min；95℃变性10sec，60℃退火并延伸31sec，40个循环；在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号；
第二种，为对于区分4种常见鱿鱼的种类特异性体系，95℃预变性5min；95℃变性10sec，63℃退火并延伸31sec，40个循环；在每个循环的63℃退火并延伸阶段收集荧光信号；(即，其退火温度均为63℃，其它参数与Probe-12SrDNA体系相同)。
作为本发明的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法的进一步改进：当所述步骤①的待测鱿鱼样品为鱿鱼深加工样品(鱿鱼丝、鱿鱼罐头等)，采用TAKARA肉制品DNA提取试剂(Cat#9178)提取基因组DNA；
当所述步骤①的待测鱿鱼样品为未加工鱿鱼样品，采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒。
备注说明：所得的DNA模板中，DNA浓度范围为30.2ng/mL-151.4ng/μL(备注：DNA浓度及纯度通过ND-2000C核酸蛋白分析仪检测，要求OD260/OD280在1.8-2.0之间)。
作为本发明的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法的进一步改进：
所述步骤④的扩增结果分析及结果判断为：根据荧光定量PCR反应中的特异性扩增曲线与对应的阈值大小判断被检鱿鱼样品中是否属于上述4种常见鱿鱼；检测基因无特异性扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性。
即，具体为：若柔鱼科12SrDNA检测基因无扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，即可判定该样品为非柔鱼科；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品种类属于柔鱼科。若4种常见鱿鱼的特异性体系测试均无扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，即可判定该样品非此4种常见鱿鱼；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品属于柔鱼科，且为有扩增反应的特定鱿鱼类。根据检测结果，对比标签标识的商品鱿鱼种类，从而判定出待测样品种类与标签所述是否相符合。
在本发明中，荧光定量PCR扩增引物与探针的设计方法为：对于区分柔鱼科与非柔鱼科鱼类的扩增引物和探针设计方法是从NCBI数据库中检索柔鱼科与非柔鱼科鱼类12SrDNAgene特征序列，经DNAstar软件的MegAlign功能比对柔鱼科鱼类序列同源性，按照本发明要求筛选出合理的目的片段基因后导入Primerpremier5.0进行区分柔鱼科与非柔鱼科鱼类引物和探针的设计；对于区分4种常见鱿鱼的扩增引物和探针设计方法是从NCBI数据库中检索这4种鱿鱼的线粒体Cytb基因、COI基因、ATPase6基因序列，经DNAstar软件的MegAlign功能比对4种鱿鱼序列差异性，按照本发明要求筛选出合理的差异性目的片段基因后导入Primerpremier5.0进行每种鱼类的特异性引物和探针的设计；以上设计的引物和探针均委托SangonBiotech(上海，中国)公司合成。
所述的12SrDNA基因以及种类特异性扩增引物以及探针序列如上述表1所示。
所述探针5′荧光报告基团标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定。本次设计的种类特异性探针5′采用FAM标记，针对柔鱼科品种的12SrDNA探针5′采用HEX标记；探针的3′淬灭基团均选择TAMRA。
在本发明中，荧光定量PCR体系配置的检测反应参数有两个。对于区分柔鱼科与非柔鱼科品种的Probe-12SrDNA体系：95℃预变性5min；95℃变性10sec，60℃退火并延伸31sec，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号；对于区分4种常见鱿鱼的种类特异性体系，退火温度设为63℃，其他与上述相同。
在本发明中，鉴定待测样品种类是否与标签所述相符的方法为：根据荧光定量PCR反应中的特异性扩增曲线与对应的阈值大小判断被检鱿鱼样品的种类是否与标签所述相符。检测基因无扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性。
备注说明：本发明所选择的这4种柔鱼科的鱿鱼是在中国本土市场最常见的鱿鱼；由于产地的不同，导致口感和价格有一定的差距。这4种鱿鱼都属于柔鱼科，外形在非专业人员鉴定下容易混淆，并且鱿鱼制备成加工产品时，在除去外部特征的情况下，更加难以区分。
本发明具有良好的特异性、准确性和灵敏度，操作简便，且检测时间短。本发明为鱿鱼及其深加工产品种类的快速检测提供了有效方法，为水产品和食品进出口提供技术保障。
综上所述，本发明涉及一种荧光定量PCR技术，利用该技术灵敏准确的特性，分别检测柔鱼科保守基因和4种柔鱼科鱿鱼(秘鲁鱿鱼(Dosidicusgigas)、阿根廷鱿鱼(Illexargentinus)、日本海鱿鱼(Todarodespacificus)和北太平洋鱿鱼(Ommastrephesbartramii))的特异基因，建立一套合适的扩增和分析体系，对深加工鱿鱼产品种类进行快速鉴定。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为使用本发明特异性引物和探针实时荧光PCR扩增阳性对照、阴性对照以及空白对照的扩增曲线图谱；
a.以北太平洋鱿鱼(OB)的样本为阳性对照；以其他三种鱿鱼(秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼)的样本为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
b.以秘鲁鱿鱼(DG)的样本为阳性对照；以其他三种鱿鱼(北太平洋鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼)的样本为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
c.以阿根延鱿鱼(IA)的样本为阳性对照；以其他三种鱿鱼(北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、日本海鱿鱼)的样本为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
d.以日本海鱿鱼(TP)的样本为阳性对照；以其他三种鱿鱼(北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼)的样本为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
e.以四种柔鱼(北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼)的样本为阳性对照；以其它常见头足类品种(真蛸、虎斑乌贼)的样本为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。用于区分柔鱼和其它相似品种。
备注说明：
1)、图a-d：qPCR扩增体系为：20μL总体积中含有AceQTMqPCRProbeMasterMix10μL，相应鱿鱼的特异性上下游引物(10μM)各0.4μL，特异性探针(10μM)0.2μL，DNA模板(30.2-151.4ng/μL)1.5μL，补水至20μL。实时荧光PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10sec，63℃退火并延伸31sec，40个循环，在每个循环的63℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
以图a为例，qPCR扩增体系为：20μL总体积中含有AceQTMqPCRProbeMasterMix10μL，北太平洋鱿鱼的特异性上下游引物(10μM)各0.4μL，北太平洋鱿鱼的特异性探针(10μM)0.2μL，DNA模板1.5μL，补水至20μL。
2)、图e：qPCR扩增体系为：20μL总体积中含有AceQTMqPCRProbeMasterMix10μL，12SrDNA的上下游引物(10μM)各0.4μL，探针(10μM)0.2μL，DNA模板(16.8-64.5ng/μL)1.5μL，补水至20μL。实时荧光PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10sec，60℃退火并延伸31sec，40个循环。在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
3)、上述每幅图中，每个样品的qPCR扩增均设置了3个重复。
4)、上述每幅图中，由于受检测板孔位数的限制，空白对照的结果没有在图中得以体现，但空白对照的结果均符合以下条件，即：荧光定量PCR无扩增；根据该结果，我们得知关于空白对照的以下结论：空白对照的无扩增结果说明了实验组中加入的无菌ddH2O无DNA模板影响。
5)、图1中的结果，显示每组引物和探针均能特异性地扩增目标样品，而且对照组的阴性样品都没有扩增。
图2标准曲线图谱。
图2为检测12SrDNA、北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼和日本海鱿鱼五种探针灵敏度的标准曲线。将北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼和日本海鱿鱼的DNA浓度进行10倍梯度稀释，再根据每一稀释倍数的DNA进行特异性荧光定量PCR鉴定。标准曲线图是以DNA浓度的log值作为横坐标，以对应DNA稀释浓度的扩增阈值的平均值作为纵坐标。
备注说明：
1)、a是检测12SrDNA引物和探针分别对北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼和日本海鱿鱼DNA的扩增效率，b对应的是4种特异性引物和探针对其目标品种DNA的扩增效率。
2)、根据图2a的标准曲线图，得出：
12SrDNA引物和探针对北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼扩增标准曲线的斜率分别为-3.5073，-3.5529，-3.2192，-3.4413。根据公式E＝10(–1/slope)-1，计算出该探针对四种鱿鱼DNA在检测浓度范围内的扩增效率分别为92.80％、91.19％、104.47％、95.25％。结果分析表明北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼和日本海鱿鱼DNA溶液分别在1.514×10-3ng/μL-151.4ng/μL、1.499×10-3ng/μL–149.9ng/μL、1.150×10- 2ng/μL-115.0ng/μL和4.08×10-3ng/μL–40.8ng/μL的检测范围内荧光定量PCR起始模板浓度和Ct值之间具有较好的线性关系。
3)、根据图2b的标准曲线图，得出：
4个品种特异性引物和探针对其目标品种(OB—北太平洋鱿鱼、DG—秘鲁鱿鱼、IA—阿根廷鱿鱼、TP—日本海鱿鱼)标准曲线的斜率分别为-3.364，-3.3145，-3.2611，-3.428。根据公式E＝10(–1/slope)-1，计算出4个检测探针(OB、DG、IA、TP)在检测浓度范围内的扩增效率分别为98.27％、100.31％、102.60％、95.76％。结果分析表明北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼DNA溶液分别在1.514×10-2ng/μL-151.4ng/μL、1.499×10- 3ng/μL–149.9ng/μL、1.150×10-3ng/μL-115.0ng/μL和4.08×10-4ng/μL–4.08ng/μL的检测范围内荧光定量PCR起始模板浓度和Ct值之间具有较好的线性关系。
图3采用建立的荧光定量PCR检测体系对混合样本进行检测。其中a表示用Probe-12SrDNA体系对混合样本进行检测；b表示分别用4种种类特异性体系对混合样本中的目标品种进行检测。
a1.北太平洋鱿鱼、真蛸、虎斑乌贼的DNA以1:1:1比例混合作为待检测样品，北太平洋鱿鱼DNA与灭菌蒸馏水以1:2比例混合作为对照样品。实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。
a2.秘鲁鱿鱼、真蛸、虎斑乌贼的DNA以1:1:1比例混合作为待检测样品，秘鲁鱿鱼DNA与灭菌蒸馏水以1:2比例混合作为对照样品。实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。
a3.阿根廷鱿鱼、真蛸、虎斑乌贼的DNA以1:1:1比例混合作为待检测样品，阿根廷鱿鱼DNA与灭菌蒸馏水以1:2比例混合作为对照样品。实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。
a4.日本海鱿鱼、真蛸、虎斑乌贼的DNA以1:1:1比例混合作为待检测样品，日本海鱿鱼DNA与灭菌蒸馏水以1:2比例混合作为对照样品。实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。
b1.北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼的DNA以1:1:1:1比例混合作为待检测样品，北太平洋鱿鱼DNA与灭菌蒸馏水以1:3比例混合作为对照样品。实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。
b2.北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼的DNA以1:1:1:1比例混合作为待检测样品，秘鲁鱿鱼DNA与灭菌蒸馏水以1:3比例混合作为对照样品。实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。
b3.北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼的DNA以1:1:1:1比例混合作为待检测样品，阿根廷鱿鱼DNA与灭菌蒸馏水以1:3比例混合作为对照样品。实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。
b4.北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼的DNA以1:1:1:1比例混合作为待检测样品，日本海鱿鱼DNA与灭菌蒸馏水以1:3比例混合作为对照样品。实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。
备注说明：
1)、以图a1为例，将北太平洋鱿鱼、真蛸、虎斑乌贼3种DNA混合作为混合样品，即实验组，混合样品中，每种DNA均占总混合DNA的1/3；以仅含1/3北太平洋鱿鱼DNA，2/3的无菌蒸馏水为对照组样品；实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。采用12SrDNA引物和探针运行荧光定量PCR扩增体系；每个样品设置3个重复。
同理，a2-a4，分别将秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼DNA与真蛸、虎斑乌贼DNA以1:1:1混合，即实验组，混合样品中，每种DNA均占总混合DNA的1/3；以仅含1/3目标鱿鱼DNA，2/3的无菌蒸馏水为对照组样品；实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。采用对应的种类特异性引物和探针(OB—北太平洋鱿鱼、DG—秘鲁鱿鱼、IA—阿根廷鱿鱼、TP—日本海鱿鱼)运行荧光定量PCR扩增体系；每个样品设置3个重复。
2)、以图b1为例，以北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼和日本海鱿鱼4种混合DNA作混合样品，即实验组，混合样品中，每种DNA均占总混合DNA的1/4；以仅含1/4目标DNA(北太平洋鱿鱼)，3/4的无菌蒸馏水为对照组样品；实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。采用对应的种类特异性引物和探针(OB)运行荧光定量PCR扩增体系；每个样品设置3个重复。
同理，b2-b4，均以北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼和日本海鱿鱼4种混合DNA作混合样品，即实验组，混合样品中，每种DNA均占总混合DNA的1/4；以仅含1/4目标DNA(秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼或日本海鱿鱼)，3/4的无菌蒸馏水为对照组样品；实验组与对照组中，目标DNA的含量相等。采用对应的种类特异性引物和探针(DG、IA、TP)运行荧光定量PCR扩增体系；每个样品设置3个重复。
3)、上述每幅图中，实验组和对照组的Ct值几乎相等，所以难以有效区分实验组与对照组。结果显示，在其他样品和目标样品混合在同一管中时，占总量1/3或1/4的目标样品DNA也能被荧光定量PCR成功检测出来。并且，实验组和对照组的Ct值几乎相等，说明其它几种DNA的存在不影响目标DNA的荧光定量PCR检测。结果说明我们建立的荧光定量PCR体系在混合DNA检测中有高特异性，可以应用到后续对深加工样品的检测。
具体实施方式
实施例1、采用上述荧光定量PCR检测方法对市场上随机购买的鱿鱼冷冻产品(例如冻鱿鱼圈、冻鱿鱼胴片)种类鉴定，包括进行以下步骤：
①、待测鱿鱼样品中基因组DNA的提取；采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒提取样品DNA，于-20℃保存。
②、对常见鱿鱼特异性鉴定引物与探针的设计；
4种常见鱿鱼为：北太平洋鱿鱼(Ommastrephesbartramii)、秘鲁鱿鱼(Dosidicusgigas)、阿根廷鱿鱼(Illexargentinus)以及日本海鱿鱼(Todarodespacificus)；
具体如表1所述。
③、荧光定量PCR扩增体系设置；
以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物和探针，进行实时荧光PCR检测。
具体如下：
荧光定量PCR扩增体系设置：
反应体系为：20μL总体积中含有AceQTMqPCRProbeMasterMix10μL，鱿鱼/柔鱼科的上下游引物(10μM)各0.4μL，鱿鱼/柔鱼科的探针(10μM)0.2μL，DNA模板1.5μL，补水至20μL；每个反应重复3次，同时以1.5μL灭菌蒸馏水为模板的作为空白对照组。
备注：北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼DNA溶液的浓度分别为1.514×10-2ng/μL-151.4ng/μL、1.499×10-3ng/μL–149.9ng/μL、1.150×10-3ng/μL-115.0ng/μL和4.08×10-4ng/μL–4.08ng/μL；
同时设置三个重复和非模板空白对照管；
荧光定量PCR扩增体系参数分成如下2种：
第一种，为对于区分柔鱼科与非柔鱼科品种的Probe-12SrDNA体系：95℃预变性5min；95℃变性10sec，60℃退火并延伸31sec，40个循环；在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号；
第二种，为对于区分4种常见鱿鱼的种类特异性体系，95℃预变性5min；95℃变性10sec，63℃退火并延伸31sec，40个循环；在每个循环的63℃退火并延伸阶段收集荧光信号；(即，其退火温度均为63℃，其它参数与Probe-12SrDNA体系相同)。
④、根据实时荧光PCR检测结果进行判断(即，对市售鱿鱼样品的种类鉴定，判断是否与标签所述相符)。
扩增结果分析及结果判断的依据为：根据荧光定量PCR反应中的特异性扩增曲线与对应的阈值大小判断被检鱿鱼样品中是否属于上述4种常见鱿鱼；检测基因无特异性扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性。
即，具体为：
若柔鱼科12SrDNA检测基因无扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，即可判定该样品为非柔鱼科；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品种类属于柔鱼科。若4种常见鱿鱼的特异性体系测试均无扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，即可判定该样品非此4种常见鱿鱼；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品属于柔鱼科，且为有扩增反应的特定鱿鱼类。根据检测结果，对比标签标识的商品鱿鱼种类，从而判定出待测样品种类与标签所述是否相符合。
实验1、将事先已经确定商品名称与实际相符的以下鱼的样品(冻鱼片)按照实施例1所述方法进行检测，所得结果如下表2所述。
表2
实施例2、采用上述荧光定量PCR检测方法对市场上随机购买的鱿鱼罐头食品进行种类鉴定：
从市场上随机购买标识为鱿鱼罐头或成分中包含鱿鱼的罐头食品，采用TAKARA肉制品DNA提取试剂(Cat#9178)提取样品DNA，于-20℃保存。利用荧光定量PCR对其进行种类鉴定。若柔鱼科12SrDNA检测基因无扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，即可判定该鱼罐头样品中不包含柔鱼科鱼类成分；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中包含柔鱼科鱼类成分。若4种常见鱿鱼的特异性体系测试均无扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，即可判定该样品中不包含此4种常见鱿鱼；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有柔鱼科鱼类成分，且含有检测过程中有扩增反应的特定鱿鱼种类。根据检测结果，对比标签标识的鱿鱼种类，从而判定出待测样品种类与标签所述是否相符合。
即，将实施例1中的步骤①作了更改，其余内容同实施例1。
实验2、将事先已经确定商品名称与实际相符的鱼罐头的样品按照实施例2所述方法进行检测，所得结果如下表3所述。
表3
实施例3、采用上述荧光定量PCR检测方法对市场上随机购买的鱿鱼深加工食品进行种类鉴定：
从市场上随机购买标识为鱿鱼丝、鱿鱼片及产品成分中包含鱿鱼的商品，采用TAKARA肉制品DNA提取试剂(Cat#9178)提取样品DNA，于-20℃保存。利用荧光定量PCR对其进行种类鉴定。若柔鱼科12SrDNA检测基因无扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，即可判定该深加工产品中不包含柔鱼科鱼类成分；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中包含柔鱼科鱼类成分。若4种常见鱿鱼的特异性体系测试均无扩增曲线产生且Ct值≥34者，判定结果为阴性，即可判定该样品中不含有这4种常见柔鱼科鱼类成分；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有柔鱼类成分，且含有检测过程中有扩增反应的特定鱿鱼种类。根据检测结果，对比标签标识的商品鱿鱼种类，从而判定出待测样品种类与标签所述是否相符合。
即，将实施例1中的步骤2)作了更改，其余内容同实施例1。
实验3、将事先已经确定商品名称与实际相符的鱼类深加工风味食品的样品按照实施例3所述方法进行检测，所得结果如下表4所述。
表4
对比例1：将实施例1中所用的引物改成如表5所示的序列，其余等同于实施例1。
表5
然后将实验1所述样品按照此对比例1所述方法进行检测，所得结果如下表6所述。
表6
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.鱿鱼或其深加工产品种类鉴定的荧光定量PCR检测方法中所用的特异性引物和探针，其特征是：
所述特异性引物和探针的序列由柔鱼科以及北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼以及日本海鱿鱼中的至少任意一种以及柔鱼科组成：
2.利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是包括以下步骤：
①、待测鱿鱼样品中基因组DNA的提取；
②、对常见鱿鱼特异性鉴定引物与探针的设计；
4种常见鱿鱼为：北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼以及日本海鱿鱼；
③、荧光定量PCR扩增体系设置；
以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物和探针，进行实时荧光PCR检测；
④、根据实时荧光PCR检测结果进行判断。
3.根据权利要求2所述的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：
所述步骤②是对4种常见鱿鱼的12SrDNA及Cytb、COI、ATPase6基因的序列进行荧光定量PCR检测的特异性鉴定引物与探针的设计。
4.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：
所述探针的5’端标记有报告荧光染料，所述报告荧光染料为FAM、HEX，探针的3’端标记有淬灭荧光染料，所述淬灭荧光染料为TAMRA。
5.根据权利要求2、3或4所述的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：
所述步骤②中的特异性引物和探针的序列如权利要求1所述。
6.根据权利要求5所述的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：
所述步骤③荧光定量PCR扩增体系设置：
反应体系为：20μL总体积中含有AceQTMqPCRProbeMasterMix10μL，鱿鱼/柔鱼科的上下游引物各0.4μL，鱿鱼/柔鱼科的探针0.2μL，DNA模板1.5μL，补水至20μL；
荧光定量PCR扩增体系参数分成如下2种：
第一种，为对于区分柔鱼科与非柔鱼科品种的Probe-12SrDNA体系：95℃预变性5min；95℃变性10sec，60℃退火并延伸31sec，40个循环；在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号；
第二种，为对于区分4种常见鱿鱼的种类特异性体系，95℃预变性5min；95℃变性10sec，63℃退火并延伸31sec，40个循环；在每个循环的63℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
7.根据权利要求6所述的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：
当所述步骤①的待测鱿鱼样品为鱿鱼深加工样品，采用TAKARA肉制品DNA提取试剂提取基因组DNA；
当所述步骤①的待测鱿鱼样品为未加工鱿鱼样品，采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒。
8.根据权利要求2～7任一所述的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：
所述步骤④的扩增结果分析及结果判断为：根据荧光定量PCR反应中的特异性扩增曲线与对应的阈值大小判断被检鱿鱼样品中是否属于上述4种常见鱿鱼；检测基因无特异性扩增曲线产生或Ct值≥34者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值小于34者，可判定该样品结果为阳性。
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