CN106947817B - 一种用于蛸科物种鉴定的dna条形码 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于蛸科物种鉴定的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1‑8。本发明还提供能用于扩增上述条形码的引物，其引物序列为SEQ ID NO:9‑10。本发明提供了蛸科物种ND5基因扩增的引物及PCR方法，以蛸科物种DNA为模板，能将本科样本的ND5基因高效准确地扩增出来，为蛸科动物的分子研究奠定了基础。本发明具有简便快捷、DNA用量少、通用性好等优点，弥补了现有分子标记在蛸科动物鉴定分类及系统发生研究中的不足，同时验证了ND5基因作为蛸科DNA条形码在物种鉴定、分类和系统发生研究的适用性。

Description

一种用于蛸科物种鉴定的DNA条形码

技术领域

本发明属于分子标记筛选技术领域，具体涉及一种用于蛸科物种鉴定的DNA条形码。

背景技术

蛸科动物隶属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、八腕目(Octopoda)，分布于世界各海域，其中大部分为浅海性种类，也有少数深海种类。作为重要海洋经济生物之一，蛸科动物具有高蛋白、低脂肪，富含牛磺酸等特点，深受广大消费者喜爱。同时，因其生长快速，生活史较短，具有广阔养殖产业化前景。有助于对该科物种的准确鉴定和系统进化关系的深入了解，以及种质资源保护、管理和有效利用。

目前，有关蛸科动物的鉴定、分类和系统发育研究主要基于形态学结合分子学方法。传统的形态学特征如体长、腕长、胴体长等测量指标，具有操作简单，数据易获取等优点，广泛应用于物种描述、分类和鉴定。早在上世纪，形态学鉴定手段就广泛应用于蛸科分类和系统发生。但是，蛸科动物的形态特征可塑性强、近缘种形态差异细微，导致单纯依靠形态学特征鉴定收效甚微，仅很少一部分物种被区分开来，大多数蛸科动物分类地位仍处于混乱状态，例如蛸科中超过90％、200多个物种组成的蛸属中，由于涵盖了诸多形态特征模糊的物种，被一些学者称其为“catch all”的一个属。正因如此，越来越多的学者致力于细化蛸科分类。寻找一种通用性更高、更为稳定的鉴定方法来辅助形态学进行物种分类成为当务之急，特别是对于那些严重缺乏形态数据的物种。

发明内容

本发明提供一种用于蛸科物种鉴定的DNA条形码，可以准确对蛸科进行鉴定、分类；从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种蛸科物种的鉴定方法，是通过检测蛸科线粒体的ND5基因来完成的；

所述的蛸科物种，为砂蛸Amphioctopusaegina、条纹蛸Amphioctopusmarginatus、短蛸Amphioctopusfangsiao、真蛸Octopus vulgaris、长蛸Octopus minor、栗色蛸Octopusconispadiceus、中国小孔蛸Cistopuschinensis和台湾小孔蛸Cistopustaiwanicus。

本发明提供用于检测8个蛸科物种的DNA条形码，其序列信息如下：

用于检测砂蛸的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

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用于检测条纹蛸的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

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用于检测短蛸的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:3)：

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用于检测真蛸的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:4)：

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用于检测长蛸的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:5)：

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用于检测栗色蛸的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:6)：

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用于检测中国小孔蛸的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQIDNO:7)：

ttatatactcatgcgttatttaaggcattattatttttatgtggaggtaatattattcattgttataatggagttcaggatattcgtgatattaagggagtgagatataatttaccattaacaggggttatttttaatatttctaatatggcattatgtgggtttccttttttagcaggattttattctaaagatttaattattgagattttattaaggaataatataaatttattgatggggttatttgcaatatttggggtttgtttaactatattatattcaatacgaatatctatttttataatatgaggtgatgtaaagagggttatttatgaaaatatagaagatagtgacatatttgtggtttattcaataattattttatgttttggagctttatttggtggttttagattacagagtttagtaataagatttaatgaagttattatattacctattttttataaattacttgtattaatattgatttttttatgtatattaatttcgttgagagtatgagggttaagtaggggtaaacaaaaatataatatattatattgatgtaatagtaaaatatgatttttgtcttttttaagtggttttccttttttaatttttatgaagttaagaagaaattcaacattgaagttaattgataatggatgatt；

用于检测台湾小孔蛸的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:8)：

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本发明还提供能用于扩增上述条形码的引物，其引物序列如下：

ND5-F：TCCCTGHCCTCCTAATATTTCTAATC(SEQ ID NO:9)、

ND5-R：CTTTDTTTCATTTATATACTCATGC(SEQ ID NO:10)；

上述的DNA条形码和扩增引物用于鉴定蛸科物种，具体步骤如下：

1)提取待检测的样品的DNA，

2)用上述的引物对步骤1)提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

3)将扩增产物进行测序，

4)将测序的序列进行比对、校正、目标DNA条形码序列建树，确定待检测样品的物种。

本发明提供了蛸科物种ND5基因扩增的引物及PCR方法，以蛸科物种DNA为模板，能将本科样本的ND5基因高效准确地扩增出来，为蛸科动物的分子研究奠定了基础。本发明具有简便快捷、DNA用量少、通用性好等优点，弥补了现有分子标记在蛸科动物鉴定分类及系统发生研究中的不足，同时验证了ND5基因作为蛸科DNA条形码在物种鉴定、分类和系统发生研究的适用性。

附图说明

图1：扩增8种蛸科物种DNA模板电泳结果，其中1.砂蛸，2.条纹蛸，3.短蛸，4.真蛸，5.中国小孔蛸，6.台湾小孔蛸，7.长蛸，8.栗色蛸，9.阴性对照(其它反应条件不变，水代替模板DNA)；MK.DNA分子量标准：从上到下依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。

图2：基于全序列及扩增的ND5部分序列，以Kimura-2-parameter为模型构建NJ树。

图3：实施例3的系统树分类鉴定结果图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，所举实例只用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。

实施例1：蛸科物种鉴定DNA条形码的筛选和扩增引物的筛选

1.获得蛸科物种及幽灵蛸，共10个物种，分别为Amphioctopusaegina，Amphioctopusmarginatus，Amphioctopusfangsiao，Octopus vulgaris，Cistopuschinensis，Cistopustaiwanicus，Octopus minor，Octopus conispadiceus，Octopus bimaculatus，Vampyroteuthisinfernalis。获取上述物种共线粒体全序列，及13个蛋白编码基因作为候选基因。

2.用Clustal W软件对上述全线粒体基因序列对齐，用Gblocks去掉多余序列，应用Mega6.0软件计算序列间的K2P距离，并基于上述基因序列分别构建Maximum Likelihood(ML),Neighbor Joining(NJ)和Maximum Parsimony(MP)系统树，分析上述基因序列对蛸科物种鉴定的有效性。

3.在上述CO3，ND3，ND2，CO1，CO2，ATP8，ATP6，ND5，ND4，ND4L，Cob，ND6，ND1共13个蛋白编码基因分别构建的系统树中，基于CO2，ATP8，ND4L，ND1基因构建的系统树与全序列构建的系统树拓扑结构相差甚远；ND3，ND4,ND6基因构建的系统树与全序列构建的系统树拓扑结构差距也较大；以CO3，ND2，CO1这三种基因构建的系统树与全序列构建的系统树结构相近，仅有某个分支与全序列构建的系统树拓扑结构不同；除此之外，ND5，ATP6和Cob基因与全序列构建的系统树拓扑结构高度一致，三种基因构建的系统树与全序列构建的系统树所得置信度数据分析采用SPSS21.0软件包进行配对样本T检验，以P<0.05作为显著水平判定ND5，ATP6，Cob基因与全序列之间的相关性和差异显著性。结果如表1所示，ND5基因和全序列之间相比未出现显著下降，且ND5基因和全序列之间存在显著相关关系；ATP6，Cob基因和全序列之间相比出现显著下降，且ATP6，Cob基因和全序列之间均不存在显著相关关系。综上所述，ND5基因是最适于蛸科物种鉴定的DNA条形码。

表1配对样本T检验结果

4.用Clustal W软件对上述物种ND5基因序列对齐比对，找出ND5基因序列两侧的保守区域。用Primer5软件在保守区域设计通用引物，即上游引物ND5-F和下游引物ND5-R。引物序列如下：

ND5-F：TCCCTGHCCTCCTAATATTTCTAATC(H＝A/C/T)

ND5-R：CTTTDTTTCATTTATATACTCATGC(D＝A/G/T)

实施例2：蛸科8种物种鉴定的DNA条形码基因制备方法，

包括有以下步骤：

1.材料

8份蛸科动物，其来源详见(表2)。全部样本均由澳大利亚维多利亚博物馆名誉馆长卢重成教授进行形态学鉴定。

表2.蛸科动物样本

2.DNA提取

取各样本胴体肌肉组织，按照Mollusc DNA Kit D3373-01(Omega)试剂盒操作手册提取上述样品DNA。

3.PCR扩增

PCR反应在200ul离心管中进行，反应总体积为10ul，包括以下试剂：

为防止实验出现假阳性结果，特设置阴性对照，用无菌双去离子水替代模板DNA，按照同样的方法进行PCR扩增。

PCR反应液配制完后，2000rpm离心15s，将离心管放入PCR仪中，进行如下反应：94℃预变性3min；94℃变性45s，42℃退火1min，72℃延伸1min20s，共32个循环，72℃再延伸5min获得扩增产物。

取2ul PCR产物点至1.5％琼脂糖电泳孔中，120V电泳25min，紫外凝胶分析检测，成像。

按本发明引物及方法扩增8种蛸科动物DNA模板电泳结果如图1所示，所有蛸科样本在分子量为750bp处均有清晰单一的条带，阴性对照未出现目标条带，表明本发明扩增体系及引物能成功扩增出蛸科物种ND5基因。

4.PCR产物序列的获取及编辑

将上述PCR产物扩大30ul体系送至生物公司测序，得到相应样本对应的ND5基因序列。将序列结果通过手工校对、序列拼接，并利用Clustal W软件对齐并裁剪成长度一致的基因序列。

5.分子进化树的构建及DNA条形码序列准确性及适用性验证

基于上述基因序列数据，同时从NCBI上下载上述8种及双斑蛸、幽灵蛸线粒体全序列和ND5基因序列，用Mega 6.0软件选择Kimure-2-parameter遗传距离模型，同时采用Bootstrap重复抽样1000次循环，计算系统树中节点的自举置信水平，分别构建邻接法(NJ)分子系统树。结果如图2，从图2中可以看出，ND5序列构建的系统进化树，其拓扑结构与基于线粒体全序列构建的系统进化树的拓扑结构完全一致，其中拟蛸属、小孔蛸属各自聚为一支，蛸属为非单系发生，其中真蛸、双斑蛸亲缘关系较近等结果也支持了形态学及分子学上鉴定的属和大部分种的地位，进一步证明了本发明构建的DNA条形码在蛸科物种鉴定、分类和系统发生研究的有效性和可行性。

实施例3：ND5基因作为DNA条形码在蛸科其他物种鉴定的适用性检验：

为了验证上述ND5基因作为DNA条形码在蛸科其他物种鉴定的适用性，以不同于上述实验材料的物种Amphioctopuskagoshimensis，Thaumoctopusmimicus，Octopussp.1，Octopus sp.2作为实验对象，运用实施例2中方法进行DNA提取、PCR扩增，电泳检测均能得到如图1所示的750bp的条带，系统树分类鉴定结果如图3，能准确将上述物种区分，证明了ND5基因作为DNA条形码在蛸科其他物种鉴定的适用性。

上述实施例为本发明较好的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，在不背离发明构思的精神和范围下，任何对本发明的改变、修饰、替代、组合、简化等，都包含在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国海洋大学

<120> 一种用于蛸科物种鉴定的DNA条形码

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 705

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

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aaatatttct aatatagctt tatgtggatt tcctttttta gcagggtttt attctaagga 180

tttaattatt gagaaaataa tgagaagaaa tataaatttt tttttgaggt tatttgggtt 240

atttggagta tgcttaacta tactatatag acttcgaata agtttattta tgatttgagg 300

aaatgttaga agagtggttt atttaaatat aaaggataat gatgtttatg taattgtttc 360

tatgttgatt ttatcttttg gggcaatatt tgggggaatt ataattcaaa gtgtaattat 420

gagatttaat gaagtaattt ttttaccttt attttataaa atgatagtta tgatattatt 480

gtttttatca ttgttagtgt cattaagagt ttgagtaagg attagtagaa tttatgttag 540

taatattttt gtttgattta atagaaaaat atgatttttg tcttctttga gaggataccc 600

ctttttattg ataataaaaa atattactaa tattaattta aaagtagttg atataggtt 659

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 9

<400> 9

tccctghcct cctaatattt ctaatc 26

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 10

<400> 10

ctttdtttca tttatatact catgc 25

Claims (1)

1.一种鉴定蛸科物种的方法，所述的蛸科物种为砂蛸Amphioctopus aegina、条纹蛸Amphioctopus marginatus、短蛸Amphioctopus fangsiao、真蛸Octopus vulgaris、长蛸Octopus minor、栗色蛸Octopus conispadiceus、中国小孔蛸Cistopus chinensis和台湾小孔蛸Cistopus taiwanicus；其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1）提取待检测的样品的DNA，

2）用引物对步骤1）提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

所述的引物，包含有上游引物ND5-F和下游引物ND5-R，其引物序列如下：

ND5-F：TCCCTGHCCTCCTAATATTTCTAATC，其中H=A/C/T；

ND5-R：CTTTDTTTCATTTATATACTCATGC，其中D=A/G/T；

3）将扩增产物进行测序，

4）序列比对、校正、目标DNA 条形码序列建树，确定待检测样品的物种；

所述的目标DNA条形码为：

用于检测砂蛸的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，

用于检测条纹蛸的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，

用于检测短蛸的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3，

用于检测真蛸的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4，

用于检测长蛸的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5，

用于检测栗色蛸的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:6，

用于检测中国小孔蛸的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7，

用于检测台湾小孔蛸的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

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