TWI387651B

TWI387651B - 鑑別大冠鷲與鳳頭蒼鷹性別之ｄｎａ標記及引子組

Info

Publication number: TWI387651B
Application number: TW98104788A
Authority: TW
Inventors: Shin Torng Ding; Pei Hwa Wang; Ming Chieh Chao; Hsiao Wei Yuan; Hsien Shao Tsao; Hsin An Hsu
Original assignee: Univ Nat Taiwan; Taipei Zoo
Priority date: 2009-02-16
Filing date: 2009-02-16
Publication date: 2013-03-01
Also published as: TW201031755A

Description

鑑別大冠鷲與鳳頭蒼鷹性別之DNA標記及引子組

本發明係關於猛禽類之性別鑑定，尤指大冠鷲與鳳頭蒼鷹之性別鑑定。

在稀有飛禽類之保育繁殖工作上，正確的性別鑑定可提高人工配對繁殖效率。單態性鳥類性別判定不易由外觀鑑定，過去曾有藉由內視鏡檢測體內的性腺予以判定，但容易受到年齡以及季節所影響而有誤判。因此發展出以飛禽類之基因標記CHD1基因，其在染色體Z與W的內插子大小不同，因此以聚合酶連鎖反應(PCR)擴增產物，雄性會產生一條片段，雌性會產生2條片段。常用的引子組中只有引子組1237L/1272H能夠分辨大冠鷲性別，其他的引子組則不行(Wang,L.C.,C.T.Chen,H.Y.Lee,S.H.Li,J.T.Lir,S.C.Chin,C.E.Pu,and C.H.Wang；Sexing a wider range of avian species based on two CHD1 introns with a unified reaction condition.Zoo biology 26：425-431,2007)。雖然利用引子組1237L/1272可判定大冠鷲性別，其所擴增出來的CHD1-W與CHD1-Z大小非常相近，需使用非常高濃度的瓊脂膠體(例如4%)以及較長電泳時間才能夠將片段稍為分開，或需要利用高解析的10-12%聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)進行區分(Griffiths,R.,M.C.Double,K.Orr,and R.J.Dawson；A DNA test to sex most birds.Mol.Ecol.7：1071-1075,1998；Kahn,N.W.,J.S.John,and T.W.Quinn.；Chromosome-specific intron size differences in the avian CHD gene provide an efficient method for sex identification in birds.Auk.115：1074-1078.,1998)，這些都增加了試驗成本以及所花費的時間。

Chang et al.(Chang,H.W.,C.A.Cheng,D.L.Gu,C.C.Chang,S.H.Su,C.H.Wen,Y.C.Chou,T.C.Chou,C.T.Yao,C. L.Tsai,and C.C.Cheng；High-throughput avian molecular sexing by SYBR green-based real-time PCR combined with melting curve analysis.BMC Biotechnol.8：12,2008)利用PCR-解離曲線分析(PCR-melting curve analysis，PCR/MCA)技術，根據CHD1-W與CHD1-Z序列設計二組新的大冠鷲性別鑑定引子組(CHD-W-F/CHD-W-R和CHD-Z-F/CHD-Z-R)，能夠使CHD1-W與CHD1-Z片段大小差異大，易於辨識。然而此法需使用二組引子組，以及使用即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)機器才能夠完成性別鑑定，需要更多的技術配合，執行方法困難。

有鑑於此，尋找性別特異片段差異更大，且能快速分析與更準確判讀性別的標記DNA序列，並進而開發可用以有效且快速鑑定大冠鷲性別之引子組是有其必要的。

為解決先前技術的限制，使大冠鷲性別鑑定能夠更為迅速，本發明目的在提供大冠鷲的性別特異性核苷酸片段，利用此性別特異性片段開發出得以有效鑑定大冠鷲性別的引子組，進而開發為能夠有效且更為迅速鑑定大冠鷲性別之方法及套組，以提高人工配對繁殖效率，進而達到對於此台灣稀有的保育類野生動物的保育繁殖。

本發明之一方面，為提供一種用以鑑別大冠鷲性別之性別特異性之核苷酸片段。依本發明，利用逢機增殖多態性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技術，從大冠鷲具多態性之DNA指紋環帶中，找到2個性別特異性之標記核苷酸片段，命名為BB08與AT15，分別具有1241及1388個核苷酸，電泳膠圖如圖1(A)及1(B)；其核苷酸序列為SEQ ID NO(序列識別號)：1及SEQ ID NO：2。與前人已發現之大冠鷲基因序列比對，為新的基因序列。

本發明之另一方面，為提供一種用以鑑別大冠鷲性別之引子組，係利用本發明鑑別大冠鷲性別之性別特異性之核苷酸片段 SEQ ID NO(序列識別號)：1或SEQ ID NO：2設計。

本發明之再一方面，為提供一種大冠鷲性別鑑定之方法。

在本發明之具體實施例中，根據本發明選殖之性別特異性核苷酸片段BB08與AT15，設計出多組可用於鑑定大冠鷲性別的引子組，包括CseBB08-5aF/R、CseBB08-5aF/CseBB08-5bR、CseBB08-7F/R和CseAT15F/R，如表1所列：

根據本發明，同時發現引子組CseBB08-5aF/CseBB08-5bR亦可跨物種而應用於辨別鳳頭蒼鷹性別，因此，本發明之又一方面，為提供一種用以鑑別鳳頭蒼鷹性別之引子組CseBB08-5aF/CseBB08-5bR。

在本發明之具體實施例中，根據本發明選殖之性別特異性核苷酸片段BB08與AT15設計開發得之引子組進行大冠鷲基因組選殖，發現下列性別特異性核苷酸片段：(1)以引子組CseBB08-5aF和CseBB08-5aR增幅大冠鷲基因組DNA，電泳膠圖如圖2，雌性大冠鷲發現有一553bp之性別特異核苷酸片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：10；(2)以引子組CseBB08-5aF和CseBB08-5bR增幅大冠鷲基因組DNA，電泳膠圖如圖3雌性大冠鷲發現有一895bp之性別特異核苷酸片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：11； (3)以引子組CseBB08-7F和CseBB08-7R增幅大冠鷲基因組DNA，電泳膠圖如圖4，雌性及雄性大冠鷲均發現有一543bp之內在控制核苷酸片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：12；及雌性大冠鷲發現有一193bp之性別特異核苷酸片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：13；及(4)以引子組CseAT15F和CseAT15R增幅大冠鷲基因組DNA，電泳膠圖如圖5，雌性及雄性大冠鷲均發現有一734bp之內在控制核苷酸片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：14；及雌性大冠鷲發現有一147bp之性別特異核苷酸片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：15。

根據本發明，上述任一性別特異核苷酸片段，均可用於辨別大冠鷲性別。

本發明之又一方面，為提供一種用以鑑別鳳頭蒼鷹之引子組，係利用本發明引子組，針對待鑑定之大冠鷲樣本進行PCR反應加以鑑別。根據本發明之實施例，可使用引子組CseBB08-5aF/R、CseBB08-5aF/CseBB08-5bR、CseBB08-7F/R或CseAT15F/R鑑別大冠鷲之性別，準確率達100%。

根據本發明實施例，係利用引子組CseBB08-5aF/R，針對待鑑定之大冠鷲樣本進行PCR反應加以鑑別，以具有SEQ ID NO：10之核苷酸序列片段為雌性性別標記片段。

根據本發明實施例，係利用引子組CseBB08-5aF/CseBB08-5bR，針對待鑑定之大冠鷲樣本進行PCR反應加以鑑別，以具有SEQ ID NO：11之核苷酸序列片段為雌性性別標記片段。

根據本發明實施例，係利用引子組CseBB08-7F/R，針對待鑑定之大冠鷲樣本進行PCR反應加以鑑別，以具有SEQ ID NO：12之核苷酸序列片段為一內在控制片段，及具有SEQ ID NO：13之核苷酸序列片段為雌性性別標記片段。

根據本發明實施例，係利用引子組CseAT15F/R，針對待鑑定之大冠鷲樣本進行PCR反應加以鑑別，以具有SEQ ID NO：14 之核苷酸序列片段為一內在控制片段，及具有SEQ ID NO：15之核苷酸序列片段為雌性性別標記片段。

本發明之又再一方面，為提供一種鳳頭蒼鷹性別鑑定之方法，係利用本發明引子組CseBB08-5aF和CseBB08-5bR，針對待鑑定之鳳頭蒼鷹樣本進行PCR反應加以鑑別。

在本發明之具體實施例中，以引子組CseBB08-5aF和CseBB08-5bR增幅鳳頭蒼鷹基因組DNA，電泳膠圖如圖6，雌性鳳頭蒼鷹發現有一895bp之性別特異性核苷酸片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：16，其可用於辨別鳳頭蒼鷹性別。

根據本發明實施例，一鳳頭蒼鷹性別鑑定之方法係利用引子組CseBB08-5aF和CseBB08-5bR，針對待鑑定之鳳頭蒼鷹樣本進行PCR反應加以鑑別，以具有SEQ ID NO：16之核苷酸序列片段為雌性性別標記片段。

本發明同時提供一種鑑別大冠鷲或鳳頭蒼鷹性別鑑定之PCR套組。對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者，得依一般知識組合本發明引子組，以及為進行PCR反應之必要試劑及器具，製備開發供商業使用之PCR套組。

實施例一 DNA萃取及定量一、基因組DNA之萃取 1.血液樣本之基因組DNA萃取

參考Wu et al.(Wu,C.P.,Y.M.Homg,R.T.Wang,K.T.Yang,and M.C.Huang,A novel sex-specific DNA marker in columbidae birds.Theriogenology 67：328-333,2007)所揭示之方法修飾以萃取血液樣本中之基因組DNA。首先將新鮮的血液樣本以3500 rpm離心15分鐘以分離血漿，並以生理食鹽水潤洗血球層2次。取20 μl的血球，加入3 ml的裂解緩衝液(lysis buffer，內含10 mM Tris-Cl,150 mM NaCl,10 mM EDTA,pH=8.0)懸浮，再加入60 μl蛋白酶K(proteinase K)(10mg/ml)(Amresco，美國)以及200 μl的10% SDS混合均勻，於55℃作用12小時以上。之後依序以等體積的酚(phenol)、酚(phenol)/氯仿(chloroform)和氯仿(chloroform)萃取水層，再加入0.8倍體積的100%異丙醇(isopropanol)沉澱，沉澱之DNA分別以1 ml 70%酒精潤洗2次。待DNA乾燥後加入適量去離子水(ddH₂O)，於55℃回溶，待DNA回溶後，先檢測DNA品質及定量，如DNA品質及含量皆不錯時，保存於-80℃。

2.組織樣本之基因組DNA萃取

首先取組織0.1 g放入1.5 ml微量離心管，加入500 μl的裂解緩衝液(lysis buffer)後，以剪刀將組織剪碎，再加入100 μl 10% SDS以及60 μl蛋白酶K(proteinase K)(10mg/ml)(Amresco，美國)混合均勻，於55℃作用12小時以上。之後依序以等體積的酚(phenol)、酚(phenol)/氯仿(chloroform)和氯仿(chloroform)萃取水層，再加入0.8倍體積的100%異丙醇(isopropanol)沉澱，沉澱之DNA分別以1 ml 70%酒精潤洗2次。待DNA乾燥後加入適量ddH₂O，於55℃回溶，待DNA回溶後，先檢測DNA品質及定量，如DNA品質及含量皆不錯時，保存於-80℃。

3. DNA定量

以分光光度計(NanoDrop 1000,Thermo Scientific，美國)偵測260與280 nm兩波長之吸光度(OD值)，以OD260/280判斷核酸純度(一般OD260/280比值應在1.8-2.0之間)，並以OD260吸光值推算DNA濃度。DNA定量後，取部份DNA樣品以ddH₂O調整DNA濃度分別成為10和50 ng/μl，保存於-20℃供分子鑑定之用。

實施例二大冠鷲性別特異性核苷酸片段之選殖一、RAPD指紋鑑定

本試驗以大冠鷲和領角鴞基因組DNA為模板，所使用的逢機引子序列來自RAPD 10 mers kits(Operon Biotechnologies，德國)所設計的6組引子組(OPBA、 OPBB、OPBC、OPAN、OPAT和OPAZ)，合計120條逢機引子(random primer)，所使用逢機引子序列如表2所示。

PCR反應總體積為20 μl，內含50 ng DNA、0.4 μM核酸引子和10 μl 2X Taq DNA Polymerase Master Mix RED(Ampliqon，丹麥)。反應條件為95℃加熱10分鐘，再以95℃加熱1分鐘，36℃黏合1分鐘，72℃延展2分鐘，進行45個循環，最後以72℃延展10分鐘。反應後取10 μl之PCR產物以2%瓊脂膠體進行電泳分析，再以含EtBr染色液染色10分鐘，退染20分鐘後，置於UV燈箱上觀察並以影像處理系統拍照存檔。

二、性別特異性核苷酸片段之回收

將含有性別特異性片段PCR產物之瓊脂膠體切出，DNA經回收後，構築於pGEM-T easy載體(pGEM-T Easy Vector system,Promega,Madison，美國)上，送入HIT DH5α勝任細胞(competent cells)(HIT^TM Competent Cells,United Bioinformatica,Calgary，加拿大)轉形。於LB固體培養基(Bionovas，美國)上挑選單一白色菌株，以colony-PCR確認所選殖的PCR產物長度是否正確。將確認帶有重組質體的菌液完成核苷酸定序工作。定序所得的核酸序列以美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)線上程式(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，選擇適當之基因組資料庫(物種選擇雞Gallus gallus之genomic databases)和核苷酸基因組資料庫(nucleotide databases)進行不同物種之相似基因序列比對。

從大冠鷲具多態性之DNA指紋環帶中，經逢機引子組OPBB08進行RAPD試驗所得結果如圖1(A)，找到性別特異性之標記核苷酸片段，命名為BB08，具1241bp，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：1。經逢機引子組OPAT15進行RAPD試驗所得結果如圖1(B)，找到性別特異性之標記核苷酸片段，命名為AT15，具1388bp，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：2。利用NCBI資料庫(動物別為Gallus gallus之基因組資料庫及和核苷酸資料庫)以BLAST進行比對，並未搜尋到與BB08或AT15性別特異片段完整相似度高的序列，顯示其為新發現之序列。

實施例二大冠鷲性別鑑定之引子組之設計

選殖的DNA片段定序之後，以Primer Designer軟體設計適當的引子。根據性別特異性核苷酸片段BB08，得下列3組引子組：

根據性別特異性核苷酸片段AT15，得引子組：

以上述引子組進行PCR反應。引子序列、黏合溫度以及循環次數如表3所示。

其PCR反應總體積為10 μl，內含10 ng基因組DNA、引子各0.3 μM和2X Taq DNA Polymerase Master Mix RED(Ampliqon)。PCR反應以熱循環反應器(T-Gradient thermocycler,Biometra，德國)進行，反應條件為95℃加熱5分鐘，95℃加熱45秒，61-67℃黏合30秒，72℃延展1分鐘，進行30-35個循環，最後以72℃延展10分鐘。反應所得產物進行1.5%瓊脂膠體電泳分析，再以含EtBr染色液染色10分鐘，退染20分鐘後，置於UV燈箱上觀察並以影像處理系統拍照存檔，用以鑑定性別。

實施例三禽類性別鑑定一、試驗動物

動物DNA樣本、血液樣本或組織樣本分別取自台北市立動物園(Taipei Zoo)的大冠鷲12隻及鳳頭蒼鷹3隻，以及特有生物研究保育中心(Endemic Species Research Institute)的大冠鷲29隻及鳳頭蒼鷹5隻。其中大冠鷲20隻以內視鏡檢測性別，而大冠鷲1隻及鳳頭蒼鷹2隻以其他方法(如屍體解剖或曾有下蛋的情形等依據)判定性別。而在有以內視鏡檢測性別的大冠鷲中，有13隻已知其年齡(9隻成鳥和4隻亞成鳥)。

二、PCR性別鑑定

以試驗動物血液為樣本，進行基因組DNA萃取，以黃魚鴞、鳳頭蒼鷹與草鴞基因組DNA為模板，以實施例二所得引子組及方法進行溫度梯度(gradient)PCR。PCR反應總體積為10 μl，內含10 ng基因組DNA、引子各0.3 μM和2X Taq DNA Polymerase Master Mix RED(Ampliqon，丹麥)。PCR反應以熱循環反應器(T-Gradient thermocycler,Biometra，德國)進行，反應條件為95℃加熱5分鐘，95℃加熱45秒，61、63、65及67℃溫度梯度黏合30秒，72℃延展1分鐘，進行30-35個循環，最後以72℃延展10分鐘。反應所得產物進行1.5%瓊脂膠體電泳分析，再以含EtBr染色液染色10分鐘，退染20分鐘後，置於UV燈箱上觀察並以影像處理系統拍照存檔。

(1)大冠鷲之性別鑑定：CseBB08-5aF/R

以CseBB08-5aF和CseBB08-5aR引子組增幅大冠鷲基因組DNA，PCR產物進行1.5%瓊脂膠體電泳分析結果如圖2所示，雄大冠鷲沒有擴增出任何片段，而雌大冠鷲可擴增出553 bp之片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：10，為大冠鷲之雌性性別標記片段，性別鑑定準確率達100%(41隻/41隻)。

(2)大冠鷲之性別鑑定：CseBB08-5aF和CseBB08-5bR

以CseBB08-5aF和CseBB08-5bR引子組增幅大冠鷲基因組DNA，PCR產物電泳分析結果如圖3所示，雄大冠鷲沒有擴增出任何片段，而雌大冠鷲可擴增出895bp之片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：11，為大冠鷲之雌性性別標記片段。性別鑑定準確率亦達100%(41隻/41隻)。

(3)大冠鷲之性別鑑定：CseBB08-7F和CseBB08-7R

以CseBB08-7F和CseBB08-7R引子組增幅大冠鷲基因組DNA，PCR產物電泳分析結果如圖4所示，雌大冠鷲可擴增出193及543 bp二個片段，而雄大冠鷲擴增出543 bp片段。其中同時出現於雌性及雄性大冠鷲中之543 bp片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：12，可作為內在控制片段；僅出現於雌性大冠鷲中之193 bp片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：13，可作為大冠鷲之之雌性性別標記片段。性別鑑定準確率達100%(41隻/41隻)。

(4)大冠鷲之性別鑑定：CseAT15F/R

以CseAT15F和CseAT15R引子組增幅大冠鷲基因組DNA，PCR產物電泳分析結果如圖5所示，雌大冠鷲可擴增出147及734 bp二個片段，而雄大冠鷲擴增出147 bp片段。其中同時出現於雌性及雄性大冠鷲中之147 bp片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：14，可作為內在控制片段；僅出現於雌性大冠鷲中之734 bp片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：15，可作為大冠鷲之雌性性別標記片段。性別鑑定準確率達100%(41隻/41隻)。

(5)鳳頭蒼鷹之性別鑑定

以鳳頭蒼鷹血液為樣本，進行基因組DNA萃取，之後以引子組CseBB08-5aF/CseBB08-5bR進行PCR反應，反應條件為95℃加熱5分鐘，95℃加熱45秒，63℃黏合30秒，72℃延展1分鐘，進行30個循環，最後以72℃延展10分鐘。反應所得產物進行1.5%瓊脂膠體電泳分析，結果如圖6所示，雄鳳頭蒼鷹沒有擴增出任何片段，而雌鳳頭蒼鷹可擴增出895 bp片段，具有核苷酸序列如SEQ ID NO：16，可作為鳳頭蒼鷹之雌性性別標記片段。性別鑑定準確率達100%(8隻/8隻)。

圖1為大冠鷲性別特異性之核苷酸片段，其中圖1(A)為大冠鷲基因組DNA經逢機引子組OPBB08進行RAPD試驗所得，具性別特異性之核苷酸片段1241bp；圖1(B)為大冠鷲基因組DNA經逢機引子組OPAT15進行RAPD試驗所得，具性別特異性之核苷酸片段1388bp。

圖2為以CseBB08-5aF和CseBB08-5aR引子組增幅大冠鷲基因組DNA之電泳膠圖，其中雌性大冠鷲具性別特異性之核苷酸片段553bp。

圖3為以CseBB08-5aF和CseBB08-5bR引子組增幅大冠鷲基因組DNA之電泳膠圖，其中雌性大冠鷲具性別特異性之核苷酸片段895bp。

圖4為以CseBB08-7F和CseBB08-7R引子組增幅大冠鷲基因組DNA之電泳膠圖，其中雌性大冠鷲具性別特異性之核苷酸片段193bp；並含內在控制片段543bp。

圖5以CseAT15F和CseAT15R引子組增幅大冠鷲基因組DNA之電泳膠圖，其中雌性大冠鷲具性別特異性之核苷酸片段734bp；並含內在控制片段147bp。

圖6為以CseBB08-5aF和CseBB08-5bR引子組增幅鳳頭蒼鷹基因組DNA之電泳膠圖，其中雌性鳳頭蒼鷹具性別特異性之核苷酸片段895bp。

<110> 國立臺灣大學；台北市立動物園

<120> 鑑別大冠鷲與鳳頭蒼鷹性別之DNA標記及引子組

<140>

<141>

<160> 19

<210> 1

<211> 1241

<212> DNA

<213> 大冠鷲

<400> 1

<210> 2

<211> 1388

<212> DNA

<213> 大冠鷲

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

<210> 10

<211> 553

<212> DNA

<213> 大冠鷲

<400> 10

<210> 11

<211> 895

<212> DNA

<213> 大冠鷲

<400> 11

<210> 12

<211> 543

<212> DNA

<213> 大冠鷲

<400> 12

<210> 13

<211> 193

<212> DNA

<213> 大冠鷲

<400> 13

<210> 14

<211> 734

<212> DNA

<213> 大冠鷲

<400> 14

<210> 15

<211> 147

<212> DNA

<213> 大冠鷲

<400> 15

<210> 16

<211> 895

<212> DNA

<213> 鳳頭蒼鷹

<400> 16

Claims

一種用以鑑別大冠鷲性別之性別特異性核苷酸片段，其係為具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之核苷酸序列。
一種鑑別大冠鷲性別之方法，其包括：(a)分析大冠鷲之核酸樣本，設計一引子組以增幅大冠鷲性別特異標記片段，其中該性別特異標記片段係為SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11之核苷酸序列片段；以及(b)判斷該大冠鷲之性別，其中如自該核酸樣本增幅出SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11之核苷酸序列片段，表示該大冠鷲是雌性；反之，若無法自核酸樣本增幅出SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11之核苷酸序列片段，表示該大冠鷲為雄性。
一種鑑別大冠鷲性別之方法，其包括：(a)分析大冠鷲之核酸樣本，設計一引子組以同時增幅大冠鷲性別特異標記片段及內在控制片段，其中該性別特異標記片段係為SEQ ID NO：13之核苷酸序列片段，該內在控制片段係為SEQ ID NO：12之核苷酸序列片段；以及(b)判斷該大冠鷲之性別，其中如自該核酸樣本同時增幅出SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：12之核苷酸序列片段，表示該大冠鷲是雌性；如自該核酸樣本增幅出SEQ ID NO：12之核苷酸序列片段，而無法增幅出SEQ ID NO：13之核苷酸序列片段，表示該大冠鷲為雄性。
一種鑑別大冠鷲性別之方法，其包括：(a)分析大冠鷲之核酸樣本，設計一引子組以同時增幅大冠鷲性別特異標記片段及內在控制片段，其中該性別特異標記片段係為SEQ ID NO：15之核苷酸序列片段，該內在控制片段係為SEQ ID NO：14之核苷酸序列片段；以及(b)判斷該大冠鷲之性別，其中如自該核酸樣本同時增幅出SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：14之核苷酸序列片段，表示該大冠鷲是雌性；如自該核酸樣本增幅出SEQ ID NO：14 之核苷酸序列片段，而無法增幅出SEQ ID NO：15之核苷酸序列片段，表示該大冠鷲為雄性。
一種用以鑑別大冠鷲性別之引子組，其係為：(1)CseBB08-5aF：CTGCAGCTGTTAATCCTCTCTC(SEQ ID NO：3)，及CseBB08-5aR：TTACACTGACGGATTGCGTGGT(SEQ ID NO：4)；(2)CseBB08-5aF：CTGCAGCTGTTAATCCTCTCTC(SEQ ID NO：3)，及CseBB08-5bR：TTGGTGTTCCAAGTGGTGTTCC(SEQ ID NO：5)；(3)CseBB08-7F：CTAGACTAATAGGTTGCGGTCC(SEQ ID NO：6)，及CseBB08-7R：GGTGGCGATATGTATTCACTGC(SEQ ID NO：7)；或(4)CseAT15F：GTAACGGATACTCTGACCAGGA(SEQ ID NO：8)，及CseAT15R：GTGCACCAGTGTCTACTAGAGC(SEQ ID NO：9)。
根據請求項5之鑑別大冠鷲性別之引子組，其中引子組為CseBB08-5aF：CTGCAGCTGTTAATCCTCTCTC(SEQ ID NO：3)，及CseBB08-5aR：TTACACTGACGGATTGCGTGGT(SEQ ID NO：4)，則得一大冠鷲之雌性性別標記片段，其具有SEQ ID NO：10之核苷酸序列。
根據請求項5之鑑別大冠鷲性別之引子組，其中引子組為CseBB08-5aF：CTGCAGCTGTTAATCCTCTCTC(SEQ ID NO：3)，及CseBB08-5bR：TTGGTGTTCCAAGTGGTGTTCC(SEQ ID NO：5)，則得一大冠鷲之雌性性別標記片段，其具有SEQ ID NO：11之核苷酸序列。
根據請求項5之鑑別大冠鷲性別之引子組，其中引子組為CseBB08-7F：CTAGACTAATAGGTTGCGGTCC(SEQ ID NO：6)，及CseBB08-7R：GGTGGCGATATGTATTCACTGC(SEQ ID NO：7)，則得一大冠鷲之雌性性別標記片段，其具有SEQ ID NO：13之核苷酸序列；及一內在控制片段，其具有SEQ ID NO：12 之核苷酸序列。
根據請求項5之鑑別大冠鷲性別之引子組，其中引子組為CseAT15F：GTAACGGATACTCTGACCAGGA(SEQ ID NO：8)，及CseAT15R：GTGCACCAGTGTCTACTAGAGC(SEQ ID NO：9)，則得一大冠鷲之雌性性別標記片段，其為具有SEQ ID NO：15之核苷酸序列；及一內在控制片段，其具有SEQ ID NO：14之核苷酸序列。
一種用以鑑別大冠鷲性別之性別特異性標記片段，其係為選自由具有SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：15之核苷酸序列片段所組成之群之一者。
一種大冠鷲性別鑑定方法，其係利用根據請求項5、6、7、8、或9之引子組，針對待鑑定之大冠鷲樣本進行PCR反應加以鑑別。
根據請求項11之大冠鷲性別鑑定方法，其係利用根據請求項6之引子組，針對待鑑定之大冠鷲樣本進行PCR反應加以鑑別，以具有SEQ ID NO：10之核苷酸序列片段為雌性性別標記片段。
根據請求項11之大冠鷲性別鑑定方法，其係利用根據請求項7之引子組，針對待鑑定之大冠鷲樣本進行PCR反應加以鑑別，以具有SEQ ID NO：11之核苷酸序列片段為雌性性別標記片段。
根據請求項11之大冠鷲性別鑑定方法，其係利用根據請求項8之引子組，針對待鑑定之大冠鷲樣本進行PCR反應加以鑑別，以具有SEQ ID NO：12之核苷酸序列片段為一內在控制片段，及具有SEQ ID NO：13之核苷酸序列片段為雌性性別標記片段。
根據請求項11之大冠鷲性別鑑定方法，其係利用根據請求項9之引子組，針對待鑑定之大冠鷲樣本進行PCR反應加以鑑別，以具有SEQ ID NO：14之核苷酸序列片段為一內在控制片段，及具有SEQ ID NO：15之核苷酸序列片段為雌性性別標記片段。
一種用以鑑別鳳頭蒼鷹性別之引子組，其係為：CseBB08-5aF：CTGCAGCTGTTAATCCTCTCTC(SEQ ID NO：3)，及CseBB08-5bR：TTGGTGTTCCAAGTGGTGTTCC(SEQ ID NO：5)。
根據請求項16之鑑別鳳頭蒼鷹性別之引子組，其中可擴增得一鳳頭蒼鷹之雌性性別標記片段，其具有SEQ ID NO：16之核苷酸序列。
一種用以鑑別鳳頭蒼鷹性別之性別特異性標記片段，其係為具有SEQ ID NO：16之核苷酸序列片段。
一種鳳頭蒼鷹性別鑑定方法，其係利用根據請求項16或17之引子組，針對待鑑定之鳳頭蒼鷹樣本進行PCR反應加以鑑別。
根據請求項19之鳳頭蒼鷹性別鑑定方法，其係利用根據請求項16之引子組，針對待鑑定之鳳頭蒼鷹樣本進行PCR反應加以鑑別，以具有SEQ ID NO：16之核苷酸序列為雌性性別標記片段。
一種大冠鷲性別鑑定之PCR套組，其包含根據請求項5、6、7、8、或9之引子組，以及為進行PCR反應所需之試劑及器具。
一種鳳頭蒼鷹性別鑑定之PCR套組，其包含根據請求項16之引子組，以及為進行PCR反應所需之試劑及器具。