CN111850138B - 一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试剂盒及区分方法 - Google Patents

一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试剂盒及区分方法 Download PDF

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Abstract

一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试剂盒及区分方法，它涉及一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试剂盒及其应用。本发明区分引物对为HLJFLf2和HLJFLr2。本发明区分试剂盒括分子标记引物对HLJFLf2和HLJFLr2。本发明区分方法：一、提取待测基因组DNA；二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf2和HLJFLr2为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、对PCR产物进行电泳检测，电泳结果仅出现249bp条带的对应个体为纯种黑龙江三角鲂，仅出现335bp条带的个体为纯种团头鲂，同时出现249bp和335bp条带的为黑龙江三角鲂与团头鲂的杂交种。

Description

一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试 剂盒及区分方法
技术领域
本发明涉及一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试剂盒及其应用。
背景技术
我国现存鲂属鱼类有4个种，分别为长江上游的厚颌鲂、长江中下游大型湖泊中的团头鲂(武昌鱼)、珠江和海南诸水系的广东鲂和广泛分布多个水系的三角鲂。
黑龙江三角鲂是黑龙江流域特有的名鱼“三花五罗”中的“法罗”，也是黄河以北唯一自然分布的鲂属鱼类。该鱼个体大、抗逆性强、脂高味美，养殖潜力巨大；另一方面，长期地理隔离和独特生境可能使其蕴藏未来鲂属鱼类育种所需的关键基因或标记，体现了其潜在的科研价值。长期捕捞和污染已使栖息在松花江、嫩江、镜泊湖和兴凯湖的三角鲂种群绝迹多年，现每年仅在中俄界江黑龙江抚远江段可见少量三角鲂个体。黑龙江三角鲂已被俄罗斯列入濒危鱼类保护红皮书，但尚未引起我国相关部门的重视。由于其性成熟晚(5龄以上)、易捕捞、群体恢复缓慢，该鱼正面临灭绝危机。
鲂属不同种类形态均极为相似，特别在性成熟前的早期生长阶段。从现有的形态学研究看，还缺乏直观、明显的差异可区分黑龙江三角鲂与其他鲂属鱼类的方法。为此申请人已于2018年提出“一种区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的分子标记、试剂盒及区分方法”申请，该技术方案利用分子标记技术在未发生杂交的情况下，可用于区别黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类(钱塘江三角鲂、金沙河水库三角鲂、团头鲂和厚颌鲂)。近几年，养殖团头鲂(俗称武昌鱼)的产量逐年增加，其培育品种“浦江1号”开始越来越多地出现在东北养殖水域，给黑龙江三角鲂的基因库带来了潜在威胁。目前，现有技术无法对黑龙江三角鲂和团头鲂及其杂交种进行准确鉴别，因此是否在黑龙江流域的相关江段存在二者的天然杂交种仍不清楚，急需一种检测黑龙江三角鲂和团头鲂及其杂交种的技术方法，以更好地保护濒危的黑龙江三角鲂种质资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种可区分黑龙江三角鲂和广泛养殖的团头鲂及其杂交种的方法及分子标记。
本发明区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记的引物对为HLJFLf2和HLJFLr2，具体序列为：
HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'
HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。
本发明区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的试剂盒，该试剂盒包括分子标记引物对HLJFLf2和HLJFLr2。
本发明区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法按以下步骤进行：
一、提取待测鱼类鳍条的基因组DNA；
二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf2和HLJFLr2为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
三、对PCR产物进行电泳检测，电泳结果仅出现249bp条带的对应个体为纯种黑龙江三角鲂，仅出现335bp条带的个体为纯种团头鲂，同时出现249bp和335bp条带的为黑龙江三角鲂与团头鲂的杂交种；
其中，HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'
HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。
进一步，该方法还包括步骤四，步骤四：以杂交种个体基因组DNA为模板，用分子标记引物对HLJFLf1与HLJFLr1进行PCR扩增，获得PCR产物；利用限制性内切酶Taq I对PCR产物进行酶切；凝胶电泳中出现180bp和200bp双条带的对应个体是父本为团头鲂、母本为黑龙江三角鲂的杂交种；凝胶电泳中出现157bp和223bp双条带的个体是母本为团头鲂、父本为黑龙江三角鲂的杂交种；其中，HLJFLf1：5'-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3'；HLJFLr1：5'-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3'。
本发明分子标记引物对可以快速、高效、稳定的区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种。
采用本发明提供的鉴定试剂盒和方法，可直接对黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种进行区分、鉴定，且可对杂交种的父母本来源进行进一步区分，该方法的准确性高、操作过程简洁、用时短，准确率达到100％。
采用本发明可准确地鉴别黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种，而且能确定其亲本来源，可应用于适时掌握濒危的黑龙江三角鲂基因库是否受到养殖团头鲂的污染，这对于黑龙江三角鲂种质资源的科学保护具有重要意义。
附图说明
图1是实施例1样品经分子标记的引物对为HLJFLf2和HLJFLr2扩增后的凝胶电泳图。
图2是实施例2编号7-12的样品经分子标记的引物对为HLJFLf1和HLJFLr1扩增后的凝胶电泳图。
图3是实施例2编号7-12的样品PCR产物分别进行酶切后的凝胶电泳图。
具体实施方式
具体实施方式一：本发明区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记的引物对为HLJFLf2和HLJFLr2，具体序列为：
HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'
HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。
具体实施方式二：区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括分子标记引物对HLJFLf2和HLJFLr2。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点在于该试剂盒还包括去离子水、10×Taq Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、RE缓冲液10×Buffer、牛血清白蛋白BSA、TaqI内切酶和分子标记引物对HLJFLf1与HLJFLr1；其中，HLJFLf1：5'-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3'；HLJFLr1：5'-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3'。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、提取待测鱼类鳍条的基因组DNA；
二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf2和HLJFLr2为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
三、对PCR产物进行电泳检测，电泳结果仅出现249bp条带的对应个体为纯种黑龙江三角鲂，仅出现335bp条带的个体为纯种团头鲂，同时出现249bp和335bp条带的为黑龙江三角鲂与团头鲂的杂交种；
其中，HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'
HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四的不同点在于步骤二中PCR扩增体系如下：
Figure BDA0002611257810000031
Figure BDA0002611257810000041
其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四或五的不同点在于步骤二中PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。其它与具体实施方式四或五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式四或五或六的不同点在于该方法还包括步骤四，
步骤四、以杂交种个体基因组DNA为模板，用分子标记引物对HLJFLf1与HLJFLr1进行PCR扩增，获得PCR产物；利用限制性内切酶Taq I对PCR产物进行酶切；凝胶电泳中出现180bp和200bp双条带的对应个体是父本为团头鲂、母本为黑龙江三角鲂的杂交种；凝胶电泳中出现157bp和223bp双条带的个体是母本为团头鲂、父本为黑龙江三角鲂的杂交种；
其中，HLJFLf1：5'-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3'；HLJFLr1：5'-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3'。其它与具体实施方式四或五或六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四至七之一的不同点在于步骤四中PCR扩增体系如下：
Figure BDA0002611257810000042
Figure BDA0002611257810000051
PCR扩增条件：94℃变性5min，94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。其它与具体实施方式四至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式四至八之一的不同点在于步骤四中酶切反应体系如下：
Figure BDA0002611257810000052
酶切条件：65℃水浴酶切2h。其它与具体实施方式四至八之一相同。
实施例1：
本实施例实验样品为黑龙江三角鲂和团头鲂养殖品种(浦江1号)及二者的交杂交种。采用本发明区分方法：
一、提取待测鱼类鳍条的基因组DNA；
(1)取待鉴定样品的鳍条组织(每尾约60mg)，剪碎后置于1.5mL EP管内，加入600μL组织提取液和10μL蛋白酶K，在56℃150rpm的摇床上消化过夜；
(2)加入600μL Tris饱和酚上下颠倒10分钟，然后12000rpm离心10分钟，取上层水相，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(24:23:1)，混合10分钟；
(4)12000rpm离心10分钟，取上层水相，加入等体积氯仿-异戊醇(23:1)，混合10分钟；
(5)12000rpm离心10分钟，取上层水相，加入2倍体积的无水冰乙醇(-20℃保存)，水平摇动，直到出现白色絮状物；
(6)10000rpm离心10分钟，管底可见白色DNA沉淀，将沉淀挑入装有500μL体积浓度70％冰乙醇的1.5mL EP管，8000rpm离心5分钟，倒掉乙醇，自然干燥；
(7)加适量的TE缓冲液，置于55℃的水浴锅中溶解DNA 4小时，将其置-20℃保存备用。
二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf2和HLJFLr2为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
三、用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，电泳结果仅出现249bp条带的对应个体为纯种黑龙江三角鲂，仅出现335bp条带的个体为纯种团头鲂，同时出现249bp和335bp条带的为黑龙江三角鲂与团头鲂的杂交种；
其中，HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'
HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。
步骤二中PCR扩增体系如下：
Figure BDA0002611257810000061
步骤二中PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。
编号1-3样品为黑龙江三角鲂，编号4-6样品为团头鲂(浦江1号)，编号7-13样品为杂交种；电泳结果如图1所示，其中编号1-3样品只有249bp条带，编号4-6样品只有335bp条带；而编号7-13样品则同时包含249bp和335bp两条带。实验证明本发明的区分准确性达100％。
实施例2：
本实施例实验样品为黑龙江三角鲂和团头鲂养殖品种(浦江1号)二者的交杂交种。
取实施例1编号7-12样品个体鳍条的基因组DNA作为模板，以HLJFLf1和HLJFLr1为引物进行PCR扩增，获得PCR产物，所有个体均为380bp条带，电泳结果见图2；
再利用限制性内切酶TaqI对上述PCR产物分别进行酶切；
之后用4％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测；
其中，HLJFLf1：5'-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3'
HLJFLr1：5'-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3'；
PCR扩增体系如下：
Figure BDA0002611257810000071
PCR扩增条件：94℃变性5min，94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。
酶切反应体系如下：
Figure BDA0002611257810000072
酶切条件：65℃水浴酶切2h。
其中，编号7～9样品的母本为团头鲂、父本为黑龙江三角鲂，编号10～12样品的母本为黑龙江三角鲂、父本为团头鲂。电泳结果见图3，编号7～9样品出现157bp和223bp双条带；编号10～12样品出现180bp和200bp双条带。证实本发明方法对黑龙江三角鲂与团头鲂杂交种的父母本来源鉴定的准确性达100％。

Claims (9)

1.一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记，其特征在于该分子标记的引物对为HLJFLf2和HLJFLr2，具体序列为：
HLJFLf2：5' -GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'
HLJFLr2：5' -CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。
2.一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如权利要求1中所述的分子标记引物对HLJFLf2和HLJFLr2。
3.根据权利要求2所述的一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括去离子水、10×Taq Buffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA 聚合酶、RE缓冲液10×Buffer、牛血清白蛋白BSA、TaqI内切酶和分子标记引物对HLJFLf1与HLJFLr1；其中，HLJFLf1：5'- GCATCTGGCTTCAATCTCA- 3'
HLJFLr1：5'-GATTTGCTGAGCGTAGGG- 3'。
4.区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、提取待测鱼类鳍条的基因组DNA；
二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf2和HLJFLr2为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
三、对PCR产物进行电泳检测，电泳结果仅出现249bp条带的对应个体为纯种黑龙江三角鲂，仅出现335bp条带的个体为纯种团头鲂，同时出现249bp和335bp条带的为黑龙江三角鲂与团头鲂的杂交种；
其中，HLJFLf2：5' -GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'
HLJFLr2：5' -CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。
5.根据权利要求4所述的区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法，其特征在于步骤二中PCR扩增体系如下：
成分 用量
去离子水 13.8µL
10×Taq Buffer 2µL
MgCl2 1.6µL
10mM dNTPs 0.4µL
10µM 引物HLJFLf2 0.6µL
10µM 引物HLJFLr2 0.6µL
5U/ µL Taq DNA 聚合酶 0.08µL
100ng/ µL基因组DNA 1.0 µL。
6.根据权利要求4或5所述的区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法，其特征在于步骤二中PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。
7.根据权利要求6所述的区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法，其特征在于该方法还包括步骤四，
步骤四、以杂交种个体基因组DNA为模板，用分子标记引物对HLJFLf1与HLJFLr1进行PCR扩增，获得PCR产物；利用限制性内切酶Taq I对PCR产物进行酶切；凝胶电泳中出现180bp和200bp双条带的对应个体是父本为团头鲂、母本为黑龙江三角鲂的杂交种；凝胶电泳中出现157bp和223bp双条带的个体是母本为团头鲂、父本为黑龙江三角鲂的杂交种；
其中，HLJFLf1：5'- GCATCTGGCTTCAATCTCA- 3'
HLJFLr1：5'-GATTTGCTGAGCGTAGGG- 3'。
8.根据权利要求7所述的区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法，其特征在于步骤四中PCR扩增体系如下：
成分 用量
去离子水 14.2µL
10×Taq Buffer 2µL
MgCl2 1.6µL
10mM dNTPs 0.4µL
10µM 引物HLJFLf1 0.6µL
10µM 引物HLJFLr1 0.6µL
5U/µL Taq DNA 聚合酶 0.1µL
100ng/ µL基因组DNA 0.5µL；
PCR扩增条件：94℃变性5min，94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。
9.根据权利要求7所述的区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法，其特征在于步骤四中酶切反应体系如下：
成分 用量
去离子水 16.3µL
RE缓冲液10×Buffer 2µL
牛血清白蛋白BSA 0.2µL
PCR产物 1µL
TaqI内切酶 0.5µL；
酶切条件：65℃水浴酶切2h。
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GR01 Patent grant
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Application publication date: 20201030

Assignee: SHENYANG HUATAI FISHERIES CO.,LTD.

Assignor: Heilongjiang River Fisheries Research Institute of fisheries, Chinese Academy of Fishery Sciences

Contract record no.: X2022230000109

Denomination of invention: A Molecular Marker, Kit and Differentiation Method for Distinguishing Trigonbream, Megalobrama amblycephala and Their Hybrids in Heilongjiang Province

Granted publication date: 20211119

License type: Common License

Record date: 20221013

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