KR101332368B1 - 오이의 품종을 식별하기 위한 다형성 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오이의 품종을 식별하기 위한 다형성 마커, 오이 품종 식별 방법 및 상기 마커를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 오이 품종 식별용 마커를 이용하여 국내에서 보급되고 있는 오이 16개 품종을 식별할 수 있어, 국내 오이 품종 구분 및 오이 품종 육성에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

오이의 품종을 식별하기 위한 다형성 마커 {DNA Polymorphism Marker for Identification of Cucumis sativus L.}

본 발명은 오이의 품종을 식별하기 위한 다형성 마커, 오이 품종 식별 방법 및 상기 마커를 포함하는 키트에 관한 것이다.

식물의 품종간 구분은 여러 가지 목적에 따라 필요한 연구이다. 예를 들면, 국제식물신품종보호동맹 UPOV(International Uion for the Protection of New Varieties of Plant)의 설립이후 품종보호권 설정은 종자회사와 육종가의 큰 관심사가 되었고, UPOV의 회원국인 우리나라 또한 품종보호를 위하여 품종구분에 객관적인 기준을 설정 혹은 수치화하는 계량화의 필요성을 인식하게 되었다.

일반적인 품종 구분은 표현형에 근거하여 구분되어 왔다. 하지만 표현형은 환경요인에 많은 영향을 받기 때문에 통계적으로 많은 실험을 요구한다. 또한 품종간 구별에 있어 표현형은 객관적 기준이 불분명하고 체감적인 차이를 반영하지 못한다. 이런 어려움을 극복하기 위해 DNA 분자 마커를 개발하기 시작했다.

DNA 분자 마커는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), RAPD(random amplified polymorphic DNA), SSR(simple sequence repeat), SNP(Single-nucleotide polymorphism) 등 여러 가지 종류가 있다. 이중에 SNP 마커는 DNA 염기 변이 형태의 가장 흔한 유형이며 다형성 마커 개발에 높은 성공의 결과를 나타내는 방법 중 하나이다.

오이(Cucumis sativus L.) 는 인도 서북부의 히말라야 산맥 남부가 원산지이며, 약 3,000년 전부터 재배되어 오고 있는 작물로서, 이집트에서는 기원전 1,750년경에 재배되었고, 남유럽에는 기원 전후에 전파되었으며, 유럽에서는 16세기경에 재배되었으나 중국에서는 6세기경부터 널리 재배된 것으로 보고된다. 우리나라에서는 약 1,500년 전에 도입된 것으로 알려지고 있는데, 오이는 많은 종류의 품종이 있지만 주로 화남형, 화북형, 피클형 오이가 재배된다.

오이의 주요성분은 약 95%가 수분이며, 단백질, 지질, 당질의 함량이 낮아 칼로리는 매우 낮고, 그 밖에 칼륨, 비타민 A와 비타민 C를 함유하고 있다. 특히 오이가 함유하는 비타민 C는 산화효소에 의해 쉽게 파괴될 수 있다. 또한, 오이에 함유된 칼륨은 과잉의 염분을 체외로 배출시키는 작용을 하며, 이뇨작용을 촉진시켜 신장병 환자나 고혈압 환자에게 좋다. 오이는 목이 마르고 아플 때, 특히 더위를 먹었을 때 섭취하면 좋다고 보고된다. 뿐만 아니라 최근 일본에서는 오이가 사람의 신체 내에서 각종 해독작용을 하는 것으로 보고됨에 따라 앞다투어 오이를 이용한 기능성 식품개발에 박차를 가하고 있으며, 국내에서도 이러한 움직임이 보이고 있다.

오이는 7개 (2n=14)의 염색체를 가진다. 국외에서는 오이와 멜론을 대상으로 분자 마커가 개발되었고 이를 이용한 유전학적 연구가 이루어져 왔다 (Silberstein et al.1999; Staub et al.2004; Zhuang et al.2004; Lopez-Sese et al.2002; Monforte et al.2003; Danin-Poleg et al.1998; Danin-Poleg et al.2001 Chiba et al.2003; Fazio et al. 2002). 하지만 이런 연구를 통해 오이의 경우 품종간 유전적 차이가 상당히 적어 다형성 마커의 개발이 어려운 것으로 알려졌다. 특히 같은 지역 또는 비슷한 유전적 기원을 가지는 오이에서 개발되어온 오이 품종들은 서로 상당히 유전적으로 가까워서 다형성 마커의 개발이 어렵다.

이에 본 발명자들은 유전적 차이가 적은 오이 품종 간에 구분이 가능할 수 있는 다량의 SNP 기반 다형성 분자 마커를 개발하고자 연구를 계속한 결과, 오이 염기서열 중 다형성 지역을 확보하고 프라이머를 제작함으로써, 본 발명을 완성하였다.

국내특허출원번호 : 10-2010-0006377

본 발명의 목적은, 오이 품종 식별용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 오이 품종을 식별하는 방법 및 오이 품종 식별용 키트를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 오이의 16개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 오이 품종 식별용 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 오이로부터 유래된 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 마커를 프라이머로 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 분석하여 오이의 품종을 식별하는 단계를 포함하는 오이 품종을 식별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커를 포함하는 오이 품종 식별용 키트를 제공한다.

본 발명의 오이 품종 식별용 마커를 이용하여 국내에서 보급되고 있는 오이 16개 품종을 식별할 수 있어, 국내 오이 품종 구분 및 오이 품종 육성에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 16종의 오이 품종을 나타낸 도표이다.
도 2 내지 도3은 오이의 다형성 지역을 바탕으로 총 60개의 마커를 나타낸 도표이다.
도 4는 총 60개의 프라이머를 이용하여 다형성 수준을 분석한 도표이다.
도 5는 M42 마커를 이용하여 국내외 품종을 구분한 그림이다. (G : GY-14, N : NC76)
도 6은 다양한 마커를 이용하여 HRM을 통해 오이 품종을 구분한 그림이다.
(M12의 그룹 1 : 국내 오이품종, 그룹 2: 중국품동 (Donggwan), 그룹 3: 미국품종 (GY-14, NC76), M6의 그룹 1: 백다다기 품종, M47의 그룹 1: 동부한농 품종)

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 오이의 16개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 오이 품종 식별용 마커을 제공한다.

바람직하게는 본 발명의 마커는 하기 도 2 내지 도 3에 기재된 염기서열 (서열번호 1 내지 120)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함한다.

본 발명에서 사용하는 용어인 “마커”란 오이를 품종별로 구분할 수 있는 물질로, 오이 품종에 따라 특이적으로 존재하는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본 발명의 “프라이머 (primer)”란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에 있어서 "특이적"이라는 용어는 다른 유전자에 결합하지 않고 상기 유전자의 특정부위에만 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 오이로부터 유래된 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 마커를 프라이머로 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 분석하여 오이의 품종을 식별하는 단계를 포함하는 오이 품종을 식별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 오이 품종 식별 방법에서 게놈 DNA의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction) 을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적인 PCR 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, PCR 반응은 당업계에서 PCR반응에 필요하다고 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR 반응액은 분석하고자 하는 오이로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액(buffer) 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다.

본 발명에서 상기 증폭된 산물은 전기영동에 의해 확인하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 전기영동 시 사용하는 겔은 통상적으로 전기영동에서 사용할 수 있는 겔을 사용할 수 있고, 대표적인 예로 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔을 사용할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 전기영동 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 오이 품종 식별 방법에서 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 후, 조합된 밴드들의 분석을 통하여 각각의 품종을 식별할 수 있다.

또한 본 발명의 오이 품종 식별 방법은 HRM (high resolution melting) 시스템을 통해 이루어질 수 있으며 일반적인 HRM 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 상기 마커를 포함하는 오이 품종 식별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 세트 중 하나 이상, DNA 중합 효소 및 PCR 완충용액(buffer)을 포함하는 오이 품종 식별용 키트를 제공한다. PCR 완충용액에 포함되는 성분들은 상기에서 기술한 바와 같다. 이외에 PCR산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 오이 품종 및 DNA 추출

국내에서 시판하는 오이품종과 국외에서 시판하는 오이품종으로 총 16종의 오이를 사용하여 실험하였다 (도 1). DNA는 동결 건조된 어린 잎 조직으로부터 CTAB 방법으로 추출하였다.

실시예 2. 오이 염기서열 다형성 지역 확보 및 프라이머 제작

오이 염기서열은 GY-14 품종과 Long4 품종을 이용하여 두 품종사이에서 염기서열 차이가 심한 정도를 SNP 수와 Indel (insertion/deletion)의 수 정도로 구분하였다 (도 4). 이러한 방법으로 60개 지역이 선정되었고 이 염기서열 다형성 지역을 PCR 증폭이 가능한 프라이머를 제작하였다 (도 2 및 도 3). 프라이머의 Tm 온도는 섭씨 54도 기준으로 제작하였다. 프라이머는 Genotech Corp. (Daejeon, Korea)에서 구입하였다.

실시예 3. PCR 증폭, 전기영동, HRM ( High resolution melting ) 분석

PCR의 총 볼륨은 15ul로 10mM dNTP 0.3ul, 10x buffer는 1.5ul, Taq polymerase는 0.4 unit, 100uM의 Foward 프라이머, Reverse프라이머를 각각 1ul, DNA는 15ng을 사용하였다. PCR은 섭씨 95도에서 3분 후 95도에서 5초, 50도에서 10초, 68도에서 20초 조건을 50번 반복 하였다. PCR이 끝난 후 전기영동으로 증폭 유무와 증폭된 DNA 조각 크기를 확인하였다. EtBr이 첨가된 2% 아가로즈 겔 (20×40Cm)에서 0.5× TBE 버퍼에 담군 후 300V에서 약 2시간동안 전기 영동하였고, DNA 증폭 밴드의 위치를 UV trans-illuminator로 확인하였다. 염기서열 차이를 구분하기 위하여 HRM 분석은 Light scanner (Idaho Co. USA)를 사용하였다.

전기영동 결과 모든 프라이머 조합에서 증폭된 DNA 밴드를 관찰 할 수 있었고 그 중 전기영동에서 크기 구분이 가능한 것은 M42 프라이머 조합으로 나타났다 (도 5). M42에서 DNA 크기가 다른 2개의 오이 품종은 NC-76과 GY-14 으로 미국 품종이었다. 이 결과는 오이 품종이 품종 간에 유전적 차이가 적다는 것을 다시 한 번 확인할 수 있었고 특히 국내 오이 품종 간에는 차이를 발견할 수 없었음을 확인하였다.

또한 DNA 염기서열 차이를 염기분석 없이 다형성을 검사하기 위해 HRM을 수행하였다. HRM은 염기서열 차이에 의해 DNA조각의 melting 온도 차이에 의한 melting curve 차이를 기준으로 구분해 주는 기술이다.

HRM 분석에 의한 오이 품종간의 차이를 보여주는 결과를 도 6에 나타내었다. M12 마커에서 미국 품종인 NC-76, GY-14 과 중국품종인 Donggwan, 그리고 국내품종의 구분이 가능하였다.

또한, M6 마커는 조은 백다다기를 제외한 은성, 흑농, 백록, 한강 백다다기 품종이 다른 것과 구별되어 그룹화 되었다. M20, M47의 경우 동부 한농에서 구입한 품종인 신정품, White, 낙동청장은 다른 오이 품종들로부터 분리되어 그룹화 되었다. 이를 토대로 16가지 오이는 기본적으로 국가별로 유전적 차이를 보이며, 국내품종 사이에서는 각각 은성, 흑농, 백록, 한강백다다기와 신정품, White, 낙동청장이 유전적으로 가깝다고 추측 할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

1. 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 M12 프라이머 세트;를 포함하는 오이 품종 식별용 마커 조성물.
   
2. (a) 오이로부터 유래된 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 M12 프라이머 세트;를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및
   (c) 상기 증폭된 산물을 분석하여 오이의 품종을 식별하는 단계;를 포함하는 오이 품종을 식별하는 방법.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 게놈 DNA는 오이의 잎으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 M12 프라이머 세트;를 포함하는 오이 품종 식별용 키트.
   

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