CN109576388B - 杉木est-ssr分子标记组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种杉木EST‑SSR分子标记组合，所开发的EST‑SSR均为多态性标记，其编号分别为CLESTSSR08、CLESTSSR16、CLESTSSR22、CLESTSSR33、CLESTSSR76、CLESTSSR97、CLESTSSR193、CLESTSSR201、CLESTSSR 286。本发明开发的EST‑SSR分子标记重复好，可靠性高，适用于杉木种质资源评价及其分子标记辅助育种等研究。

Description

杉木EST-SSR分子标记组合
技术领域
本发明涉及分子生物学标记技术领域，特别涉及一种杉木EST-SSR分子标记组合。
背景技术
分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，能在DNA水平上反应植物遗传基础的差异。简单重复序列(SSR)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于SSR的重复次数不同，使其呈现高度的多态性。与其它分子标记相比，SSR标记具有可靠性强、多态信息含量高、共显性遗传、操作简单等优点，广泛用于遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位和标记辅助育种中。
SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR)，EST-SSR标记源于基因的转录区，与gSSR标记相比，其免去了文库构建和大量的序列测定，具有开发耗时短，花费低，效率高等优点。同时，EST作为基因转录本的一部分，更易获得基因表达的信息，可为功能基因的直接鉴定提供重要依据。杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国南方重要的速生用材树种，广泛分布于我国长江流域以及珠江流域的17个省区。杉木由于其生长快，材质好，易繁殖，易栽培，适应性强，深受广大南方杉木产区人民的喜爱。
然而，杉木尚无全基因组序列信息，杉木SSR标记开发滞后，目前仅开发出少量SSR引物，分子标记数量不足，限制了杉木分子遗传学研究。
发明内容
基于此，本发明的目的是为杉木分子遗传学研究提供更多的多态性分子标记。
本发明提出一种杉木EST-SSR分子标记组合，其中，所述EST-SSR分子标记均为多态性标记，其编号分别为CLESTSSR08、CLESTSSR16、CLESTSSR22、CLESTSSR33、CLESTSSR76、CLESTSSR97、CLESTSSR193、CLESTSSR201或CLESTSSR 286，各分子标记对应的核苷酸序列分别为：
SEQCLESTSSR08：
GTGGCCAATTCTGCAAGCAATGGAGGGAGTTGCTGTGGCGGCAGTGGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCAGTGGAGGAAGCTGCAGCAGTCATGGCAAGTCTTCTGATCTTTCTAATGTTGGGAAAGAGTTTGAAGCCATGGTTGCCAGAGCCACATTGACT；
SEQCLESTSSR16：
TGTTGCTTCAGTCGGGGTTTGCGGCAGAGGAAGCGGTTGTCCAGCGAATTGATCCACAGACCTCCTGGGCGCTAGAGCCGACGGAGACGGAGACGGAGACGGAGACGGATGTTGCTTCAGTCGGGGTTTGAATCGCCCAGCACGAAATCAACACTTCGCCTTGCTAAATCGTCGTTAGAACTTCGCCTCAATTTCGTAGGCGACGGAGACGGAGATCCAAAGCCGCTTCT；
SEQCLESTSSR22：
TATCTCCAGAACGCCTGCACTCTGCCAAGAAGGCTTCCACTTCTCTATTCAATTCCATTCTTCCCTTCCTTTCCTTTCCTTTCCTTTCCTCTCCTCTCCTCTCCTCCCCACTCCCCTCGCTTTTTAATTCAGTTAGAGAAGCGGTCTCACGAAGCACAATGTGTATAAATAAGATGGTAGAGCCCAACGGAGCAGATGAAATTGATTGTAGATCGTTATTTTAAAGCTGCCAGTCCCTAAAAAATTGTGAATGCGTCGCAACTG；
SEQCLESTSSR33：
TGTGCACACCAGTCGTATCCTGCATATTGTTCCAAACCAACCAAGCCAAAGCCGAAGCCGAAAAGCCGAATCCAAGCCAAGCCAAGCCAAGCCAAGCCTAACCAAAACAAAGCTACCTCATCACCAGACAGAATTGCAGAGACCGAGAATTGGAGGGTGGTGGG；
SEQCLESTSSR76：
TCTGTGGAGCCCTGATCTGAAGCAGGATAATAATATGCATTATAATCATATTGCCCTACAAATTGTGGGGTTTCTTGAATAATAGAGCAAGCCTCCGACTGCGGCTCCGGCTCTTGCGGAGCGGGAGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGGGGGTTCGAGAATTGTGCGACGAGAGCCGCCGCCGCCTCCTCCTAGGGTTTGGGAATTCTTGGGCGGAGGTAGGAGGGCAGTTAGACCTCCAGAGGATTCCCCAAACCTTTTCTTGGGCG；
SEQCLESTSSR97：
ATGATCATCACCGGCTCACCGAGACGGCCGATTTCCGGCGCTGTTTTCTGATGGGGGAAAGCGCAGGGGCCAATTTAGTTTACCAGACGGCGCTCGCTTGCGCCGCCACGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCACGGAAAGTGATGATCCCCTGTGCCTGCGCGGTTGTATACTGATCCACCCGGCG；
SEQCLESTSSR193：
TGGGCCTCTGGTATCCATCACCCCCAAATCGAGCAGGATCATTGTATCGATATCCACCACCACCACCACCACCATAGTTATCTCTCTGCATCCTTGGAAAATGCCTGAAGTTTCCCCCCTCTTGCTGCTCTCTTGGTGG；
SEQCLESTSSR201：
TTGGCTTTCAGTCCGGAGACCTTGATTCAGTCCTTGATTGTTAAGGCTAAGAAAGACCTTGGTTTAATCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGGATCTCCTTCAGTTCAATCATATCTATCAAGAATTAATCGTCACAATCTGCCTCTACAGCCTCTACAGATATCCCAGGTTTCCTCCAGGGCTTTCTCTTCTCCAAATGCCCTTTCACCTCATGCGCCTCCATGGGGATCCTCTCA；
SEQCLESTSSR286：
CCGAGGCTTCTCTGAGCAAACAAAACATAACACCTGTGAAGAATCATAATGAAGCCGGCAATCCTTTTCTCCAACTCATACAATCCCATTAACTCTCTCTCTCTCTCTCTATCTATCTCAATATTTACTACGTCATTATCACGTGGTGTAAGTATTCTGCAGAAATGAGGATTCGGCATATGGACTAATATATCTGTCGAAGAAGCGATCCTCCGTCATCCTA。
另外，本发明提出的杉木EST-SSR分子标记组合，还具有如下附加的技术特征：
分子标记CLESTSSR08、CLESTSSR16、CLESTSSR22、CLESTSSR33、CLESTSSR76、CLESTSSR97、CLESTSSR193、CLESTSSR201以及CLESTSSR 286对应的引物序列分别为：
CLESTSSR08F:GTGGCCAATTCTGCAAGCAA
CLESTSSR08R:AGTCAATGTGGCTCTGGCAA；
CLESTSSR16 F:TGTTGCTTCAGTCGGGGTTT
CLESTSSR16 R:AGAAGCGGCTTTGGATCTCC；
CLESTSSR22 F:TATCTCCAGAACGCCTGCAC
CLESTSSR22 R:CAGTTGCGACGCATTCACAA；
CLESTSSR33 F:TGTGCACACCAGTCGTATCC
CLESTSSR33 R:CCCACCACCCTCCAATTCTC；
CLESTSSR76 F:TCTGTGGAGCCCTGATCTGA
CLESTSSR76 R:CGCCCAAGAAAAGGTTTGGG；
CLESTSSR97 F:ATGATCATCACCGGCTCACC
CLESTSSR97R:CGCCGGGTGGATCAGTATAC；
CLESTSSR193 F:TGGGCCTCTGGTATCCATCA
CLESTSSR193 R:CCACCAAGAGAGCAGCAAGA；
CLESTSSR201 F:TTGGCTTTCAGTCCGGAGAC
CLESTSSR201 R:TGAGAGGATCCCCATGGAGG；
CLESTSSR286 F:CCGAGGCTTCTCTGAGCAAA
CLESTSSR286 R:TAGGATGACGGAGGATCGCT。
本发明还提出一种杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，其中，应用该开发方法开发得到如上所述的多态性EST-SSR分子标记，所述方法包括如下步骤：
引物设计：对杉木组培苗嫩叶进行转录组测序获取EST序列，采用MISA软件检索EST序列中的SSR位点，并利用Primer软件进行引物设计；
PCR引物扩增：设置PCR反应体系以及反应程序，10个杉木单株基因组DNA对EST-SSR引物进行PCR扩增；
聚丙烯酰胺凝胶电泳和多态性EST-SSR引物筛选：利用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，PCR扩增产物经电泳、银染以及显色后得到EST-SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
另外，本发明提出的杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，还具有如下附加的技术特征：
所述杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，其中，在进行引物设计的步骤中，引物设计的标准为：
SSR位点的开始与结束位置分别距5’和3’端不少于50bp；引物长度为18～25bp；Tm值为52.0～60.0℃，上下游引物Tm相差不大于5℃；GC含量为40％～60％；PCR扩增产物长度为100～300bp。
所述杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，其中，采用MISA软件检索EST序列中的SSR位点的步骤中，所述方法包括：
对EST序列中的2～6核苷酸重复类型的SSR位点进行检索，其中含二、三、四、五以及六核苷酸重复类型的SSR位点的重复序列长度≥18bp，对应的最小重复数分别为9、6、5、5以及4次。
所述杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，其中，在进行PCR引物扩增的步骤中，反应体系的设置方法为：
在10μl的反应体系中加入1μl的10×PCR缓冲液(Mg+)，0.6μl浓度为2.5mM的dNTP，0.6μl浓度为10μM的上游引物，0.6μl浓度为10μM的下游引物，聚合酶1U，1μl浓度为40ng/μl的DNA模板，最后双蒸水补充至10μl。
所述杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，其中，在进行PCR引物扩增的步骤中，对应的反应程序为：
95℃预变性5min；95℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸45S，共进行30个反应循环；72℃延伸7min，4℃保存。
所述杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳和多态性EST-SSR引物筛选的方法中，利用聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离的步骤具体包括：
采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶在垂直电泳槽中进行电泳分离，电泳缓冲液为1×TBE，其中，8％非变性聚丙烯酰胺凝胶包括20mL质量分数为30％的聚丙烯酰胺凝胶溶液，10mL的10×TBE；70mL的ddH2O；600μL质量分数为10％的过硫酸铵以及60μL的TEMED。
所述杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，其中，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法中，PCR扩增产物经电泳、银染以及显色后得到EST-SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳图的步骤具体包括：
将配好的聚丙烯酰胺凝胶溶液加入垂直电泳槽的玻板间，凝固30分钟；加1.7μl10×loading buffer到10μL PCR扩增产物，混匀后取0.8μl PCR扩增产物点样孔上样，120W恒压电泳1～2h后，拆玻板，用纯净水漂洗1min；倒掉纯净水，加入染色液，摇床上充分摇晃6min；倒掉染色液并用纯净水漂洗凝胶两次，每次1min；倒掉纯净水，加入显色液，在摇床上充分振荡直到出现清晰电泳条带；用纯净水漂洗两次，将凝胶置于灯箱上，观察电泳结果，判断引物多态性并拍照保存。
所述杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，其中，所述染色液包括3mL质量分数为10％的AgNO3以及250mL的纯净水，所述显色液包括50mL质量分数为20％的NaOH，1mL的甲醛以及450mL的纯净水。
本发明提出的杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，首先转录组测序获取杉木组培苗嫩叶的EST序列，采用MISA软件检索EST序列中的SSR位点，利用Primer软件进行引物设计；5个杉木种源的10个杉木单株的基因组DNA对引物进行筛选，最终获得了9个具有多态性的EST-SSR分子标记。
本发明公开的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，或者，部分特征和优点可以从说明书推知或毫无疑义地确定，或者通过实施本发明公开的上述技术即可得知。
为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为CLESTSSR08位点扩增5个杉木种源10个单株DNA样本的银染PAGE图；
图2 CLESTSSR16位点扩增5个杉木种源10个单株DNA样本的银染PAGE图；
图3 CLESTSSR22位点扩增5个杉木种源10个单株DNA样本的银染PAGE图；
图4 CLESTSSR33位点扩增5个杉木种源10个单株DNA样本的银染PAGE图；
图5 CLESTSSR76位点扩增5个杉木种源10个单株DNA样本的银染PAGE图；
图6 CLESTSSR97位点扩增5个杉木种源10个单株DNA样本的银染PAGE图；
图7 CLESTSSR193位点扩增5个杉木种源10个单株DNA样本的银染PAGE图；
图8 CLESTSSR201位点扩增5个杉木种源10个单株DNA样本的银染PAGE图；
图9 CLESTSSR286位点扩增5个杉木种源10个单株DNA样本的银染PAGE图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的首选实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
杉木尚无全基因组序列信息，杉木SSR标记开发滞后，目前仅开发出少量SSR引物，分子标记数量不足，限制了杉木分子遗传学研究。
实施例一
为了解决这一技术问题，本发明提出一种杉木EST-SSR分子标记组合，共计9个多态性EST-SSR标记，其编号分别为CLESTSSR08、CLESTSSR16、CLESTSSR22、CLESTSSR33、CLESTSSR76、CLESTSSR97、CLESTSSR193、CLESTSSR201以及CLESTSSR286。
具体的，各标记对应的核苷酸序列分别为：
SEQCLESTSSR08：
GTGGCCAATTCTGCAAGCAATGGAGGGAGTTGCTGTGGCGGCAGTGGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCAGTGGAGGAAGCTGCAGCAGTCATGGCAAGTCTTCTGATCTTTCTAATGTTGGGAAAGAGTTTGAAGCCATGGTTGCCAGAGCCACATTGACT；
SEQCLESTSSR16：
TGTTGCTTCAGTCGGGGTTTGCGGCAGAGGAAGCGGTTGTCCAGCGAATTGATCCACAGACCTCCTGGGCGCTAGAGCCGACGGAGACGGAGACGGAGACGGAGACGGATGTTGCTTCAGTCGGGGTTTGAATCGCCCAGCACGAAATCAACACTTCGCCTTGCTAAATCGTCGTTAGAACTTCGCCTCAATTTCGTAGGCGACGGAGACGGAGATCCAAAGCCGCTTCT；
SEQCLESTSSR22：
TATCTCCAGAACGCCTGCACTCTGCCAAGAAGGCTTCCACTTCTCTATTCAATTCCATTCTTCCCTTCCTTTCCTTTCCTTTCCTTTCCTCTCCTCTCCTCTCCTCCCCACTCCCCTCGCTTTTTAATTCAGTTAGAGAAGCGGTCTCACGAAGCACAATGTGTATAAATAAGATGGTAGAGCCCAACGGAGCAGATGAAATTGATTGTAGATCGTTATTTTAAAGCTGCCAGTCCCTAAAAAATTGTGAATGCGTCGCAACTG；
SEQCLESTSSR33：
TGTGCACACCAGTCGTATCCTGCATATTGTTCCAAACCAACCAAGCCAAAGCCGAAGCCGAAAAGCCGAATCCAAGCCAAGCCAAGCCAAGCCAAGCCTAACCAAAACAAAGCTACCTCATCACCAGACAGAATTGCAGAGACCGAGAATTGGAGGGTGGTGGG；
SEQCLESTSSR76：
TCTGTGGAGCCCTGATCTGAAGCAGGATAATAATATGCATTATAATCATATTGCCCTACAAATTGTGGGGTTTCTTGAATAATAGAGCAAGCCTCCGACTGCGGCTCCGGCTCTTGCGGAGCGGGAGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGGGGGTTCGAGAATTGTGCGACGAGAGCCGCCGCCGCCTCCTCCTAGGGTTTGGGAATTCTTGGGCGGAGGTAGGAGGGCAGTTAGACCTCCAGAGGATTCCCCAAACCTTTTCTTGGGCG；
SEQCLESTSSR97：
ATGATCATCACCGGCTCACCGAGACGGCCGATTTCCGGCGCTGTTTTCTGATGGGGGAAAGCGCAGGGGCCAATTTAGTTTACCAGACGGCGCTCGCTTGCGCCGCCACGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCACGGAAAGTGATGATCCCCTGTGCCTGCGCGGTTGTATACTGATCCACCCGGCG；
SEQCLESTSSR193：
TGGGCCTCTGGTATCCATCACCCCCAAATCGAGCAGGATCATTGTATCGATATCCACCACCACCACCACCACCATAGTTATCTCTCTGCATCCTTGGAAAATGCCTGAAGTTTCCCCCCTCTTGCTGCTCTCTTGGTGG；
SEQCLESTSSR201：
TTGGCTTTCAGTCCGGAGACCTTGATTCAGTCCTTGATTGTTAAGGCTAAGAAAGACCTTGGTTTAATCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGGATCTCCTTCAGTTCAATCATATCTATCAAGAATTAATCGTCACAATCTGCCTCTACAGCCTCTACAGATATCCCAGGTTTCCTCCAGGGCTTTCTCTTCTCCAAATGCCCTTTCACCTCATGCGCCTCCATGGGGATCCTCTCA；
SEQCLESTSSR286：
CCGAGGCTTCTCTGAGCAAACAAAACATAACACCTGTGAAGAATCATAATGAAGCCGGCAATCCTTTTCTCCAACTCATACAATCCCATTAACTCTCTCTCTCTCTCTCTATCTATCTCAATATTTACTACGTCATTATCACGTGGTGTAAGTATTCTGCAGAAATGAGGATTCGGCATATGGACTAATATATCTGTCGAAGAAGCGATCCTCCGTCATCCTA。
与此同时，上述的9个分子标记CLESTSSR08、CLESTSSR16、CLESTSSR22、CLESTSSR33、CLESTSSR76、CLESTSSR97、CLESTSSR193、CLESTSSR201以及CLESTSSR 286对应的引物序列分别为：
CLESTSSR08F:GTGGCCAATTCTGCAAGCAA
CLESTSSR08R:AGTCAATGTGGCTCTGGCAA；
CLESTSSR16 F:TGTTGCTTCAGTCGGGGTTT
CLESTSSR16 R:AGAAGCGGCTTTGGATCTCC；
CLESTSSR22 F:TATCTCCAGAACGCCTGCAC
CLESTSSR22 R:CAGTTGCGACGCATTCACAA；
CLESTSSR33 F:TGTGCACACCAGTCGTATCC
CLESTSSR33 R:CCCACCACCCTCCAATTCTC；
CLESTSSR76 F:TCTGTGGAGCCCTGATCTGA
CLESTSSR76 R:CGCCCAAGAAAAGGTTTGGG；
CLESTSSR97 F:ATGATCATCACCGGCTCACC
CLESTSSR97R:CGCCGGGTGGATCAGTATAC；
CLESTSSR193 F:TGGGCCTCTGGTATCCATCA
CLESTSSR193 R:CCACCAAGAGAGCAGCAAGA；
CLESTSSR201 F:TTGGCTTTCAGTCCGGAGAC
CLESTSSR201 R:TGAGAGGATCCCCATGGAGG；
CLESTSSR286 F:CCGAGGCTTCTCTGAGCAAA
CLESTSSR286 R:TAGGATGACGGAGGATCGCT。
本发明提供了9个新的杉木多态性EST-SSR分子标记，建立了杉木EST-SSR标记开发的技术体系，为杉木的分子遗传分析提供了更多分子标记选择。
实施例二
本实施例提出一种EST-SSR分子标记的开发方法，应用该开发方法开发得到如上所述的EST-SSR分子标记，该方法包括如下步骤：
(1)引物设计：对杉木组培苗嫩叶进行转录组测序获取EST序列，采用MISA软件检索EST序列中的SSR位点，并利用Primer软件进行引物设计。
在本步骤中，采集杉木组培苗嫩叶进行转录组测序获得EST序列，采用MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)检索各EST序列中的SSR位点。具体的，对EST序列中的2～6核苷酸重复类型SSR位点进行检索。其中，含二、三、四、五以及六核苷酸类型的重复序列长度≥18bp，对应的最小重复数分别为9、6、5、5以及4次。
在采用Primer3.0软件进行引物设计时，引物设计的原则是：SSR位点的开始以及结束位置分别距5’和3’端不少于50bp；引物长度为18～25bp；Tm值为52.0～60.0℃，上下游引物Tm相差不大于5℃；GC含量为40％～60％；PCR扩增产物的长度为100～300bp，尽量避免引物二聚体、发卡结构以及错配等问题。共设计引物100对，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(2)PCR引物扩增：设置PCR反应体系以及反应程序，10个杉木单株基因组DNA对EST-SSR引物进行PCR扩增。
在本步骤中，PCR扩增产物采用10μl的反应体系，具体的，在10μl的反应体系中加入1μl胡10×PCR缓冲液(Mg+)，0.6μl浓度为2.5mM的dNTP，0.6μl浓度为10μM的上游引物，0.6μl浓度为10μM的下游引物，聚合酶1U，1μl浓度为40ng/μl的DNA模板，最后双蒸水补充至10μl。
在此需要指出的是，上述的DNA模板为：采用改良的CTAB法提取杉木基因组DNA，以5个杉木种源(江西安福、湖南会同、广西融水、浙江龙泉和福建建瓯)的10个杉木单株基因组DNA为模板。
PCR扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸45S，共进行30个反应循环；72℃延伸7min，4℃保存。
表一：引物特征表
Figure GDA0003162812320000121
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳和多态性EST-SSR引物筛选：对PCR扩增产物，用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，经电泳、银染以及显色后得到EST-SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳图，进行多态性EST-SSR引物筛选。
采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为1×TBE，其中，8％非变性聚丙烯酰胺凝胶包括20mL质量分数为30％的聚丙烯酰胺凝胶溶液，10mL的10×TBE；70mL的ddH2O；600μL质量分数为10％的过硫酸铵以及60μL的TEMED。将配好的聚丙烯酰胺凝胶溶液加入到垂直电泳槽的玻板间，凝固30分钟；加1.7μl 10×loading buffer到10μL PCR扩增产物，混匀后取0.8μl PCR扩增产物点样孔上样，120W恒压电泳1～2h后，拆玻板，用纯净水漂洗1min；倒掉纯净水，加入染色液(3mL质量分数为10％的AgNO3以及250mL的纯净水)，摇床上充分摇晃6min；倒掉染色液并用纯净水漂洗凝胶两次，每次1min；倒掉纯净水，加入显色液(50mL质量分数为20％的NaOH，1mL的甲醛以及450mL的纯净水)，在摇床上充分振荡直到出现清晰电泳条带；用纯净水漂洗两次，将凝胶置于灯箱上，观察电泳结果并拍照保存。其中，按照本实施例提出的EST-SSR分子标记方法，从100对EST-SSR引物中筛选得到9对多态性的EST-SSR引物，其银染PAGE图分别如图1至图9所示。
本发明提出的杉木EST-SSR分子标记组合的开发方法，首先转录组测序获取杉木组培苗嫩叶的EST序列，采用MISA软件检索EST序列中的SSR位点，利用Primer软件进行引物设计；利用5个杉木种源的10个杉木单株基因组DNA对100对引物进行筛选，最终获得9个具有多态性的EST-SSR分子标记。本发明提出了9个杉木多态性EST-SSR分子标记，建立了杉木EST-SSR标记开发的技术体系，为杉木的分子遗传分析提供新的标记选择。
最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种杉木EST-SSR分子标记组合，其特征在于，所述EST-SSR分子标记均为多态性标记，其编号分别为CLESTSSR08、CLESTSSR16、CLESTSSR22、CLESTSSR33、CLESTSSR76、CLESTSSR97、CLESTSSR193、CLESTSSR201、CLESTSSR 286，各分子标记对应的核苷酸序列分别为：
SEQCLESTSSR08：
GTGGCCAATTCTGCAAGCAATGGAGGGAGTTGCTGTGGCGGCAGTGGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCAGTGGAGGAAGCTGCAGCAGTCATGGCAAGTCTTCTGATCTTTCTAATGTTGGGAAAGAGTTTGAAGCCATGGTTGCCAGAGCCACATTGACT；
SEQCLESTSSR16：
TGTTGCTTCAGTCGGGGTTTGCGGCAGAGGAAGCGGTTGTCCAGCGAATTGATCCACAGACCTCCTGGGCGCTAGAGCCGACGGAGACGGAGACGGAGACGGAGACGGATGTTGCTTCAGTCGGGGTTTGAATCGCCCAGCACGAAATCAACACTTCGCCTTGCTAAATCGTCGTTAGAACTTCGCCTCAATTTCGTAGGCGACGGAGACGGAGATCCAAAGCCGCTTCT；
SEQCLESTSSR22：
TATCTCCAGAACGCCTGCACTCTGCCAAGAAGGCTTCCACTTCTCTATTCAATTCCATTCTTCCCTTCCTTTCCTTTCCTTTCCTTTCCTCTCCTCTCCTCTCCTCCCCACTCCCCTCGCTTTTTAATTCAGTTAGAGAAGCGGTCTCACGAAGCACAATGTGTATAAATAAGATGGTAGAGCCCAACGGAGCAGATGAAATTGATTGTAGATCGTTATTTTAAAGCTGCCAGTCCCTAAAAAATTGTGAATGCGTCGCAACTG；
SEQCLESTSSR33：
TGTGCACACCAGTCGTATCCTGCATATTGTTCCAAACCAACCAAGCCAAAGCCGAAGCCGAAAAGCCGAATCCAAGCCAAGCCAAGCCAAGCCAAGCCTAACCAAAACAAAGCTACCTCATCACCAGACAGAATTGCAGAGACCGAGAATTGGAGGGTGGTGGG；
SEQCLESTSSR76：
TCTGTGGAGCCCTGATCTGAAGCAGGATAATAATATGCATTATAATCATATTGCCCTACAAATTGTGGGGTTTCTTGAATAATAGAGCAAGCCTCCGACTGCGGCTCCGGCTCTTGCGGAGCGGGAGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGGGGGTTCGAGAATTGTGCGACGAGAGCCGCCGCCGCCTCCTCCTAGGGTTTGGGAATTCTTGGGCGGAGGTAGGAGGGCAGTTAGACCTCCAGAGGATTCCCCAAACCTTTTCTTGGGCG；
SEQCLESTSSR97：
ATGATCATCACCGGCTCACCGAGACGGCCGATTTCCGGCGCTGTTTTCTGATGGGGGAAAGCGCAGGGGCCAATTTAGTTTACCAGACGGCGCTCGCTTGCGCCGCCACGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCACGGAAAGTGATGATCCCCTGTGCCTGCGCGGTTGTATACTGATCCACCCGGCG；
SEQCLESTSSR193：
TGGGCCTCTGGTATCCATCACCCCCAAATCGAGCAGGATCATTGTATCGATATCCACCACCACCACCACCACCATAGTTATCTCTCTGCATCCTTGGAAAATGCCTGAAGTTTCCCCCCTCTTGCTGCTCTCTTGGTGG；
SEQCLESTSSR201：
TTGGCTTTCAGTCCGGAGACCTTGATTCAGTCCTTGATTGTTAAGGCTAAGAAAGACCTTGGTTTAATCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGGATCTCCTTCAGTTCAATCATATCTATCAAGAATTAATCGTCACAATCTGCCTCTACAGCCTCTACAGATATCCCAGGTTTCCTCCAGGGCTTTCTCTTCTCCAAATGCCCTTTCACCTCATGCGCCTCCATGGGGATCCTCTCA；
SEQCLESTSSR286：
CCGAGGCTTCTCTGAGCAAACAAAACATAACACCTGTGAAGAATCATAATGAAGCCGGCAATCCTTTTCTCCAACTCATACAATCCCATTAACTCTCTCTCTCTCTCTCTATCTATCTCAATATTTACTACGTCATTATCACGTGGTGTAAGTATTCTGCAGAAATGAGGATTCGGCATATGGACTAATATATCTGTCGAAGAAGCGATCCTCCGTCATCCTA。
2.根据权利要求1所述的杉木EST-SSR分子标记组合，其特征在于，分子标记CLESTSSR08、CLESTSSR16、CLESTSSR22、CLESTSSR33、CLESTSSR76、CLESTSSR97、CLESTSSR193、CLESTSSR201以及CLESTSSR 286对应的引物序列分别为：
CLESTSSR08F:GTGGCCAATTCTGCAAGCAA
CLESTSSR08R:AGTCAATGTGGCTCTGGCAA；
CLESTSSR16F:TGTTGCTTCAGTCGGGGTTT
CLESTSSR16 R:AGAAGCGGCTTTGGATCTCC；
CLESTSSR22 F:TATCTCCAGAACGCCTGCAC
CLESTSSR22 R:CAGTTGCGACGCATTCACAA；
CLESTSSR33 F:TGTGCACACCAGTCGTATCC
CLESTSSR33 R:CCCACCACCCTCCAATTCTC；
CLESTSSR76 F:TCTGTGGAGCCCTGATCTGA
CLESTSSR76 R:CGCCCAAGAAAAGGTTTGGG；
CLESTSSR97 F:ATGATCATCACCGGCTCACC
CLESTSSR97R:CGCCGGGTGGATCAGTATAC；
CLESTSSR193 F:TGGGCCTCTGGTATCCATCA
CLESTSSR193 R:CCACCAAGAGAGCAGCAAGA；
CLESTSSR201F:TTGGCTTTCAGTCCGGAGAC
CLESTSSR201 R:TGAGAGGATCCCCATGGAGG；
CLESTSSR286F:CCGAGGCTTCTCTGAGCAAA
CLESTSSR286 R:TAGGATGACGGAGGATCGCT。
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