CN105695572B - 一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，包括以下步骤：(1)选取至少3个待开发样品，分别提取待开发样品的DNA；(2)对各待开发样品的DNA样品进行酶切并构建测序文库并测序；(3)所有待开发样品的基因组混合后进行组装获得Contigs；(4)利用Contigs与各待开发样品个体序列进行比对，根据Indel和SSR的位点信息，获得内部存在Indel的SSR位点，作为候选多态性SSR位点；(5)根据获得的候选多态性SSR位点设计引物，PCR扩增和测序，选取带型稳定清晰条带，作为待验证分子标记引物；(6)利用所得的分子标记引物，PCR扩增不同的待开发样品，选取具有多样性的分子标记，获得分子标记。该方法提高分子标记开发的效率，且开发的SSR分子标记能高效应用于遗传学、增殖放流评估等方面的研究。

Description

一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学及生物信息学领域，具体涉及一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法。
背景技术
分子标记是以检测生物个体在遗传物质内核苷酸序列变异所产生的差异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。分子标记在不同发育阶段的生物个体、不同组织中均一致，并且分子标记的数量越多，多态性越高，遗传就越稳定，不会受到环境的影响。与传统的几种遗传标记相比较，DNA分子标记具有很多优点。随着分子生物学的迅猛发展，DNA分子标记已有数十种，广泛应用于遗传育种、物种亲缘关系的鉴定，群体遗传多样性分析，物种增值放流评估等方面。
根据分子标记的发展，可以将其分为三代，第一代以RFLP、AFLP和RAPD为代表；RFLP和AFLP的等位基因具有共显性特点，但其实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用高；RAPD具有技术简单，检测速度快，但其不能鉴别纯合子和杂合子，实验的稳定性和重复性较差；第二代以SSR标记和ISSR为代表，它们以重复序列的重复次数为标记，其特点是易于分型，操作较为简单，为共显性标记，便于遗传分析。第三代分析标记为SNP、Indel标记等这类标记的特点是数量多、范围广，便于高通量分析。
SSR标记也称为微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1-6bp，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。其具有以下优点：一般能检测到单一的多等位基因位点；呈共显性遗传，能区别杂合子和纯合子；所需的DNA量少；其缺点是由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高，同时筛选引物时有一定盲目性。Indel标记称为插入缺失标记，指的是两个样品中在全基因组中的差异，一个样品相对于另外一个样品基因组中有一定数量的核苷酸插入和缺失。根据插入缺失位点，两端设计一些扩增这些插入缺失位点的引物，就是Indel标记。目前，SSR是应用最多、最广的分子DNA标记，而Indel标记在水产动物育种中应用甚少。
发明内容
本发明的目的针对物种筛选SSR分子标记时效率不高的问题，提供一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法。用于解决在高通量测序后SSR标记开发有效性较低的问题，该方法可很大程度上提高分子标记开发的效率，且开发的SSR分子标记能高效应用于遗传学、增殖放流评估等方面的研究，节约了大量的时间和金钱。
本发明的目的通过以下方案来实现：一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，
(1)选取至少3个待开发样品，分别提取待开发样品的DNA；
(2)对各待开发样品的DNA样品进行酶切并构建测序文库并测序；
(3)所有待开发样品的基因组混合后进行组装获得Contigs；
(4)利用Contigs与各待开发样品个体序列进行比对，检测出SNP、Indel变异信息以及SSR位点，并根据Indel和SSR的位点信息，获得内部存在Indel的SSR位点，作为候选多态性SSR位点；
(5)根据步骤(4)获得的候选多态性SSR位点设计引物，PCR扩增和测序，选取带型稳定清晰条带，作为待验证分子标记引物；
(6)利用步骤(5)所得的分子标记引物，PCR扩增不同的待开发样品，选取具有多样性的分子标记，获得分子标记。
本发明所述待开发样品为花鲈。
所述步骤(1)采用Magen DNA提取试剂盒提取待开发样品的DNA，进行RAD-seq测序。
所述步骤(2)采用限制性内切酶EcoRI(GAATTC)对基因组DNA样品进行酶切。所述测序文库构建过程为：酶切后的基因组片段两端先后拼接P1和P2接头，进过PCR扩增和测序后，筛选获得含有P1和P2接头的DNA序列。
所述步骤(3)中，所有花鲈的基因组进行Contigs组装，采用Stacks软件进行数据分析。
所述步骤(3)中利用Illumina HiSeq2000平台进行测序。
所述步骤(4)设计引物的条件为扩增片段长度为100-300bp，GC含量在40-60％之间。
本发明具有如下优点：
(1)不需要参考基因组，三个样本序列一起进行Contigs组装。
(2)目的性强，根据Indel和SSR的位点信息，获得二者的交集，即在内部存在Indel的SSR位点，作为候选多态性SSR位点，并针对此SSR位点进行PCR引物设计。
(3)所需时间短，能快速大批量高效开发SSR分子标记以及完成后续相关分析。
(4)所需测序的数据量低，所需费用低。
附图说明
图1是本发明实施例的花鲈分子标记开发流程图。
具体实施方式
以下结合具体实施方法对本发明进行详细说明。
如图1所示，以花鲈为例，基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发花鲈分子标记的方法，包括以下步骤：
(1)花鲈肌肉样本基因组DNA的提取
选取3尾野生花鲈肌肉组织样品，采用Magen动物组织DNA提取试剂盒，把20-50mg组织样品处理成尽量小的碎片，并转移至1.5mL离心管中。加入550μL Buffer MTL和20μL蛋白酶K，涡旋混匀。55℃振荡温育3h或过夜消化样品。加入5μL RNase Solution至消化液中，颠倒混匀。室温静置30-60min消化RNA。13000xg离心3min。转移上清液至新的2.0mL离心管中。加入500μL Buffer DL至消化液中，涡旋混匀20s,70℃水浴10min。加入500μL无水乙醇至消化液中，涡旋混匀20s。把Hipure gDNA Mini Column装在2mL收集管中。转移混合液至柱子中，10000xg离心1min。倒出流出液，把柱子重新装回收集管中，加入500μL BufferGW1至柱子上，10000xg离心1min。倒出流出液，把柱子重新装回收集管中，加入650μLBuffer GW2至柱子上，10000xg离心1min。倒出流出液，把柱子重新装回收集管中，10000xg离心2min。将柱子装在新的1.5mL离心管中。加入30-200μL预热至55℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置2min，10000xg离心1min。丢弃DNA结合柱，用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，并用RNase酶处理；
(2)RAD测序并拼接
利用限制性内切酶EcoRI(GAATTC)对基因组DNA样品进行酶切，所获得的RAD标记数量达到实验所需的饱和度；接着构建测序文库，首先在酶切后的基因组片段两端加上P1接头，然后将加好的P1接头的序列进行打断。通过琼脂糖胶检测，选择400-500bp的目的条带，打断后的DNA片段连接上P2接头，并对这样的混合DNA进行PCR扩增，就可以筛选得到既有P1接头、又有P2接头的DNA序列。上机测序，利用Illumina HiSeq2000平台对三个个体序列进行测序，三个个体的所有数据进行De novo组装，Stacks软件进行数据分析。
(3)多态性微卫星标记筛选
利用Contigs与单个个体序列进行比对，检测出SNP、Indel变异信息以及SSR位点，并根据Indel和SSR的位点信息，获得二者的交集，即在内部存在Indel的SSR位点，作为候选多态性SSR位点，并针对此SSR位点进行PCR引物设计。设计引物的条件为扩增片段长度为100-300bp，GC含量在40-60％之间。共设计了47对引物，扩增出来33对，接着利用这些引物对一个野生花鲈群体进行基因分型，在正向引物5’端用FAM荧光基团进行修饰。PCR反应体系为20μL：含有15.2μL双蒸水，2μL 10×PCR缓冲液，正、反引物各0.6μL(10μm/L)，dNTP 0.3μL(10mm/L)，0.3μL Taq酶(5U/μL)，1μL DNA模板。扩增反应PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，Tm退火30s，72℃延伸30s，反应进行30个循环；最后72℃再延伸10min。Tm值见表1。
(4)微卫星位点基因分型并验证引物的有效性
利用所设计的多态性SSR分子标记在一个野生群体中进行基因分型，来验证引物的有效性。扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500LIZ作为内参，用GeneMapper V 3.2软件读取个体的基因型。采用软件Popgen32计算样本在微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、Hardy-Weinberg平衡，并最终验证引物的高效性(见表1)。
(5)引物筛选的结果
根据分析的数据总共设计了50对引物，有34对能有效扩增出来条带，在表1中我们只列举了其中23对引物的信息，得出符合哈德尔温伯格平衡的引物有22对，充分证明了该方法能大批量且高效筛选多态性微卫星标记的引物。
Figure BDA0000920596020000051
Figure BDA0000920596020000061
Figure IDA0000920596060000011
Figure IDA0000920596060000021
Figure IDA0000920596060000031
Figure IDA0000920596060000041
Figure IDA0000920596060000051
Figure IDA0000920596060000061
Figure IDA0000920596060000071
Figure IDA0000920596060000081
Figure IDA0000920596060000091
Figure IDA0000920596060000101

Claims (7)

1.一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)选取至少3个花鲈待开发样品，分别提取待开发样品的DNA；
(2)对各待开发样品的DNA样品进行酶切并构建测序文库并测序；
(3)所有待开发样品的基因组混合后进行组装获得Contigs；
(4)利用Contigs与各待开发样品个体序列进行比对，检测出SNP、Indel变异信息以及SSR位点，并根据Indel和SSR的位点信息，获得内部存在Indel的SSR位点，作为候选多态性SSR位点；
(5)根据步骤(4)获得的候选多态性SSR位点设计引物，PCR扩增和测序，选取带型稳定清晰条带，作为待验证分子标记引物；
(6)利用步骤(5)所得的分子标记引物，引物序列为SEQ ID No.1-46所示，PCR扩增不同的待开发样品，选取具有多样性的分子标记，获得分子标记。
2.根据权利要求1所述基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，其特征是，所述步骤(1)采用Magen DNA提取试剂盒提取待开发样品的DNA，进行RAD-seq测序。
3.根据权利要求1或2所述基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，其特征是，所述步骤(2)采用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA样品进行酶切。
4.根据权利要求3所述基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，其特征是，所述测序文库构建过程为：酶切后的基因组片段两端先后拼接P1和P2接头，经过PCR扩增和测序后，筛选获得含有P1和P2接头的DNA序列。
5.根据权利要求4所述基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，其特征是，所述步骤(3)中，所有待开发样品的基因组进行Contigs组装，采用Stacks软件进行数据分析。
6.根据权利要求1所述基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，其特征是，所述步骤(3)中利用Illumina HiSeq2000平台进行测序。
7.根据权利要求1所述基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，其特征是，所述步骤(4)设计引物的条件为扩增片段长度为100-300bp，GC含量在40-60％之间。
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