CN107058553A - 一种分子ssr标记技术 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分子SSR标记技术，包括如下步骤：对所需标记的分子进行基因组DNA提取，且基因组DNA提取在35‑50摄氏度的密封条件下进行，选取分子标记所需要的多种引物，在45‑60摄氏度的条件下滴加催化剂，且边滴加边对其进行搅拌，从而分子标记所需的引物进行合成，将处理后的基因组DNA提取置于35‑50摄氏度的条件下，将上述处理完成的PCR扩增产物进行纯化，然后用65‑75％乙醇洗涤一次后，放干后再用无菌水或者TE溶解，然后将PCR扩增产物片段扫描准备，PCR扩增产物上机基因扫描。该能够改变传统的分子标记方法，加快分子标记的进步进程，推动科技成果的转化，促进种子创新工程的发展。

Description

一种分子SSR标记技术
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种分子SSR标记技术。
背景技术
分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。分子标记(Molecular Markers)，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记--形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子SSR标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。开发具有我国特色的重要性状基因的分子标记，将对提高我国分子标记水平起到促进作用。为此，我们提出了一种分子SSR标记技术。
发明内容
本发明提出了一种分子SSR标记技术，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种分子SSR标记技术，包括如下步骤：
A、对所需标记的分子进行基因组DNA提取，且基因组DNA提取在35-50摄氏度的密封条件下进行；
B、选取分子标记所需要的多种引物，并将多种引物放置到透明反应器中，在45-60摄氏度的条件下滴加催化剂，且边滴加边对其进行搅拌，从而分子标记所需的引物进行合成；
C、将A中处理后的基因组DNA提取置于35-50摄氏度的条件下，然后通入合成的引物，且引物在30-45s内完成，从而对片段PCR进行扩增，PCR反应分为两个阶段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用，然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增；
D、将上述处理完成的PCR扩增产物进行纯化，PCR产物加入2倍体积的乙醇中，在20-30摄氏度的条件下沉淀过夜后低速短暂离心，弃掉上清，然后用65-75％乙醇洗涤一次后，弃掉乙醇，放干后再用无菌水或者TE溶解；
E、然后将PCR扩增产物片段扫描准备；
F、PCR扩增产物上机基因扫描；
G、生物信息学分析。
优选的，在D中的低速短暂离心的速率为2500-3500转/min,且离心1-2min。
优选的，所述的透明反应器在使用前，均经过多次的消毒杀菌处理，并对其烘干后再使用。
优选的，催化剂具为异戊醇或者是乙醇中的一种或者是两种混合物。
优选的，催化剂的用量为8-12mL。
本发明还提供了一种基因组DNA提取的方法，具体步骤如下：
A1、将DNA提取材料用不同浓度乙醇逐级脱水,沉淀分离，并向其中加入DNA提取缓冲液，蛋白酶K和催化剂，振荡混匀，从而形成混合溶液；
A2、将上述混合溶液系置于35-40℃的条件下反应30-45min，然后于2-6℃的环境下保存；
A3、将A2中形成的溶液进行离心，得上清，即为所需要的基因组DNA。
优选的，在上述中的催化剂蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的混合物，且蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的重量比为1：1：0.5。
本发明的有益效果：能够改变传统的分子标记方法，建立完善的分子标记研究体系，加快分子标记的进步进程，推动科技成果的转化，促进种子创新工程的发展，还能够有效的提取基因组DNA。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提出了一种分子SSR标记技术，包括如下步骤：
A、对所需标记的分子进行基因组DNA提取，且基因组DNA提取在35摄氏度的密封条件下进行；
B、选取分子标记所需要的多种引物，并将多种引物放置到透明反应器中，在45摄氏度的条件下滴加催化剂，且边滴加边对其进行搅拌，从而分子标记所需的引物进行合成；
C、将A中处理后的基因组DNA提取置于35摄氏度的条件下，然后通入合成的引物，且引物在30s内完成，从而对片段PCR进行扩增，PCR反应分为两个阶段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用，然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增；
D、将上述处理完成的PCR扩增产物进行纯化，PCR产物加入2倍体积的乙醇中，在20摄氏度的条件下沉淀过夜后低速短暂离心，弃掉上清，然后用65％乙醇洗涤一次后，弃掉乙醇，放干后再用无菌水或者TE溶解；
E、然后将PCR扩增产物片段扫描准备；
F、PCR扩增产物上机基因扫描；
G、生物信息学分析。
在D中的低速短暂离心的速率为2500转/min,且离心1min。
所述的透明反应器在使用前，均经过多次的消毒杀菌处理，并对其烘干后再使用。
催化剂具为异戊醇或者是乙醇中的一种或者是两种混合物。
催化剂的用量为8mL。
本发明还提供了一种基因组DNA提取的方法，具体步骤如下：
A1、将DNA提取材料用不同浓度乙醇逐级脱水,沉淀分离，并向其中加入DNA提取缓冲液，蛋白酶K和催化剂，振荡混匀，从而形成混合溶液；
A2、将上述混合溶液系置于35℃的条件下反应30min，然后于2℃的环境下保存；
A3、将A2中形成的溶液进行离心，得上清，即为所需要的基因组DNA。
在上述中的催化剂蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的混合物，且蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的重量比为1：1：0.5。
实施例2
本发明提出了一种分子SSR标记技术，包括如下步骤：
A、对所需标记的分子进行基因组DNA提取，且基因组DNA提取在40摄氏度的密封条件下进行；
B、选取分子标记所需要的多种引物，并将多种引物放置到透明反应器中，在50摄氏度的条件下滴加催化剂，且边滴加边对其进行搅拌，从而分子标记所需的引物进行合成；
C、将A中处理后的基因组DNA提取置于40摄氏度的条件下，然后通入合成的引物，且引物在35s内完成，从而对片段PCR进行扩增，PCR反应分为两个阶段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用，然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增；
D、将上述处理完成的PCR扩增产物进行纯化，PCR产物加入2倍体积的乙醇中，在23摄氏度的条件下沉淀过夜后低速短暂离心，弃掉上清，然后用66％乙醇洗涤一次后，弃掉乙醇，放干后再用无菌水或者TE溶解；
E、然后将PCR扩增产物片段扫描准备；
F、PCR扩增产物上机基因扫描；
G、生物信息学分析。
在D中的低速短暂离心的速率为2800转/min,且离心1.5min。
所述的透明反应器在使用前，均经过多次的消毒杀菌处理，并对其烘干后再使用。
催化剂具为异戊醇或者是乙醇中的一种或者是两种混合物。
催化剂的用量为9mL。
本发明还提供了一种基因组DNA提取的方法，具体步骤如下：
A1、将DNA提取材料用不同浓度乙醇逐级脱水,沉淀分离，并向其中加入DNA提取缓冲液，蛋白酶K和催化剂，振荡混匀，从而形成混合溶液；
A2、将上述混合溶液系置于36℃的条件下反应35min，然后于3℃的环境下保存；
A3、将A2中形成的溶液进行离心，得上清，即为所需要的基因组DNA。
在上述中的催化剂蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的混合物，且蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的重量比为1：1：0.5。
实施例3
本发明提出了一种分子SSR标记技术，包括如下步骤：
A、对所需标记的分子进行基因组DNA提取，且基因组DNA提取在45摄氏度的密封条件下进行；
B、选取分子标记所需要的多种引物，并将多种引物放置到透明反应器中，在55摄氏度的条件下滴加催化剂，且边滴加边对其进行搅拌，从而分子标记所需的引物进行合成；
C、将A中处理后的基因组DNA提取置于45摄氏度的条件下，然后通入合成的引物，且引物在40s内完成，从而对片段PCR进行扩增，PCR反应分为两个阶段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用，然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增；
D、将上述处理完成的PCR扩增产物进行纯化，PCR产物加入2倍体积的乙醇中，在27摄氏度的条件下沉淀过夜后低速短暂离心，弃掉上清，然后用72％乙醇洗涤一次后，弃掉乙醇，放干后再用无菌水或者TE溶解；
E、然后将PCR扩增产物片段扫描准备；
F、PCR扩增产物上机基因扫描；
G、生物信息学分析。
在D中的低速短暂离心的速率为3200转/min,且离心1.8min。
所述的透明反应器在使用前，均经过多次的消毒杀菌处理，并对其烘干后再使用。
催化剂具为异戊醇或者是乙醇中的一种或者是两种混合物。
催化剂的用量为10mL。
本发明还提供了一种基因组DNA提取的方法，具体步骤如下：
A1、将DNA提取材料用不同浓度乙醇逐级脱水,沉淀分离，并向其中加入DNA提取缓冲液，蛋白酶K和催化剂，振荡混匀，从而形成混合溶液；
A2、将上述混合溶液系置于38℃的条件下反应40min，然后于5℃的环境下保存；
A3、将A2中形成的溶液进行离心，得上清，即为所需要的基因组DNA。
在上述中的催化剂蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的混合物，且蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的重量比为1：1：0.5。
实施例4
本发明提出了一种分子SSR标记技术，包括如下步骤：
A、对所需标记的分子进行基因组DNA提取，且基因组DNA提取在50摄氏度的密封条件下进行；
B、选取分子标记所需要的多种引物，并将多种引物放置到透明反应器中，在60摄氏度的条件下滴加催化剂，且边滴加边对其进行搅拌，从而分子标记所需的引物进行合成；
C、将A中处理后的基因组DNA提取置于50摄氏度的条件下，然后通入合成的引物，且引物在45s内完成，从而对片段PCR进行扩增，PCR反应分为两个阶段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用，然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增；
D、将上述处理完成的PCR扩增产物进行纯化，PCR产物加入2倍体积的乙醇中，在30摄氏度的条件下沉淀过夜后低速短暂离心，弃掉上清，然后用75％乙醇洗涤一次后，弃掉乙醇，放干后再用无菌水或者TE溶解；
E、然后将PCR扩增产物片段扫描准备；
F、PCR扩增产物上机基因扫描；
G、生物信息学分析。
在D中的低速短暂离心的速率为3500转/min,且离心2min。
所述的透明反应器在使用前，均经过多次的消毒杀菌处理，并对其烘干后再使用。
催化剂具为异戊醇或者是乙醇中的一种或者是两种混合物。
催化剂的用量为12mL。
本发明还提供了一种基因组DNA提取的方法，具体步骤如下：
A1、将DNA提取材料用不同浓度乙醇逐级脱水,沉淀分离，并向其中加入DNA提取缓冲液，蛋白酶K和催化剂，振荡混匀，从而形成混合溶液；
A2、将上述混合溶液系置于40℃的条件下反应45min，然后于6℃的环境下保存；
A3、将A2中形成的溶液进行离心，得上清，即为所需要的基因组DNA。
在上述中的催化剂蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的混合物，且蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的重量比为1：1：0.5。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种分子SSR标记技术，其特征在于，包括如下步骤：
A、对所需标记的分子进行基因组DNA提取，且基因组DNA提取在35-50摄氏度的密封条件下进行；
B、选取分子标记所需要的多种引物，并将多种引物放置到透明反应器中，在45-60摄氏度的条件下滴加催化剂，且边滴加边对其进行搅拌，从而分子标记所需的引物进行合成；
C、将A中处理后的基因组DNA提取置于35-50摄氏度的条件下，然后通入合成的引物，且引物在30-45s内完成，从而对片段PCR进行扩增，PCR反应分为两个阶段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用，然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增；
D、将上述处理完成的PCR扩增产物进行纯化，PCR产物加入2倍体积的乙醇中，在20-30摄氏度的条件下沉淀过夜后低速短暂离心，弃掉上清，然后用65-75％乙醇洗涤一次后，弃掉乙醇，放干后再用无菌水或者TE溶解；
E、然后将PCR扩增产物片段扫描准备；
F、PCR扩增产物上机基因扫描；
G、生物信息学分析。
2.根据权利要求1所述的分子SSR标记技术，其特征在于，在D中的低速短暂离心的速率为2500-3500转/min,且离心1-2min。
3.根据权利要求1所述的分子SSR标记技术，其特征在于，所述的透明反应器在使用前，均经过多次的消毒杀菌处理，并对其烘干后再使用。
4.根据权利要求1所述的分子SSR标记技术，其特征在于，催化剂具为异戊醇或者是乙醇中的一种或者是两种混合物。
5.根据权利要求1所述的分子SSR标记技术，其特征在于，催化剂的用量为8-12mL。
6.一种根据权利要求1所述的基因组DNA提取的方法，其特征在于，具体步骤如下：
A1、将DNA提取材料用不同浓度乙醇逐级脱水,沉淀分离，并向其中加入DNA提取缓冲液，蛋白酶K和催化剂，振荡混匀，从而形成混合溶液；
A2、将上述混合溶液系置于35-40℃的条件下反应30-45min，然后于2-6℃的环境下保存；
A3、将A2中形成的溶液进行离心，得上清，即为所需要的基因组DNA。
7.根据权利要求6所述的基因组DNA提取的方法，其特征在于，在上述中的催化剂蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的混合物，且蛋白酶、核糖核酸酶与缓冲液ATL的重量比为1：1：0.5。
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