CN105316329B - 金针菇ssr分子标记及其对应引物与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供金针菇SSR分子标记及其对应引物与应用，金针菇SSR分子标记为序列表中SEQIDNO:1至SEQIDNO:13中的任意一个SSR位点；金针菇SSR分子标记位点两端的侧翼序列上开发的金针菇SSR引物具有序列表中SEQIDNO:14至SEQIDNO:39中所示的碱基序列。在已有金针菇基因组的基础上利用生物信息学方法对其基因组SSR位点进行检测并开发引物，利用不同金针菇菌株对这些SSR位点进行筛选后得到13对多态性较高的SSR分子标记，上述SSR分子标记可用于金针菇的种质资源鉴定、保护及品种选育。
Description
技术领域：
本发明属于分子生物学DNA分子标记技术领域，具体涉及对金针菇不同菌株进行鉴定的SSR标记方法，金针菇SSR分子标记及其对应引物序列的开发与应用。
背景技术：
金针菇Flammulina velutipes隶属于膨瑚菌科Physalacriaceae冬菇属Flammulina，是我国主要栽培食用菌种类之一，2012年我国金针菇年产量240 万吨，居世界第一位。然而，目前我国金针菇产业大而不强，菌种问题成为金针菇产业发展的瓶颈，具体表现为：在实际生产过程中常出现各单位引种途径不一，引种后各自取名、各自编号，出现很多同物异名现象。不合理的引种、育种往往造成品种质量低劣，损害菇农利益，侵犯品种权(张金霞等，2004；冯作山，2010)。为规范菌种开发和保护，开发一套快速有效的鉴别金针菇不同品种的方法已成为当务之急。
目前，基于DNA序列的分子标记方法是DNA水平遗传多态性的直接反应，能有效对近缘种或种下不同个体进行准确鉴别(Freeland，2005)。相较于其它分子标记方法，SSR分子标记具有广泛分布于基因组的编码区及非编码区、共显性、多态性高、稳定性好、易于扩增等优点。随着越来越多的物种的基因组被测序，基于基因组序列，运用生物信息学的方法从基因组中直接开发SSR标记克服了基于实验手段开发SSR标记费时费力的缺点，该方法成为目前开发SSR标记的主流方法。因此，利用已有的金针菇基因组数据开发高分辨率的SSR标记对金针菇种质资源鉴定、保护及品种选育具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种对金针菇不同菌株进行准确鉴定的SSR标记方法，该方法为金针菇的种质资源鉴定、保护及品种选育提供有力工具。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
金针菇SSR分子标记，其为序列表中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任意一个SSR位点。
在所述的金针菇SSR分子标记位点两端的侧翼序列上的金针菇SSR引物，其具有序列表中SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:39中所示的碱基序列。
如所述的金针菇SSR分子标记，其中所述金针菇SSR分子标记13个SSR 位点在55个金针菇样品中的等位基因数Na为2-8个，平均4.2个，香浓多样性指数I平均值为0.821，观测杂合度Ho平均值为0.401，期望杂合度He平均值为0.455，多态性信息含量PIC平均值为0.426，13个SSR位点在金针菇样本中具有较高的多态性。
如所述的金针菇SSR分子标记和金针菇SSR引物，其中所述的金针菇SSR 分子标记及对应SSR引物的的核苷酸序列如表1，
表1 SSR位点及引物序列
所述的金针菇SSR分子标记的开发方法，包括下述步骤：用生物信息学方法检测金针菇基因组序列中的SSR序列，选取部分SSR序列进行引物开发，运用不同金针菇菌株进行SSR位点的筛选，最终筛选出13对多态性较高的SSR分子标记，上述SSR标记及对应引物的核苷酸序列如表1。
本发明还提供了所述的金针菇SSR分子标记和金针菇SSR引物在鉴别金针菇不同品种中的应用。
所述应用是利用现有的金针菇基因组序列，用生物信息学方法检测其中的 SSR位点，选取部分SSR位点进行引物开发，用不同种类金针菇菌株进行SSR 位点筛选出多态性较高的SSR分子标记，通过运用不同SSR位点的荧光引物对不同种类的金针菇菌株的DNA进行PCR扩增，然后将PCR产物运用ABI3730 设备进行毛细管电泳，使用Genemapper软件分析SSR数据，通过对SSR数据比对鉴定出不同种类的金针菇菌株。
对金针菇不同菌株进行鉴定的SSR标记及引物开发的方法，该方法包括下述步骤：运用软件MISA和Primer3设计金针菇基因组SSR位点及其引物，运用改良的CTAB法提取金针菇DNA，将所设计的SSR引物对金针菇DNA进行PCR 扩增、检测。
如所述的对金针菇不同菌株进行鉴定的SSR标记方法，该方法具体包括下述步骤：
所述的金针菇基因组SSR位点开发及引物设计是从NCBI上下载金针菇基因组数据，运用软件MISA对其基因组SSR位点进行检测，运用软件Primer3 对被检测到的SSR位点在其上游及下游200bp范围内进行引物开发，引物开发条件为：引物长度在18bp-23bp之间，引物TM值在57-62之间，GC含量在 30％-70％之间。
所述的金针菇基因组提取及检测中总DNA提取用改进的CTAB法：
(1)用接种刀刮取培养皿中的菌丝，放于2ml离心管中，加入少量石英砂、 PVP和350μl在65℃下预热的4×CTAB提取液，提取液内含0.2％的β-巯基乙醇，研磨，菌丝磨匀后，再加入上述4×CTAB提取液400μl振荡混匀，在65℃水浴锅中温浴2～4h，30min摇匀一次；
(2)将温浴材料取出置于室温下，待其冷却到室温后加入750μl24︰1氯仿 -异戊醇，摇匀，12000r/min下离心10min；
(3)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，摇匀，12000r/min下离心10min；
(4)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入80％体积的异丙醇，预冷至-20℃，充分混匀，于-20℃冰箱中放置1～2h；
(5)自冰箱中取出，恢复到室温后，12000r/min下离心15min，弃上清液；
(6)用500μl的70％的乙醇和无水乙醇各冲洗1～2次，每次12000r/min 室温离心1min后弃上清液，然后将离心管置于37℃恒温箱中约20～30min，使乙醇充分挥发，或者开盖使其自然干燥，干燥后加入灭菌的蒸馏水；
(7)用核酸浓度检测仪检测DNA浓度，将浓度调节至100ng/μl，置于-20℃保存；
所述的SSR位点的PCR扩增检测是从上述筛选到的SSR位点中随机选取 124个位点对8个不同来源的金针菇菌株进行初步筛选，检测扩增条带的有无， PCR反应体系为：100ng/μl的DNA模板1μl，25mg/ml BSA 1μl，10×PCRBuffer 2.5μl，dNTP10mm 0.5μl，正向引物5um 1μl，反向引物5um1μl，Taq酶0.3μl， ddH2015.7μl，PCR反应条件为：94℃：4min，(94℃30s，55℃30s，72℃30s) ×35cycles，72℃8min，PCR产物点样于1％浓度的琼脂糖胶中，放入1×TAE 缓冲液中进行电泳检测，经检测有109对引物在8个金针菇菌株中扩增出清晰明亮的条带，从中选取13对引物进行荧光引物合成，后将13对荧光引物及55个金针菇菌株DNA样品进行荧光引物扩增，并用ABI3730xl设备检测扩增产物，使用Genemapper软件分析、记录SSR数据；
所述的SSR位点遗传多样性信息计算是将获得的SSR数据运用PopGene32 和PIC_CALC软件进行各位点的遗传多样性指标及多态性信息含量计算，结果如表2，13个SSR位点在55个金针菇样品中的等位基因数Na为2-8个，平均 4.2个，香浓多样性指数I平均值为0.821，观测杂合度Ho平均值为0.401，期望杂合度He平均值为0.455，多态性信息含量PIC平均值为0.426，结果表明13 个SSR位点在金针菇样本中具有较高的多态性；用软件NTsys2.10e构建样品间的UPGMA树，结果如图1，13个SSR位点将55个金针菇菌株区分开，
表2 13个微卫星位点的遗传多样性信息
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明利用现有的金针菇基因组序列，运用生物信息学方法检测其中的SSR序列，选取部分SSR序列进行引物开发，运用来自全国不同科研单位及公司的不同金针菇菌株进行SSR位点的筛选，最终筛选出13对多态性较高的SSR分子标记。提供了一种对金针菇不同菌株进行准确鉴定的SSR标记方法，开发出金针菇SSR分子标记，为金针菇的种质资源鉴定、保护及品种选育提供有力工具。
附图说明：
图1为基于13个SSR位点对55个金针菇菌株构建的UPGMA树。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
本发明的序列表中1-13为金针菇基因组SSR位点SSR2、SSR7、SSR15、 SSR21、SSR22、SSR23、SSR32、SSR45、SSR87、SSR95、SSR107、SSR124、 SSR133的核苷酸序列(分别为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:13；
序列表中14-40为金针菇基因组SSR位点的引物SSR2-F、SSR2-R、SSR7-F、 SSR7-R、SSR15-F、SSR15-R、SSR21-F、SSR21-R、SSR22-F、SSR22-R、SSR23-F、 SSR23-R、SSR32-F、SSR32-R、SSR45-F、SSR45-R、SSR87-F、SSR87-R、SSR95-F、 SSR95-R、SSR107-F、SSR107-R、SSR124-F、SSR124-R、SSR133-F、SSR133-R 的核苷酸序列(分别为SEQ ID NO:14-SEQ IDNO:39)。
1.金针菇基因组SSR位点及引物开发：
从NCBI上下载金针菇基因组数据，运用软件MISA对其基因组SSR位点进行检测，运用软件Primer 3对被检测到的SSR位点在其上游及下游200bp范围内进行引物开发，引物开发条件为：引物长度在18bp-23b之间，引物TM值在57-62之间，GC含量在30％-70％之间。
2.金针菇基因组提取及检测：
总DNA提取采用改进的CTAB法，具体操作步骤如下：
(1)用接种刀刮取培养皿中的菌丝，放于2ml离心管中，加入少量石英砂、 PVP和350μl在65℃下预热的4×CTAB提取液(内含0.2％的β-巯基乙醇)研磨，菌丝磨匀后，再加入上述4×CTAB提取液400μl振荡混匀，在65℃水浴锅中温浴2～4h(30min摇匀一次)；
(2)将温浴材料取出置于室温下，待其冷却到室温后加入750μl氯仿-异戊醇(24︰1)，摇匀，12000r/min下离心10min；
(3)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，摇匀，12000r/min下离心10min；
(4)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入80％体积的异丙醇(预冷至-20℃)，充分混匀，于-20℃冰箱中放置1～2h；
(5)自冰箱中取出，恢复到室温后，12000r/min下离心15min，弃上清液；
(6)用500μl的70％的乙醇和无水乙醇各冲洗1～2次，每次12000r/min 室温离心1min后弃上清液，然后将离心管置于37℃恒温箱中约20～30min，使乙醇充分挥发(也可以开盖使其自然干燥)。干燥后加入灭菌的蒸馏水。
(7)用核酸浓度检测仪检测DNA浓度，将浓度调节至100ng/μl，置于-20℃保存。
3.SSR位点的PCR扩增检测：
从上述筛选到的SSR位点中随机选取124个位点对8个不同来源的金针菇菌株进行初步筛选，检测扩增条带的有无。PCR反应体系为：100ng/μl的DNA 模板1μl，25mg/ml BSA 1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP(10mm)0.5μl，正向引物(5um)1μl，反向引物(5um)1μl，Taq酶0.3μl，ddH2015.7μl。PCR反应条件为：94℃：4min，(94℃30s，55℃30s，72℃30s)×35cycles，72℃8min。 PCR产物点样于1％浓度的琼脂糖胶中，放入1×TAE缓冲液中进行电泳检测。经检测发现有109对引物可在8个金针菇菌株中扩增出清晰明亮的条带，从中选取13对引物进行荧光引物合成，后将13对荧光引物及55个金针菇菌株DNA 样品送至昆明硕擎生物科技有限公司进行荧光引物扩增，并用ABI3730xl设备检测扩增产物，使用Genemapper软件分析、记录SSR数据。
所述的SSR标记及对应引物的核苷酸序列如下：
SSR2，由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成：
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SSR7，由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成：
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SSR15，由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列组成：
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SSR21，由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成：
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SSR22，由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列组成：
CCGTCGATGGTGATCCCCTGTGCCAGCTCTTCGCCGTAGCAATATTACCAAACGCTCTGGCCGTGTTATACTTCGTGTGTCAAGTTAAACTTTAGCTCTCCCGTCAGCTTGCAGCTTTATATGGCATAAATAAATGCTTACATATGAGCCATTTCCACCGAACTGTGTCTCCAGTGTGCGTCGAATAAACAACTGACGGAGATGATGATGATGATGATGATAGGTACACAAGGACTCACGCTTACTTCACGTGAGTGCTCGCTCGCGCTGTTAAGCGCGACTCGGAGTGCCCGGCCAGTGTCGCATCCAGGGGTTACCTAGGCGTCATGTACCTGAGCTTCTCCGAGGGAACGAGGTGGCGCGATTCCTACCTGCGCCACCTTTTGAAAATATTGCCAGGCGACAAAGACGGTT TCACTCG
SSR23，由SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成：
ACCAGAGTCGGTATATCCACCTCCGCGCAAGGTCATGTGACCTTTCGAGAAAGTATACAAGTCATCGACGAGCCTAGCCCAGAGTCTGATACTGAAGAGGAAGAGCAGAACCTGACGGATACAGAGCCTAACACTGAGGAGGAGGACATAGAAGGCGAGGAGCCTACTCACAAACCAATTCTGGTGATGGAGGACAATATCGACGACGACGACGACGACGAAGGGGAGGAGGAACGAAGCGACAGTGCCAACGTACTAGTTAATCCTTTCACATCAGAATCTGGTATGTCCATGTTTCCCCTGTCTACGACAATGCTAACCATTGAGACAGACATTCCCTTCGTTCGGGTCTTTGGGACTGGAGCTGTTCGGAGGACTCTCGTTCAGCTGGCCCGTGCATGTCATGCTTCTGCA AGCCTGC
SSR32，由SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列组成：
GGAGAAGGTGTTGAATGTTCCGTTTCTGTGGCTTTCCCAATCCAAGTTCGCGAGAGAGAATATTTCGGAGAGGCAGTCGTCGTTCAAGGTGTCGATGAAGGTGGAAGGTAGTTGCATGACGCTGATGAAATGTGAGTCAACGCACAGGAATTGAGTTGGGGGACACATACCTCGACATCGTAGAATGAAGGGTAGGTGGAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGTAGGAAATGATCATATGTGTGTGGCTTTTGTATGCAAAGTGGCGTGTACGATCTGTTATTGTTCAGCTCGGCAAATCAAAAGTGGAACAAACAACCGGTCTTACGGTCATTCATTCTGAACAGCGGACTGAGCGCAATCTTCCCATTCGCACATGACAACGAAAGAGAGCAATGTGTAGGGGTGGAAGGGTCCCCG
SSR45，由SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成：
CCCAACACCGGACATATACAATTAAGGGATGTCAAATATCTACTGCTACATATACAATATGAACAAAATCTCTACTAAGTAAATATAACACAAAATACAAAGCGCTCCAAAAAATAAAAGCCCCATCAGGTATCACCCTCCCCGCTACCCCCTTCAACAACCCACTTCATCCTCTCCACCGCACCAAGATGCCACGGCATACCACCACCACCACCACTCCGTCCACCCCCCATCCCCTTCAAACCCCCCAACACTGCCAACCCAAAATACGACCGCGTCACATCCCTAACCAACTCCTCATGCCCCCTCGCAGGATACACACACCCCACAGACCGTATGACATGCACAAGATGCACATGCACCATGCTCACATTCCCGCTCTCCGGCACCCGAATCAGTGTCGAGCTCGCATGC G
SSR87，由SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列组成：
CTTTGTCGAATTTTCACTACATATCGTACTTACTGATTCGCACTGAATGGTTGATTCTTCCCGCCCTCCTTTGAGTGTTCTTTGACGGCTTCAGGATAGGAATGAAGTTGTTCACTTCGACACCGAAATCTGTGGAAAAGTATCAATGAGCTAGCCCGGGCCGCTTGTCCATGTCGTTCTCTGTTTCTTACCATCACTTGTCTCTCTCTCTCTCTAATATCATTTGCTAGACATGAATGGTAAGCTTATAAGACGTCTACTTCTCCTTCCAACTCCGATTCAAAGAGGAAGGTCTCGAGGTCAATATCAACGACATACGTTAGTCTACACTTCCTTATCGAATCCTTTCGCTGACATCTTCCAGCATTGTCAGATCAGTCAGCATTACTGTACATGTGAAGAATGATACCGTTC
SSR95，由SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列组成：
TTTGTTGTTCTAAAGCTGAGCTTTGACTAGTTGGCGTTTCCGACAACTTAGCGGTTGGCTTGGCTTTTGGGGCTATTTTGGATTGGGTGTAGAAATAACTTGTTAACTCTTGTTTTACGAAGAATCGACTAAGTCAAATTTATCACCCCTCGCGGTGGGCTCCAAAATATGATGAGCAGTGCAAAAGAACACCACCAAATCACACACACACACACACTAACAAGTAGGCGTGGAAATGCAAGTCCGCTTCGATAGCGGGTCTGCTTTTTAATTGTTTAGAGTTCGATGAACTGGTCTTTGGGGTTTCGGGAAGGTATGGGGGTTCGATTGCAACGGTTCAAAATGTATAACAAGTTCGAGGGGTAACAGGGATCTGATCTTTAGTTGAAAACTAGAGGCCAACAAGAGTCACAG GC
SSR107由SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列组成：
GCTCCTTTGTTGCGCGCTGGCAAGACGCGACGAGCTCTGATTCTACACGGACGTCTTCGGTTACCTTGGCACTGGGAAGGACGATGGACATGGAATAGAGGTGTCCGAAATGCGAGCCATGTATGCGCTCTAGGTGCGTTGATCACCACTCTGCGCTCGTTTTTCTCATCCTTAGGCGATTTGCGCATAGGTGCATAGAGGAGAGAGAGAGACGCGAGTCATGTTAGCGTTCGATAGGTGTGTTTCAACGGCTCTGCGCTCTCTTTTCTTTGCTCAGATAAGGTCGCATAGGTGCCCAGAGCGCCTGTCATTCCCCCTTCTCCATCACCTTCTACGAGCGCCAGACAGAGCTGTATAACCTGGCGGGATGCGCAAACTCGTGCAACGAACGACCCGTCGCGGGCGAATGC AT
SSR124，由SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列组成：
CATGATGAACAGAACAATGTACGCGGAACAGAAAAGCTCGTCATAAGGCCCAAAAATTGAGAGGGTGCATGGAGGTGGACCGGCCATTTGATTCAAATGACAGCTGTCCCGTCGACGTCATCCCCTATCCTCCACGAAAGTATAAAGGTCAACACGAACGACTGAACTTTCCCCCCATCCCTCATACCTCATCATGTCATACAACAACAACAACAACTCTGATTCCTACGGCTCGAACGACAACTCGAACTCCTCCCGCAACGAGGATTCGTCCAACACCTACGGCGGTGGAGATCGCGAGTCCTCCAACAACTCTTCGTCGTACGGCAATGATTCCTCCGCTCGTGCTACGACCACTTCCTCGTACGGCGACAACGATCGTTCTTCCTCCAACAACAACTCTAACACCAACTC C
SSR133，由SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列组成：
GACGTTCAGGAAATGAACGTCGAGTGATTCAGGACGTCTACGAGACCAATGCTATACGGATATTTAATTCTATCTAGTTTACTTACTATTCTTGCCTTATACCAACCTTATACTAAATGATGATCTACGTTGTTGAAGTGCTTTAGCCGTCGGCCGATCGAATCCAGGCCTTCGCCTTGGTCTACGAAACTAGCTCCTCTTCTCTCTCTCTCTCATGTCGCAGTCAACAATCTCAACGACCTTTACAGAGTCGCCTCCATCATCGCCTAGTGGATGGATTGACTCGTCTCCCCCATCATCACCTGGCGGAGAAGCCCCAGACATTAGCTTCGACCATCCCTATGCTGGCTCTCAGAAGCTCACACGTAAACCGAAAGACTACGACCGGGAAGCGCGTGGGTTCAGGAAACCTCG
上述SSR分子标记的引物序列分别为：
SSR2-F，由SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列组成：
GCACGCTCCT AAACCTATCG
SSR2-R，由SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列组成：
CGACTTGTCG AGGAAGATCC
SSR7-F，由SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列组成：
ACGCTAATCC GCTTGTTCAT
SSR7-R，由SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列组成：
TCGCGTCACT CGTGTAAGTC
SSR15-F，由SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列组成：
GATGACGAGG ACAGTGACGA
SSR15-R，由SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列组成：
CCTCCTTCCT CCTCCATAGC
SSR21-F，由SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列组成：
GAAGCTGATC CTTGGCTTTG
SSR21-R，由SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列组成：
CTAGACACAC CGCCTCTTCC
SSR22-F，由SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列组成：
TCTTCGGATG CTTTGGAATC
SSR22-R，由SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列组成：
TCGTTCTCTT TGCACACGTC
SSR23-F，由SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列组成：
AAGTCATCGA CGAGCCTAGC
SSR23-R，由SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列组成：
CGAACGAAGG GAATGTCTGT
SSR32-F，由SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列组成：
CGTCGTTCAA GGTGTCGATG
SSR32-R，由SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列组成：
GACCGGTTGT TTGTTCCACT
SSR45-F，由SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列组成：
CCCAACACCG GACATATACA
SSR45-R，由SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列组成：
GTTGGTTAGG GATGTGACGC
SSR87-F，由SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列组成：
CGCTTGTCCA TGTCGTTCTC
SSR87-R，由SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列组成：
TGCTGACTGA TCTGACAATG C
SSR95-F，由SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列组成：
ACAACTTAGC GGTTGGCTTG
SSR95-R，由SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列组成：
CTATCGAAGC GGACTTGCAT
SSR107-F，由SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列组成：
ACACGGACGT CTTCGGTTAC
SSR107-R，由SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列组成：
AGAGCCGTTG AAACACACCT
SSR124-F，由SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列组成：
AATTGAGAGG GTGCATGGAG
SSR124-R，由SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列组成：
GTGTTGGACG AATCCTCGTT
SSR133-F，由SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列组成：
TGAACGTCGA GTGATTCAGG
SSR133-R，由SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列组成：
GGAGACGAGT CAATCCATCC
4.SSR位点遗传多样性信息计算：
将获得的SSR数据运用PopGene32和PIC_CALC软件进行各位点的遗传多样性指标及多态性信息含量(Polymorphism information content，PIC)计算，结果如表2，13个SSR位点在55个金针菇样品中的等位基因数(Na)为2-8个，平均4.2个，香浓多样性指数(I)平均值为0.821，观测杂合度(Ho)平均值为 0.401，期望杂合度(He)平均值为0.455，多态性信息含量(PIC)平均值为0.426，结果表明13个SSR位点在金针菇样本中具有较高的多态性。用软件NTsys 2.10e 构建样品间的UPGMA树，结果如图1，13个SSR位点可将55个金针菇菌株区分开。
表2 13个微卫星位点的遗传多样性信息
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院昆明植物研究所
<120> 金针菇 SSR 分子标记开发
<130> 2015
<160> 39
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 430
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 1
catgttctcc tccgtcgtcg acgttcatca aggagttggt gcacgctcct aaacctatcg 60
tcgaacatga gcccgtttgt tcttctcagg cgtctacgtc catcgccgag ctgcacgctc 120
ctaaaaccgt ggtcgagccc gaggtcaacc ttgacttctg catgaactgg ttccaggaca 180
aagaatacga agacgaggac gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gagttcgacg 240
acgacgccac cctgcgctgg atccccgctg aatggcaaca accagctcac gagcatgtcc 300
ttcctcgcat ggatcttcct cgacaagtcg cagttcacag cgtcgtcatc aagaacgctc 360
cagtagtccc ggaatataca gccctcccgt cccccccttc accatcacct ttgcccgttc 420
cttcgccaca 430
<210> 2
<211> 424
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 2
aaacggagag tattttgagc gccttggtat atgggtggta agtagcctag ttccagccat 60
aggtacgcta atccgcttgt tcatgtatgg tagcgcgctt cccgaagatt ttgtcgagaa 120
acgattccac ctttcctttg tctcccgcat cctcgtcaga tgaaaataat tcggagccac 180
cgccacctcc cttaccacga cctcctcctc ctcctcctcc tcctctaccc tttggttccg 240
gtgcctgtga aatatgaatc aacctgcgat gagcatgagg gctcggacat atattgactt 300
acacgagtga cgcgaagtgg cgaacccata acgagggaga cgctagcgcc caaaagcatg 360
aaatacagag tcgatgttcg catccttgtt atagttaatc gaccagcgat atagacgatg 420
caga 424
<210> 3
<211> 421
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 3
atctttgcta gtgatgacga ggacagtgac gacgaggggg cgactgaatc taagaaggac 60
gagatggacg tcgacgaacc cccactagaa aagccgaagc cgatcttccc ggatgaacct 120
gttgatatca acacattcaa accgaccttc ataccgcgcg aaggaaaggc gaaggaacga 180
gactctgaaa aggatccggc gaagaagaag aagaagaaga aagacaagga gaagaagaag 240
gttctggttt cgtttgctat ggaggaggaa ggaggtgcag acgttgctcc tactccaaag 300
aagaagagac ggaaacaaaa caggagtgca gacgatgatg actcgatgtg ggtggagaaa 360
gctcccccac ctatcgtggc gtctactttg ccatcaacct tagggaccga ttcggcggac 420
g 421
<210> 4
<211> 421
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 4
attcaggcct ccggttcatg atacttcctc ttctcagcag ccaaccgcgc gcgcagcctc 60
aacgattttt ccttcatctc gctccccgag gccttcaaac cgcgttccgt ctcggttcct 120
tggtccgtcg tctgcgcttt caaagccaag agtcgttttc ttagatcttc ctgtttcgaa 180
gctgatcctt ggctttgcga tgttgttgtt gttgttgttg ttggggttgg aggctgaacg 240
ggaaggggat cttccctccc cttgcccttg accttgagat gggcgtgaag tgactccagt 300
gcgctgcgcg ggggacgttt tgggcggtcc gggagaggga gagggggcgt gtctggagga 360
agaggcggtg tgtctaggtc tagaggaaga gacaggtgcg gtgacgagga tctcctgtgc 420
c 421
<210> 5
<211> 421
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 5
ccgtcgatgg tgatcccctg tgccagctct tcgccgtagc aatattacca aacgctctgg 60
ccgtgttata cttcgtgtgt caagttaaac tttagctctc ccgtcagctt gcagctttat 120
atggcataaa taaatgctta catatgagcc atttccaccg aactgtgtct ccagtgtgcg 180
tcgaataaac aactgacgga gatgatgatg atgatgatga taggtacaca aggactcacg 240
cttacttcac gtgagtgctc gctcgcgctg ttaagcgcga ctcggagtgc ccggccagtg 300
tcgcatccag gggttaccta ggcgtcatgt acctgagctt ctccgaggga acgaggtggc 360
gcgattccta cctgcgccac cttttgaaaa tattgccagg cgacaaagac ggtttcactc 420
g 421
<210> 6
<211> 421
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 6
accagagtcg gtatatccac ctccgcgcaa ggtcatgtga cctttcgaga aagtatacaa 60
gtcatcgacg agcctagccc agagtctgat actgaagagg aagagcagaa cctgacggat 120
acagagccta acactgagga ggaggacata gaaggcgagg agcctactca caaaccaatt 180
ctggtgatgg aggacaatat cgacgacgac gacgacgacg aaggggagga ggaacgaagc 240
gacagtgcca acgtactagt taatcctttc acatcagaat ctggtatgtc catgtttccc 300
ctgtctacga caatgctaac cattgagaca gacattccct tcgttcgggt ctttgggact 360
ggagctgttc ggaggactct cgttcagctg gcccgtgcat gtcatgcttc tgcaagcctg 420
c 421
<210> 7
<211> 424
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 7
ggagaaggtg ttgaatgttc cgtttctgtg gctttcccaa tccaagttcg cgagagagaa 60
tatttcggag aggcagtcgt cgttcaaggt gtcgatgaag gtggaaggta gttgcatgac 120
gctgatgaaa tgtgagtcaa cgcacaggaa ttgagttggg ggacacatac ctcgacatcg 180
tagaatgaag ggtaggtgga gtggtggtgg tggtggtggt ggtggaggta ggaaatgatc 240
atatgtgtgt ggcttttgta tgcaaagtgg cgtgtacgat ctgttattgt tcagctcggc 300
aaatcaaaag tggaacaaac aaccggtctt acggtcattc attctgaaca gcggactgag 360
cgcaatcttc ccattcgcac atgacaacga aagagagcaa tgtgtagggg tggaagggtc 420
cccg 424
<210> 8
<211> 415
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 8
cccaacaccg gacatataca attaagggat gtcaaatatc tactgctaca tatacaatat 60
gaacaaaatc tctactaagt aaatataaca caaaatacaa agcgctccaa aaaataaaag 120
ccccatcagg tatcaccctc cccgctaccc ccttcaacaa cccacttcat cctctccacc 180
gcaccaagat gccacggcat accaccacca ccaccactcc gtccaccccc catccccttc 240
aaacccccca acactgccaa cccaaaatac gaccgcgtca catccctaac caactcctca 300
tgccccctcg caggatacac acaccccaca gaccgtatga catgcacaag atgcacatgc 360
accatgctca cattcccgct ctccggcacc cgaatcagtg tcgagctcgc atgcg 415
<210> 9
<211> 414
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 9
ctttgtcgaa ttttcactac atatcgtact tactgattcg cactgaatgg ttgattcttc 60
ccgccctcct ttgagtgttc tttgacggct tcaggatagg aatgaagttg ttcacttcga 120
caccgaaatc tgtggaaaag tatcaatgag ctagcccggg ccgcttgtcc atgtcgttct 180
ctgtttctta ccatcacttg tctctctctc tctctaatat catttgctag acatgaatgg 240
taagcttata agacgtctac ttctccttcc aactccgatt caaagaggaa ggtctcgagg 300
tcaatatcaa cgacatacgt tagtctacac ttccttatcg aatcctttcg ctgacatctt 360
ccagcattgt cagatcagtc agcattactg tacatgtgaa gaatgatacc gttc 414
<210> 10
<211> 416
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 10
tttgttgttc taaagctgag ctttgactag ttggcgtttc cgacaactta gcggttggct 60
tggcttttgg ggctattttg gattgggtgt agaaataact tgttaactct tgttttacga 120
agaatcgact aagtcaaatt tatcacccct cgcggtgggc tccaaaatat gatgagcagt 180
gcaaaagaac accaccaaat cacacacaca cacacactaa caagtaggcg tggaaatgca 240
agtccgcttc gatagcgggt ctgcttttta attgtttaga gttcgatgaa ctggtctttg 300
gggtttcggg aaggtatggg ggttcgattg caacggttca aaatgtataa caagttcgag 360
gggtaacagg gatctgatct ttagttgaaa actagaggcc aacaagagtc acaggc 416
<210> 11
<211> 412
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 11
gctcctttgt tgcgcgctgg caagacgcga cgagctctga ttctacacgg acgtcttcgg 60
ttaccttggc actgggaagg acgatggaca tggaatagag gtgtccgaaa tgcgagccat 120
gtatgcgctc taggtgcgtt gatcaccact ctgcgctcgt ttttctcatc cttaggcgat 180
ttgcgcatag gtgcatagag gagagagaga gacgcgagtc atgttagcgt tcgataggtg 240
tgtttcaacg gctctgcgct ctcttttctt tgctcagata aggtcgcata ggtgcccaga 300
gcgcctgtca ttcccccttc tccatcacct tctacgagcg ccagacagag ctgtataacc 360
tggcgggatg cgcaaactcg tgcaacgaac gacccgtcgc gggcgaatgc at 412
<210> 12
<211> 415
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 12
catgatgaac agaacaatgt acgcggaaca gaaaagctcg tcataaggcc caaaaattga 60
gagggtgcat ggaggtggac cggccatttg attcaaatga cagctgtccc gtcgacgtca 120
tcccctatcc tccacgaaag tataaaggtc aacacgaacg actgaacttt ccccccatcc 180
ctcatacctc atcatgtcat acaacaacaa caacaactct gattcctacg gctcgaacga 240
caactcgaac tcctcccgca acgaggattc gtccaacacc tacggcggtg gagatcgcga 300
gtcctccaac aactcttcgt cgtacggcaa tgattcctcc gctcgtgcta cgaccacttc 360
ctcgtacggc gacaacgatc gttcttcctc caacaacaac tctaacacca actcc 415
<210> 13
<211> 414
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 13
gacgttcagg aaatgaacgt cgagtgattc aggacgtcta cgagaccaat gctatacgga 60
tatttaattc tatctagttt acttactatt cttgccttat accaacctta tactaaatga 120
tgatctacgt tgttgaagtg ctttagccgt cggccgatcg aatccaggcc ttcgccttgg 180
tctacgaaac tagctcctct tctctctctc tctcatgtcg cagtcaacaa tctcaacgac 240
ctttacagag tcgcctccat catcgcctag tggatggatt gactcgtctc ccccatcatc 300
acctggcgga gaagccccag acattagctt cgaccatccc tatgctggct ctcagaagct 360
cacacgtaaa ccgaaagact acgaccggga agcgcgtggg ttcaggaaac ctcg 414
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 14
gcacgctcct aaacctatcg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 15
cgacttgtcg aggaagatcc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 16
acgctaatcc gcttgttcat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 17
tcgcgtcact cgtgtaagtc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutieps ）
<400> 18
gatgacgagg acagtgacga 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 19
cctccttcct cctccatagc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 20
gaagctgatc cttggctttg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 21
ctagacacac cgcctcttcc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 22
tcttcggatg ctttggaatc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 23
tcgttctctt tgcacacgtc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 24
aagtcatcga cgagcctagc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 25
cgaacgaagg gaatgtctgt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 26
cgtcgttcaa ggtgtcgatg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 27
gaccggttgt ttgttccact 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 28
cccaacaccg gacatataca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 29
gttggttagg gatgtgacgc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 30
cgcttgtcca tgtcgttctc 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 31
tgctgactga tctgacaatg c 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 32
acaacttagc ggttggcttg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 金针菇（ Flammulina velutipes ）
<400> 33
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<211> 20
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Claims (1)
1.金针菇SSR分子标记和金针菇SSR引物在鉴别金针菇不同品种中的应用，所述的金针菇SSR分子标记为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中所示的SSR位点；所述的金针菇SSR引物为SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:39中所示的碱基序列。
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