CN107058508B - 一种丹参种质资源鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用基于丹参转录组序列开发SSR引物标记丹参种质资源的快速鉴定方法，主要包括以下步骤：（1）野外采集野生丹参样品，提取待测所有丹参群体基因组DNA，并检测提取质量；（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，用基于丹参转录组序列的SSR引物组合进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行测序分型和基因片段长度读取；（4）利用遗传学分析软件建立丹参的SSR遗传信息特征库和种质资源鉴定框架，并进行有效性验证。该方法能够对来自全国不同地区的野生丹参群体进行有效、快速的分类和鉴定，结果准确可靠，同时，该方法简便易行，且适用性高、可重复性强，可有效运用于丹参的种质资源鉴定。

Description

一种丹参种质资源鉴定方法
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及植物种质资源鉴定中SSR引物的开发和应用。通过转录组测序的方法，高效开发了40对特异性强、多态性高的SSR引物，以我国12个省份的野生丹参资源为材料，覆盖中药材丹参自然分布区与主产区，建立了我国野生丹参的SSR遗传信息特征库和丹参种质资源鉴定框架，提供了一种种质资源快速鉴定的方法。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为中国传统大宗药材之一，自然群体在我国广泛分布，为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，其药用部位为根或根茎，有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈等功效，其根部提取物有效成分为水溶性成分如酚酸类和脂溶性成分如丹参酮类成分，经临床试验表明，在治疗心血管疾病、肾功能衰竭、改善肝功能和预防脏器纤维化等方面有显著疗效。目前，市场上的丹参药材多为栽培品种，由于长期栽培，致使各栽培品种基因多样性降低，优良性状逐渐丧失，药材质量衰退。因此，亟需对野生丹参资源进行开发利用，这需要通过一种丹参种质资源的分子鉴定方法来评估全国各地产丹参的遗传资源状况，为丹参的分子育种奠定基础。同时，由于近年来市场对丹参药材的需求量持续增加，不法商贩出于经济利益，以次充好，导致伪品和劣质品横行，而且从形态上难以鉴别，亟需一种科学快速的种源鉴定方法来识别真伪。本发明通过对全国12个省份39个地区的野生丹参的采集，基于转录组数据批量开发了丹参SSR分子标记，通过建立野生丹参的SSR遗传信息特征库和种质资源鉴定框架，进行大量试验后，发明了一种丹参种质资源快速鉴定的方法，这将对丹参种质资源的真伪鉴别、道地性评价、标准化药材生产带来便利，也为丹参资源的合理开发利用奠定基础。
SSR分子标记作为一项方法成熟、操作快捷、结果可靠的技术，已广泛用于植物的种质资源鉴定。尽管目前已有利用SSR标记对丹参进行种质资源鉴定的案例(Xu etal.Biochemical Systematics and Ecology 51(2013)308–313；王学勇等，中国中药杂志，2011，36(3)：289-293)，但无论是SSR标记的来源，还是测试的丹参样品(栽培居群，且未覆盖丹参的分布区)，都不能包涵丹参较为全面的遗传信息，而且实验方案的通用性和资源鉴定的应用性方面存在缺陷。因此，需要开发一种高效鉴定丹参种质资源的方法。现有技术中虽然有针对丹参进行SSR标记进行开发的专利文献(CN101684481)，该文献利用公开数据库中的EST序列设计SSR引物，但样本量不足，分辨率低，不能够对任意种源进行准确的种质资源评价，本发明则利用实验测得转录组数据库设计开发丹参高分辨率SSR分子标记，在技术和实施上都具有一定优势，相比于传统的SSR分子标记开发方法，借助高通量测序技术批量开发SSR引物，可以获得覆盖面更广、遗传多样性更高的位点，可更高效地鉴定物种种质资源。本发明还利用大量实验样本(37个居群，222份植物材料)，获得我国12个省份所产丹参群体丰富的遗传多样性信息，建立丹参种质资源遗传特征信息库和种质资源鉴定框架，可对任意丹参材料进行种质资源鉴定，准确率高。该方法技术成熟、实施流程便捷且鉴定效果明显，将为后续丹参植物资源的科学利用和开发提供基础和便利。
参考文献：
Xu,G.,Liu,C.,Huang,L.,Wang,X.,Zhang,Y.,Liu,S.,Liao,C.,Yuan,Q.,Zhou,X.,2013.Development of new EST-derived SSRs in Salvia miltiorrhiza(Labiatae)in China and preliminary analysis of genetic diversity and populationstructure.Biochem.Syst.Ecol.51,308–313.
王学勇,周晓丽,高伟,崔光红,黄璐琦,刘春生,2011.丹参新的EST-SSR分布规律及分子标记的建立.中国中药杂志,289–293.
张勇,邓科君,熊丙全,彭金华,赵晓楠,任正隆,2010,CN101684481,丹参EST-SSR分子标记的制备方法、特异引物及其应用.
CN 101684481 A
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种利用SSR标记鉴定丹参种质资源的方法。
具体技术方案如下：
一种丹参种质资源鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)通过对全国12个省份的野生丹参样品进行采样，覆盖丹参的自然分布区和主要种植区提取待测样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，用基于丹参转录组序列的SSR引物组合进行PCR扩增，得到不同长度的扩增产物；
(3)对步骤(2)所得不同长度的扩增产物进行测序，通过GENEIOUS 9.0.2软件进行等位基因的读取，形成等位基因矩阵；
(4)对步骤(3)所得到的等位基因矩阵利用CERVUS 3.0软件计算等位基因数(A)、观察与期望杂合度(Ho、He)、多态性信息量(PIC)；
(5)对步骤(3)所得到的等位基因矩阵利用GenAlEx 6.5软件进行SSR引物(位点)基于不同群体的等位基因的统计和列举，形成丹参种质资源SSR遗传信息特征库，并选取随机样本进行验证；
(6)对步骤(3)所得到的等位基因矩阵利用GenAlEx 6.5软件生成遗传距离矩阵，并通过MEGA 6软件进行遗传距离聚类分析，构建UPGMA树，建立丹参种质资源鉴定框架；
(7)随机盲选20份丹参样本，利用相同40对SSR引物PCR扩增，得到等位基因数据，加入到上述构建丹参种质资源鉴定的等位基因矩阵中，通过遗传距离聚类分析评估与鉴定20份样本种质资源状况与来源。
其中，步骤(2)所述引物组合包括下述40对SSR引物，每对引物的核苷酸序列分别为SEQ NO.1-SEQ NO.2、SEQ NO.3-SEQ NO.4、SEQ NO.5-SEQ NO.6、SEQ NO.7-SEQ NO.8、SEQNO.9-SEQ NO.10、SEQ NO.11-SEQ NO.12、SEQ NO.13-SEQ NO.14、SEQ NO.15-SEQ NO.16、SEQ NO.17-SEQ NO.18、SEQ NO.19-SEQ NO.20、SEQ NO.21-SEQ NO.22、SEQ NO.23-SEQNO.24、SEQ NO.25-SEQ NO.26、SEQ NO.27-SEQ NO.28、SEQ NO.29-SEQ NO.30、SEQ NO.31-SEQ NO.32、SEQ NO.33-SEQ NO.34、SEQ NO.35-SEQ NO.36、SEQ NO.37-SEQ NO.38、SEQNO.39-SEQ NO.40、SEQ NO.41-SEQ NO.42、SEQ NO.43-SEQ NO.44、SEQ NO.45-SEQ NO.46、SEQ NO.47-SEQ NO.48、SEQ NO.49-SEQ NO.50、SEQ NO.51-SEQ NO.52、SEQ NO.53-SEQNO.54、SEQ NO.55-SEQ NO.56、SEQ NO.57-SEQ NO.58、SEQ NO.59-SEQ NO.60、SEQ NO.61-SEQ NO.62、SEQ NO.63-SEQ NO.64、SEQ NO.65-SEQ NO.66、SEQ NO.67-SEQ NO.68、SEQNO.69-SEQ NO.70、SEQ NO.71-SEQ NO.72、SEQ NO.73-SEQ NO.74、SEQ NO.75-SEQ NO.76、SEQ NO.77-SEQ NO.78、SEQ NO.79-SEQ NO.80，其中所述引物编号为奇数的核苷酸序列为5’端带有荧光标记信号的上游引物，引物编号为偶数的核苷酸序列为下游引物；
其中，步骤(2)中所述基于转录组序列的SSR引物组合是由以下方法筛选得到：搜索转录组数据中的SSR位点，针对SSR位点设计、开发并且合成目标引物，对所合成的引物进行最适退火温度的筛选和通用性检测，对筛选得到的引物进行PCR扩增，再对扩增产物通过毛细管电泳与GENEIOUS 9.0.2软件进行等位基因的读取，确定用于丹参种质资源鉴定的引物组合。
其中，SSR位点的搜索限制条件为：单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复单元的SSR区域，筛选相应重复次数至少为10次、6次、5次、4次、3次、3次，若两个相邻SSR之间的碱基距离少于100bp则视为复合型SSR。
在实施例中，设计目标引物的参数为：物长度18-27bp，退火温度(Tm)50-65℃，GC含量为50％-60％，产物长度50-500bp。
本发明的发明人通过大量的创造性试验，开发出一套利用基于转录组的SSR标记鉴定丹参种质资源的数据库与方法，为后续丹参植物资源合理开发利用奠定基础。
本发明提供的利用SSR标记鉴定丹参种质资源的方法，结果准确、可靠；可直接以植物新鲜组织或干燥组织为检测样品，快捷方便；通过遗传聚类分析进行判断，结果较为直观。本发明的方法鉴定易行、适用于丹参种质资源鉴定。
一般性定义
术语“SSR”即简单重复序列，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，其广泛且均匀分布于真核生物染色体中，因其重复单元的数目存在高度变异，且SSR的侧翼序列相对保守，是一种理想的分子标记技术。
术语“转录组”是指在某一生理条件下，某一组织细胞内所有转录产物的集合，对于同一个体，其不同生长时期、不同组织部位的转录组往往是不同的。
术语“引物”是指一小段单链的核苷酸序列，与目标片段侧翼互补，用于PCR扩增时作为多核苷酸延伸的出发点。
术语“测序分型”是指通过测序仪，借助产物中的荧光信号来读取一对等位基因的碱基长度。
术语“基因矩阵”是指个体相对于SSR引物(位点)的等位基因长度的阵列集合，用于遗传参数的计算。
术语“种质资源”又称遗传资源，是指亲代传递给子代的遗传信息，对于同一物种来讲，由于不同的生态环境影响，在长期的演化进程中，来自不同地理分布的该物种在相应的基因座上存在遗传差异，通过分子标记技术能够检测到该差异，并对不同来源个体进行鉴定。
术语“种质资源鉴定框架”是指由MEGA6软件生成的基于测试野生丹参样本的基因矩阵的UPGMA遗传聚类树，用于后续样本的种质资源鉴定。
附图说明
图1为丹参种质资源鉴定框架(分支末端字母为群体编号，数字为个体代号)；
图2为20份丹参样本鉴定的UPGMA树(方框标注分支个体为验证样本)。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。实验中所用到的丹参材料如下：
(1)本发明的发明人通过数年艰辛的野外调查工作，获得了全国12个省份37个群体的野生丹参的资源，用于构建丹参种质资源鉴定框架的丹参样本：共37个群体，每个群体6个个体，总计222份植物材料，具体样品信息见表1。
表1.丹参样本信息一览
Figure GDA0001291688370000051
Figure GDA0001291688370000061
(2)用于验证的丹参样本：在上述样本之外随机盲选20份丹参样本。
实施例1.构建丹参转录组数据库
(1)使用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN，BEIJING)试剂盒进行丹参新鲜叶片总RNA提取，送测序公司进行高通量转录组测序。
(2)利用GENEIOUS 9.0.2的De novo assembly功能将短读长序列拼接成转录组框架数据，取每条基因中最长的转录本作为Unigene，建立能够进行微卫星位点检索的转录组数据库。
实施例2.微卫星SSR引物的开发
(1)利用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)程序包对上述Unigene中不同类型的微卫星位点进行扫描、识别、定位；参数设置：识别单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基重复单元的SSR区域，筛选相应重复次数至少为10次、6次、5次、4次、3次、3次，且两个相邻SSR之间的碱基距离至少为100bp以上；
(2)将*.fasta、misa.pl和misa.ini都复制到同一文件夹目录下，在Perl环境下运行命令>mias.pl*.fasta，运行后得到*.fasta.misa和*.fasta.statistics两个文件，其中*.fasta.misa用于后续的引物设计。
(3)利用网页版BatchPrimer 3设计SSR引物，设置参数：引物长度18-27bp，退火温度(Tm)55-65℃，产物长度50-500bp；根据*.fasta.statistics和*.fasta.misa显示的SSR不同类型Motif和比例,随机抽取共计149对序列进行设计引物。
(4)模拟PCR，利用FastPCR 6.5进行引物模拟筛选，将100％匹配的引物序列保存，共计获得83对引物，合成备用。
实施例3.基因组DNA提取
使用DNA PlantZol试剂，采取改良的CTAB法，提取上述222份丹参材料的基因组DNA，用NanoDrop 2000定量后，稀释到20ng/μl，4℃或-20℃保存待用。
实施例4.SSR引物筛选和通用性检测
(1)以上述丹参样本中群体编号为NB的一个个体DNA为模板，对合成的SSR引物进行最适退火温度的筛选。
PCR反应体系为：模板DNA 20ng，上下游引物(10μM)各1μL，2×Master Mix(杭州擎科，下同)10μL，反应体积为20μL，用ddH2O补足体积。
PCR反应为：94℃预变性5min，紧接着35个循环的94℃变性45s，50-65℃(温度梯度)退火45s，72℃延伸1min，最后保持72℃延伸5min。产物用2％的琼脂糖进行电泳检测，挑选有扩增条带并且在50-500bp有单一条带的引物，确定该引物扩增条带最亮时的退火温度为其最适退火温度。
(2)从上述丹参样本中，选取12个地理距离较远的群体，每个群体挑选一个个体，共12个个体，对上述步骤中筛选到的SSR引物进行通用性检测。
PCR反应体系为：模板DNA 20ng，上下游引物各(10μM)各1μL，2×Master Mix10μL，反应体积为20μL，用ddH2O补足体积。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，紧接着35个循环的94℃变性30s，Tm退火30s，72℃延伸30s，最后保持72℃延伸5min。产物用2％的琼脂糖进行电泳检测，挑选至少在75％的个体中都有单一明亮条带的引物，作为丹参种质资源鉴定的候选引物。
(3)综合以上2步，从合成的83对SSR引物中筛选得到51对候选SSR引物。
实施例5.SSR引物多态性验证
在表1群体中，根据距离远近挑选8个群体，每个群体1份丹参样本DNA为模板，PCR反应体系为：模板DNA 20ng，上下游引物各(10μM)各1μL，2×Master Mix 10μL，反应体积为20μL，用ddH2O补足体积。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，紧接着35个循环的94℃变性30s，Tm退火30s，72℃延伸30s，最后保持72℃延伸5min。产物用2％的琼脂糖进行电泳检测，得到带有荧光信号的PCR扩增产物，进行毛细管电泳测序，得到共计40对具有多态性的引物。
实施例6.SSR引物的群体扩增
以全部222份丹参样本DNA为模板，PCR反应体系为：模板DNA 20ng，上下游引物各(10μM)各1μL，2×Master Mix 10μL，反应体积为20μL，用ddH2O补足体积。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，紧接着35个循环的94℃变性30s，Tm退火30s，72℃延伸30s，最后保持72℃延伸5min。产物用2％的琼脂糖进行电泳检测，得到带有荧光信号的PCR扩增产物。
实施例7.丹参种质资源鉴定框架和SSR遗传信息特征库的构建
(1)按照不同长度和不同荧光的PCR反应产物等比例混合，用3730xlDNA序仪(ABI，USA)进行毛细管电泳，用GENEIOUS软件进行等位基因分型的判别和读取，形成等位基因矩阵。选择峰型较好，峰高大于200，且条带长度较好的，在所设计引物的扩增产物大小区间的作为有效引物。
(2)将上述步骤得到的等位基因矩阵利用CERVUS 3.0软件计算等位基因数(A)、观察与期望杂合度(Ho、He)、多态性信息量(PIC)，见表2。选择多态性信息量(PIC)大于0.2的引物用于丹参种质资源鉴定框架和SSR遗传信息特征库的构架，每对引物由上游引物和下游引物组成，见表3。
表2.基于丹参转录组40对SSR引物的最适退火温度及遗传参数
Figure GDA0001291688370000081
Figure GDA0001291688370000091
表3.基于丹参转录组开发的40对SSR引物
Figure GDA0001291688370000092
Figure GDA0001291688370000101
Figure GDA0001291688370000111
C*为复合SSR引物，SSR为:(CT)8AGATGTATATATAGTTGTTCGTTTCTTTGGGAATTTCCTCAAATCTTCCAATCAATTCCTCCCC(CAATT)3。
(3)利用GenAlEx 6.5软件对等位基因矩阵进行SSR引物(位点)基于不同群体的等位基因片段长度的统计和列举，形成37个野生丹参群体的种质资源SSR遗传信息特征鉴定库，详细见表4-1、表4-2。
(4)利用GenAlEx 6.5软件对等位基因矩阵生成遗传距离矩阵，并通过MEGA 6软件进行遗传距离聚类分析，构建UPGMA树，建立丹参种质资源鉴定框架，见附图1。
附图1清晰地展示了222个不同丹参样本的遗传聚类关系，SA与SY来在陕西安康野生和移植群体，聚类到一起；EP、EL为山东临沂不同野生群体，EY为山东临沂移植群体，EZ为山东临沂种植群体，聚类到一起；不同地理分布的群体支系能够清晰地分辨，丹参种质资源遗传距离鉴定框架可靠。
Figure GDA0001291688370000121
Figure GDA0001291688370000131
Figure GDA0001291688370000141
Figure GDA0001291688370000151
Figure GDA0001291688370000161
Figure GDA0001291688370000171
Figure GDA0001291688370000181
Figure GDA0001291688370000191
Figure GDA0001291688370000201
Figure GDA0001291688370000211
Figure GDA0001291688370000221
Figure GDA0001291688370000231
Figure GDA0001291688370000241
Figure GDA0001291688370000251
Figure GDA0001291688370000261
Figure GDA0001291688370000271
Figure GDA0001291688370000281
Figure GDA0001291688370000291
实施例8.丹参种质资源鉴定的验证
(1)通过SSR遗传信息特征库进行鉴定
随机盲选丹参样本20份(除去构建丹参种质资源鉴定框架的个体)，用40对SSR引物按照步骤5和步骤6进行等位基因分型(见表5)，并与所有等位基因库进行比对，比对结果见表6。
经过鉴定效果统计，20份样本中，17份能够完全鉴定到其真实群体，1份能鉴定到相同城市群体中亦视为成功，成功率达90％，说明本发明基于丹参转录组开发的40对SSR引物所构建的等位基因数据库能够基本确定丹参样本的来源。
(2)对上述的20份丹参样本，分别标记为X-1～X-20，按照步骤3提取基因组DNA，按照步骤5的PCR过程进行产物扩增，用GENEIOUS软件进行等位基因分型的判别和读取，将等位基因矩阵加入到步骤6中的丹参种质资源鉴定框架中，利用MEGA 6软件进行聚类，构建UPGMA树(见附图2)，分析鉴定效果见表7。
经过鉴定效果统计，20份样本中，14份样本能够完全鉴定到其真实群体，山东青岛采集的X-11个体聚类到下级支山东临沂群体视为检测成功，浙江杭州X-13个体聚类到相同城市另一ZQ群体，亦视为成功，成功率为80％，另外6份样本也未远离其真实群体，其遗传距离聚类与其真实群体靠近，说明本发明基于丹参转录组开发的40对SSR引物能够有效确定未知样本的丹参种质资源来源。
综上所述，通过以上两种鉴定方法联合分析，可以将鉴定成功率提高至90％，同时未能确定具体群体来源的样本也被鉴定到与其真实群体地理相邻的群体。说明本发明基于丹参转录组开发的40对SSR引物组合、SSR遗传信息特征库、种质资源鉴定框架及两种鉴定方式能够有效确定丹参样本的种质资源来源，并能有效应用于未知样本的鉴定，同时本发明的方法快捷，结果准确、可靠，可为将来丹参的种质资源鉴定带来便利。
Figure GDA0001291688370000311
Figure GDA0001291688370000321
Figure GDA0001291688370000331
Figure GDA0001291688370000341
表6.验证样本信息及验证效果统计表
Figure GDA0001291688370000351
表7.验证样本信息及验证效果统计表
Figure GDA0001291688370000352
Figure GDA0001291688370000361
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GTTTCTGCTACTGGAGTTGG
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
GGGCGAGATCTACCATTT
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
AGCACAAGGGTTGTCTGA
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GAACTAAGGCTTGCTCCAC
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
CTAATGTGTCCAAACCACCT
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
TACGGGATGTTTGTTTCTCC
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
GGTTGCAGTGCCATATAGTT
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
GTCGTCTCCCATCAACTTC
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
CAGAGGGAGAAAGGAGAAAT
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
GTATGAGCCCAAGTTCAATC
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
GTCAGTGTTCAGACATCCTATG
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
AACTGAGCCATCAACATCTC
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
CCTCACCTCTCCACTTATACA
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
GAAACTCAGTCTTGGTTTGG
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ACGCAAACGTCTCCTTATC
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
GTGGAGCTCAGGAATAAGTG
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
AAAGATCAGCCACGTATCAC
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ATTATGCTGCACCGATCTAC
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
GCTCGACCATATGTTGTATG
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
CTCAGCTCTTCTGCTAAGACA
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
CTGGAACCAAGTACACCATT
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
GCCACTGTATTATTGGGAGA
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
CCCTGAGATCAAAGGTTTC
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ACCGTTGACATAGTTTCTGC
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ACCCAAGCCCAATACTTC
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
AGAAGAGGAGAGGGAGCA
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
GAGAGTATCGCAAACGAGTC
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
CATGCATTCTTCACACAGAC
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
GTCACCACCACCATCTCA
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
GCCTTGAAGCACAAAAACT
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
GGTGTCTCGTTTTCTGAGAG
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
CACTTAGTCGATGAGATGCAC
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
GAATAGCTGGTCGACTATGG
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ATCTCGAGAGGGCTTCAG
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
TACGACAAGCAAGACTACAGC
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ATTACCCAAGCCTCCAAG
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
GCATAGATGAGAGCAAGGTT
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
TGAGAGAGATCATGCAACAC
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
CATATCTAAGGCCAAGCTGT
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
TGCAGCTGAACTCGTACTC
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
TGCACCTCCAGCTCTTAG
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ACTCCCTACAGAGAAACCAAC
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
CTCCGTCTGAACCAGATAGAT
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
GGAAGATAAAGCCTTGGAAC
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
GGGATCATGATAGGAGTAACC
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
GACTAGAACGACTTTGGTCCT
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
GTGATAACGACCAAAGAGGT
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
GCTCTCTCTCGCATCCTTAT
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
GCTGCAGTGGAAGAATATGT
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
TCCATTCCAACTCATCTCTG
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
GTCAACAGTCTCAAGATGAGG
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
CAACGAGGTATGGTACACG
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
CGTCTAGAAACTTCCACCTCT
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
GCTTCTGAAGAAACAAGACG
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
GATCGTATTGGAGCTGTGTT
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
GAAGGTGTCTTTCTGCCATA
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
CTAGGAGATCTAGTGGGCATA
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
GGCGCTCCTTACAATATTTC
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
CTTGTCATTCTCTCTCCTCCT
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
TATATGCAACGACGCTCTAC
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
GAATAACGGCTCGAGAGATAG
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
GTTGTTCTTAGCGGAGGAG
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
ATTCCCTCATTTCCATTCTC
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
AGCAGGTGATCTTGAAATTG
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
CTCTGCTTCTTCTTCTTCCTC
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
CAGTGACACCTGCACAATTA
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
GTCCAGGAATACGTCACTTG
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
AGTAGCTGTCGCTGAACG
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
CGATGCATTCCTCTTCTACT
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
TAGACCTAGCCTGCCTCAG
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
GCTGGAAACCTCTCTGTCTAC
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
CGGGAAACTGCTGATTTG
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
GAAAGTGACCGGTGGTATT
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
AACTAACTCAAACCCGTGAC
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
ACTGATACTCGTGCTAAGCTG
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
TTGTGTCCGAGTACCTCTCTA
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
CAGATTCTTCTCCACCAAAG
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
CTCCTCACCTTGGAGCAT
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
GGTAAACTGCCCACAACTT
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
TCCCTAAACAAGAGAGAGAGC

Claims (5)

1.一种丹参种质资源鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：提取待测丹参群体基因组DNA，并检测提取质量；
步骤2)：以步骤1)提取的DNA为模板，用基于丹参转录组序列的SSR引物组合进行PCR扩增得到不同长度的扩增产物；
步骤3)：对步骤2)所得不同长度的扩增产物进行测序分型和基因片段长度读取；
步骤4)：对步骤3)所得的等位基因矩阵通过GENEIOUS 9.0.2、GenAlEx 6.5、CERVUS3.0和MEGA 6软件进行遗传学相关分析，建立丹参种质资源鉴定框架和丹参种质资源SSR遗传信息特征库；
步骤5)：对步骤4)的丹参种质资源鉴定框架和SSR遗传信息特征库进行有效性验证；其中步骤2)所述的SSR引物由上游引物和下游引物组成，每对引物的核苷酸序列为：SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19-SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.25-SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.31-SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35-SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.37-SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39-SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43-SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47-SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.49-SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53-SEQ ID NO.54、SEQ IDNO.55-SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57-SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59-SEQ ID NO.60、SEQ IDNO.61-SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63-SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65-SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.67-SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69-SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.72、SEQ IDNO.73-SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75-SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77-SEQ ID NO.78、SEQ IDNO.79-SEQ ID NO.80，其中所述引物编号为奇数的核苷酸序列为带有荧光信号标记的上游引物，引物编号为偶数的核苷酸序列为下游引物。
2.根据权利要求1所述的丹参种质资源鉴定的方法，其特征在于，步骤4)所述的丹参种质资源鉴定框架和丹参种质资源SSR遗传信息特征库分别是丹参样本基于40对SSR引物的遗传距离UPGMA聚类树和40对SSR引物基于不同种质来源的丹参群体SSR等位基因的特征长度集合。
3.一种基于丹参转录组序列的SSR引物组合，其特征在于，所述引物组合由下述40对引物组成，每对引物由上游引物和下游引物组成，每对引物的核酸序列为：SEQ ID NO.1-SEQID NO.2、SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7-SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13-SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19-SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25-SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31-SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35-SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37-SEQ IDNO.38、SEQ ID NO.39-SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43-SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47-SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49-SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53-SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55-SEQ IDNO.56、SEQ ID NO.57-SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59-SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61-SEQ IDNO.62、SEQ ID NO.63-SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65-SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67-SEQ IDNO.68、SEQ ID NO.69-SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73-SEQ IDNO.74、SEQ ID NO.75-SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77-SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79-SEQ IDNO.80，其中奇数引物为带有荧光标记信号的上游引物，偶数序列为下游引物。
4.根据权利要求3所述的基于丹参转录组序列的SSR引物组合在丹参种质资源鉴定中的应用。
5.丹参种质资源鉴定框架和丹参种质资源SSR遗传信息特征库在丹参种质资源鉴定中的应用，该丹参种质资源鉴定框架和丹参-种质资源SSR遗传信息特征库分别是丹参样本基于权利要求3所述40对SSR引物的遗传距离UPGMA聚类树和权利要求3所述40对SSR引物基于不同种质来源的丹参群体SSR等位基因特征长度集合。
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