CN105316329A - 金针菇ssr分子标记及其对应引物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供金针菇SSR分子标记及其对应引物与应用，金针菇SSR分子标记为序列表中SEQIDNO:1至SEQIDNO:13中的任意一个SSR位点；金针菇SSR分子标记位点两端的侧翼序列上开发的金针菇SSR引物具有序列表中SEQIDNO:14至SEQIDNO:39中所示的碱基序列。在已有金针菇基因组的基础上利用生物信息学方法对其基因组SSR位点进行检测并开发引物，利用不同金针菇菌株对这些SSR位点进行筛选后得到13对多态性较高的SSR分子标记，上述SSR分子标记可用于金针菇的种质资源鉴定、保护及品种选育。

Description

金针菇SSR分子标记及其对应引物与应用

技术领域：

本发明属于分子生物学DNA分子标记技术领域，具体涉及对金针菇不同菌株进行鉴定的SSR标记方法，金针菇SSR分子标记及其对应引物序列的开发与应用。

背景技术：

金针菇Flammulinavelutipes隶属于膨瑚菌科Physalacriaceae冬菇属Flammulina，是我国主要栽培食用菌种类之一，2012年我国金针菇年产量240万吨，居世界第一位。然而，目前我国金针菇产业大而不强，菌种问题成为金针菇产业发展的瓶颈，具体表现为：在实际生产过程中常出现各单位引种途径不一，引种后各自取名、各自编号，出现很多同物异名现象。不合理的引种、育种往往造成品种质量低劣，损害菇农利益，侵犯品种权(张金霞等，2004；冯作山，2010)。为规范菌种开发和保护，开发一套快速有效的鉴别金针菇不同品种的方法已成为当务之急。

目前，基于DNA序列的分子标记方法是DNA水平遗传多态性的直接反应，能有效对近缘种或种下不同个体进行准确鉴别(Freeland，2005)。相较于其它分子标记方法，SSR分子标记具有广泛分布于基因组的编码区及非编码区、共显性、多态性高、稳定性好、易于扩增等优点。随着越来越多的物种的基因组被测序，基于基因组序列，运用生物信息学的方法从基因组中直接开发SSR标记克服了基于实验手段开发SSR标记费时费力的缺点，该方法成为目前开发SSR标记的主流方法。因此，利用已有的金针菇基因组数据开发高分辨率的SSR标记对金针菇种质资源鉴定、保护及品种选育具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种对金针菇不同菌株进行准确鉴定的SSR标记方法，该方法为金针菇的种质资源鉴定、保护及品种选育提供有力工具。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

金针菇SSR分子标记，其为序列表中SEQIDNO:1至SEQIDNO:13中的任意一个SSR位点。

在所述的金针菇SSR分子标记位点两端的侧翼序列上的金针菇SSR引物，其具有序列表中SEQIDNO:14至SEQIDNO:39中所示的碱基序列。

如所述的金针菇SSR分子标记，其中所述金针菇SSR分子标记13个SSR位点在55个金针菇样品中的等位基因数Na为2-8个，平均4.2个，香浓多样性指数I平均值为0.821，观测杂合度Ho平均值为0.401，期望杂合度He平均值为0.455，多态性信息含量PIC平均值为0.426，13个SSR位点在金针菇样本中具有较高的多态性。

如所述的金针菇SSR分子标记和金针菇SSR引物，其中所述的金针菇SSR分子标记及对应SSR引物的的核苷酸序列如表1，

表1SSR位点及引物序列

所述的金针菇SSR分子标记的开发方法，包括下述步骤：用生物信息学方法检测金针菇基因组序列中的SSR序列，选取部分SSR序列进行引物开发，运用不同金针菇菌株进行SSR位点的筛选，最终筛选出13对多态性较高的SSR分子标记，上述SSR标记及对应引物的核苷酸序列如表1。

本发明还提供了所述的金针菇SSR分子标记和金针菇SSR引物在鉴别金针菇不同品种中的应用。

所述应用是利用现有的金针菇基因组序列，用生物信息学方法检测其中的SSR位点，选取部分SSR位点进行引物开发，用不同种类金针菇菌株进行SSR位点筛选出多态性较高的SSR分子标记，通过运用不同SSR位点的荧光引物对不同种类的金针菇菌株的DNA进行PCR扩增，然后将PCR产物运用ABI3730设备进行毛细管电泳，使用Genemapper软件分析SSR数据，通过对SSR数据比对鉴定出不同种类的金针菇菌株。

对金针菇不同菌株进行鉴定的SSR标记及引物开发的方法，该方法包括下述步骤：运用软件MISA和Primer3设计金针菇基因组SSR位点及其引物，运用改良的CTAB法提取金针菇DNA，将所设计的SSR引物对金针菇DNA进行PCR扩增、检测。

如所述的对金针菇不同菌株进行鉴定的SSR标记方法，该方法具体包括下述步骤：

所述的金针菇基因组SSR位点开发及引物设计是从NCBI上下载金针菇基因组数据，运用软件MISA对其基因组SSR位点进行检测，运用软件Primer3对被检测到的SSR位点在其上游及下游200bp范围内进行引物开发，引物开发条件为：引物长度在18bp-23bp之间，引物TM值在57-62之间，GC含量在30％-70％之间。

所述的金针菇基因组提取及检测中总DNA提取用改进的CTAB法：

(1)用接种刀刮取培养皿中的菌丝，放于2ml离心管中，加入少量石英砂、PVP和350μl在65℃下预热的4×CTAB提取液，提取液内含0.2％的β-巯基乙醇，研磨，菌丝磨匀后，再加入上述4×CTAB提取液400μl振荡混匀，在65℃水浴锅中温浴2～4h，30min摇匀一次；

(2)将温浴材料取出置于室温下，待其冷却到室温后加入750μl24︰1氯仿-异戊醇，摇匀，12000r/min下离心10min；

(3)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，摇匀，12000r/min下离心10min；

(4)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入80％体积的异丙醇，预冷至-20℃，充分混匀，于-20℃冰箱中放置1～2h；

(5)自冰箱中取出，恢复到室温后，12000r/min下离心15min，弃上清液；

(6)用500μl的70％的乙醇和无水乙醇各冲洗1～2次，每次12000r/min室温离心1min后弃上清液，然后将离心管置于37℃恒温箱中约20～30min，使乙醇充分挥发，或者开盖使其自然干燥，干燥后加入灭菌的蒸馏水；

(7)用核酸浓度检测仪检测DNA浓度，将浓度调节至100ng/μl，置于-20℃保存；

所述的SSR位点的PCR扩增检测是从上述筛选到的SSR位点中随机选取124个位点对8个不同来源的金针菇菌株进行初步筛选，检测扩增条带的有无，PCR反应体系为：100ng/μl的DNA模板1μl，25mg/mlBSA1μl，10×PCRBuffer2.5μl，dNTP10mm0.5μl，正向引物5um1μl，反向引物5um1μl，Taq酶0.3μl，ddH₂015.7μl，PCR反应条件为：94℃：4min，(94℃30s，55℃30s，72℃30s)×35cycles，72℃8min，PCR产物点样于1％浓度的琼脂糖胶中，放入1×TAE缓冲液中进行电泳检测，经检测有109对引物在8个金针菇菌株中扩增出清晰明亮的条带，从中选取13对引物进行荧光引物合成，后将13对荧光引物及55个金针菇菌株DNA样品进行荧光引物扩增，并用ABI3730xl设备检测扩增产物，使用Genemapper软件分析、记录SSR数据；

所述的SSR位点遗传多样性信息计算是将获得的SSR数据运用PopGene32和PIC_CALC软件进行各位点的遗传多样性指标及多态性信息含量计算，结果如表2，13个SSR位点在55个金针菇样品中的等位基因数Na为2-8个，平均4.2个，香浓多样性指数I平均值为0.821，观测杂合度Ho平均值为0.401，期望杂合度He平均值为0.455，多态性信息含量PIC平均值为0.426，结果表明13个SSR位点在金针菇样本中具有较高的多态性；用软件NTsys2.10e构建样品间的UPGMA树，结果如图1，13个SSR位点将55个金针菇菌株区分开，

表213个微卫星位点的遗传多样性信息

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明利用现有的金针菇基因组序列，运用生物信息学方法检测其中的SSR序列，选取部分SSR序列进行引物开发，运用来自全国不同科研单位及公司的不同金针菇菌株进行SSR位点的筛选，最终筛选出13对多态性较高的SSR分子标记。提供了一种对金针菇不同菌株进行准确鉴定的SSR标记方法，开发出金针菇SSR分子标记，为金针菇的种质资源鉴定、保护及品种选育提供有力工具。

附图说明：

图1为基于13个SSR位点对55个金针菇菌株构建的UPGMA树。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

本发明的序列表中1-13为金针菇基因组SSR位点SSR2、SSR7、SSR15、SSR21、SSR22、SSR23、SSR32、SSR45、SSR87、SSR95、SSR107、SSR124、SSR133的核苷酸序列(分别为SEQIDNO:1-SEQIDNO:13；

序列表中14-40为金针菇基因组SSR位点的引物SSR2-F、SSR2-R、SSR7-F、SSR7-R、SSR15-F、SSR15-R、SSR21-F、SSR21-R、SSR22-F、SSR22-R、SSR23-F、SSR23-R、SSR32-F、SSR32-R、SSR45-F、SSR45-R、SSR87-F、SSR87-R、SSR95-F、SSR95-R、SSR107-F、SSR107-R、SSR124-F、SSR124-R、SSR133-F、SSR133-R的核苷酸序列(分别为SEQIDNO:14-SEQIDNO:39)。

1.金针菇基因组SSR位点及引物开发：

从NCBI上下载金针菇基因组数据，运用软件MISA对其基因组SSR位点进行检测，运用软件Primer3对被检测到的SSR位点在其上游及下游200bp范围内进行引物开发，引物开发条件为：引物长度在18bp-23b之间，引物TM值在57-62之间，GC含量在30％-70％之间。

2.金针菇基因组提取及检测：

总DNA提取采用改进的CTAB法，具体操作步骤如下：

(1)用接种刀刮取培养皿中的菌丝，放于2ml离心管中，加入少量石英砂、PVP和350μl在65℃下预热的4×CTAB提取液(内含0.2％的β-巯基乙醇)研磨，菌丝磨匀后，再加入上述4×CTAB提取液400μl振荡混匀，在65℃水浴锅中温浴2～4h(30min摇匀一次)；

(2)将温浴材料取出置于室温下，待其冷却到室温后加入750μl氯仿-异戊醇(24︰1)，摇匀，12000r/min下离心10min；

(3)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，摇匀，12000r/min下离心10min；

(4)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入80％体积的异丙醇(预冷至-20℃)，充分混匀，于-20℃冰箱中放置1～2h；

(5)自冰箱中取出，恢复到室温后，12000r/min下离心15min，弃上清液；

(6)用500μl的70％的乙醇和无水乙醇各冲洗1～2次，每次12000r/min室温离心1min后弃上清液，然后将离心管置于37℃恒温箱中约20～30min，使乙醇充分挥发(也可以开盖使其自然干燥)。干燥后加入灭菌的蒸馏水。

(7)用核酸浓度检测仪检测DNA浓度，将浓度调节至100ng/μl，置于-20℃保存。

3.SSR位点的PCR扩增检测：

从上述筛选到的SSR位点中随机选取124个位点对8个不同来源的金针菇菌株进行初步筛选，检测扩增条带的有无。PCR反应体系为：100ng/μl的DNA模板1μl，25mg/mlBSA1μl，10×PCRBuffer2.5μl，dNTP(10mm)0.5μl，正向引物(5um)1μl，反向引物(5um)1μl，Taq酶0.3μl，ddH₂015.7μl。PCR反应条件为：94℃：4min，(94℃30s，55℃30s，72℃30s)×35cycles，72℃8min。PCR产物点样于1％浓度的琼脂糖胶中，放入1×TAE缓冲液中进行电泳检测。经检测发现有109对引物可在8个金针菇菌株中扩增出清晰明亮的条带，从中选取13对引物进行荧光引物合成，后将13对荧光引物及55个金针菇菌株DNA样品送至昆明硕擎生物科技有限公司进行荧光引物扩增，并用ABI3730xl设备检测扩增产物，使用Genemapper软件分析、记录SSR数据。

所述的SSR标记及对应引物的核苷酸序列如下：

SSR2，由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列组成：

CATGTTCTCCTCCGTCGTCGACGTTCATCAAGGAGTTGGTGCACGCTCCTAAACCTATCGTCGAACATGAGCCCGTTTGTTCTTCTCAGGCGTCTACGTCCATCGCCGAGCTGCACGCTCCTAAAACCGTGGTCGAGCCCGAGGTCAACCTTGACTTCTGCATGAACTGGTTCCAGGACAAAGAATACGAAGACGAGGACGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAGTTCGACGACGACGCCACCCTGCGCTGGATCCCCGCTGAATGGCAACAACCAGCTCACGAGCATGTCCTTCCTCGCATGGATCTTCCTCGACAAGTCGCAGTTCACAGCGTCGTCATCAAGAACGCTCCAGTAGTCCCGGAATATACAGCCCTCCCGTCCCCCCCTTCACCATCACCTTTGCCCGTTCCTTCGCCACA

SSR7，由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列组成：

AAACGGAGAGTATTTTGAGCGCCTTGGTATATGGGTGGTAAGTAGCCTAGTTCCAGCCATAGGTACGCTAATCCGCTTGTTCATGTATGGTAGCGCGCTTCCCGAAGATTTTGTCGAGAAACGATTCCACCTTTCCTTTGTCTCCCGCATCCTCGTCAGATGAAAATAATTCGGAGCCACCGCCACCTCCCTTACCACGACCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCTACCCTTTGGTTCCGGTGCCTGTGAAATATGAATCAACCTGCGATGAGCATGAGGGCTCGGACATATATTGACTTACACGAGTGACGCGAAGTGGCGAACCCATAACGAGGGAGACGCTAGCGCCCAAAAGCATGAAATACAGAGTCGATGTTCGCATCCTTGTTATAGTTAATCGACCAGCGATATAGACGATGCAGA

SSR15，由SEQIDNO:3所示的核苷酸序列组成：

ATCTTTGCTAGTGATGACGAGGACAGTGACGACGAGGGGGCGACTGAATCTAAGAAGGACGAGATGGACGTCGACGAACCCCCACTAGAAAAGCCGAAGCCGATCTTCCCGGATGAACCTGTTGATATCAACACATTCAAACCGACCTTCATACCGCGCGAAGGAAAGGCGAAGGAACGAGACTCTGAAAAGGATCCGGCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAGACAAGGAGAAGAAGAAGGTTCTGGTTTCGTTTGCTATGGAGGAGGAAGGAGGTGCAGACGTTGCTCCTACTCCAAAGAAGAAGAGACGGAAACAAAACAGGAGTGCAGACGATGATGACTCGATGTGGGTGGAGAAAGCTCCCCCACCTATCGTGGCGTCTACTTTGCCATCAACCTTAGGGACCGATTCGGCGGACG

SSR21，由SEQIDNO:4所示的核苷酸序列组成：

ATTCAGGCCTCCGGTTCATGATACTTCCTCTTCTCAGCAGCCAACCGCGCGCGCAGCCTCAACGATTTTTCCTTCATCTCGCTCCCCGAGGCCTTCAAACCGCGTTCCGTCTCGGTTCCTTGGTCCGTCGTCTGCGCTTTCAAAGCCAAGAGTCGTTTTCTTAGATCTTCCTGTTTCGAAGCTGATCCTTGGCTTTGCGATGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGGGGTTGGAGGCTGAACGGGAAGGGGATCTTCCCTCCCCTTGCCCTTGACCTTGAGATGGGCGTGAAGTGACTCCAGTGCGCTGCGCGGGGGACGTTTTGGGCGGTCCGGGAGAGGGAGAGGGGGCGTGTCTGGAGGAAGAGGCGGTGTGTCTAGGTCTAGAGGAAGAGACAGGTGCGGTGACGAGGATCTCCTGTGCC

SSR22，由SEQIDNO:5所示的核苷酸序列组成：

CCGTCGATGGTGATCCCCTGTGCCAGCTCTTCGCCGTAGCAATATTACCAAACGCTCTGGCCGTGTTATACTTCGTGTGTCAAGTTAAACTTTAGCTCTCCCGTCAGCTTGCAGCTTTATATGGCATAAATAAATGCTTACATATGAGCCATTTCCACCGAACTGTGTCTCCAGTGTGCGTCGAATAAACAACTGACGGAGATGATGATGATGATGATGATAGGTACACAAGGACTCACGCTTACTTCACGTGAGTGCTCGCTCGCGCTGTTAAGCGCGACTCGGAGTGCCCGGCCAGTGTCGCATCCAGGGGTTACCTAGGCGTCATGTACCTGAGCTTCTCCGAGGGAACGAGGTGGCGCGATTCCTACCTGCGCCACCTTTTGAAAATATTGCCAGGCGACAAAGACGGTTTCACTCG

SSR23，由SEQIDNO:6所示的核苷酸序列组成：

ACCAGAGTCGGTATATCCACCTCCGCGCAAGGTCATGTGACCTTTCGAGAAAGTATACAAGTCATCGACGAGCCTAGCCCAGAGTCTGATACTGAAGAGGAAGAGCAGAACCTGACGGATACAGAGCCTAACACTGAGGAGGAGGACATAGAAGGCGAGGAGCCTACTCACAAACCAATTCTGGTGATGGAGGACAATATCGACGACGACGACGACGACGAAGGGGAGGAGGAACGAAGCGACAGTGCCAACGTACTAGTTAATCCTTTCACATCAGAATCTGGTATGTCCATGTTTCCCCTGTCTACGACAATGCTAACCATTGAGACAGACATTCCCTTCGTTCGGGTCTTTGGGACTGGAGCTGTTCGGAGGACTCTCGTTCAGCTGGCCCGTGCATGTCATGCTTCTGCAAGCCTGC

SSR32，由SEQIDNO:7所示的核苷酸序列组成：

GGAGAAGGTGTTGAATGTTCCGTTTCTGTGGCTTTCCCAATCCAAGTTCGCGAGAGAGAATATTTCGGAGAGGCAGTCGTCGTTCAAGGTGTCGATGAAGGTGGAAGGTAGTTGCATGACGCTGATGAAATGTGAGTCAACGCACAGGAATTGAGTTGGGGGACACATACCTCGACATCGTAGAATGAAGGGTAGGTGGAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGTAGGAAATGATCATATGTGTGTGGCTTTTGTATGCAAAGTGGCGTGTACGATCTGTTATTGTTCAGCTCGGCAAATCAAAAGTGGAACAAACAACCGGTCTTACGGTCATTCATTCTGAACAGCGGACTGAGCGCAATCTTCCCATTCGCACATGACAACGAAAGAGAGCAATGTGTAGGGGTGGAAGGGTCCCCG

SSR45，由SEQIDNO:8所示的核苷酸序列组成：

CCCAACACCGGACATATACAATTAAGGGATGTCAAATATCTACTGCTACATATACAATATGAACAAAATCTCTACTAAGTAAATATAACACAAAATACAAAGCGCTCCAAAAAATAAAAGCCCCATCAGGTATCACCCTCCCCGCTACCCCCTTCAACAACCCACTTCATCCTCTCCACCGCACCAAGATGCCACGGCATACCACCACCACCACCACTCCGTCCACCCCCCATCCCCTTCAAACCCCCCAACACTGCCAACCCAAAATACGACCGCGTCACATCCCTAACCAACTCCTCATGCCCCCTCGCAGGATACACACACCCCACAGACCGTATGACATGCACAAGATGCACATGCACCATGCTCACATTCCCGCTCTCCGGCACCCGAATCAGTGTCGAGCTCGCATGCG

SSR87，由SEQIDNO:9所示的核苷酸序列组成：

CTTTGTCGAATTTTCACTACATATCGTACTTACTGATTCGCACTGAATGGTTGATTCTTCCCGCCCTCCTTTGAGTGTTCTTTGACGGCTTCAGGATAGGAATGAAGTTGTTCACTTCGACACCGAAATCTGTGGAAAAGTATCAATGAGCTAGCCCGGGCCGCTTGTCCATGTCGTTCTCTGTTTCTTACCATCACTTGTCTCTCTCTCTCTCTAATATCATTTGCTAGACATGAATGGTAAGCTTATAAGACGTCTACTTCTCCTTCCAACTCCGATTCAAAGAGGAAGGTCTCGAGGTCAATATCAACGACATACGTTAGTCTACACTTCCTTATCGAATCCTTTCGCTGACATCTTCCAGCATTGTCAGATCAGTCAGCATTACTGTACATGTGAAGAATGATACCGTTC

SSR95，由SEQIDNO:10所示的核苷酸序列组成：

TTTGTTGTTCTAAAGCTGAGCTTTGACTAGTTGGCGTTTCCGACAACTTAGCGGTTGGCTTGGCTTTTGGGGCTATTTTGGATTGGGTGTAGAAATAACTTGTTAACTCTTGTTTTACGAAGAATCGACTAAGTCAAATTTATCACCCCTCGCGGTGGGCTCCAAAATATGATGAGCAGTGCAAAAGAACACCACCAAATCACACACACACACACACTAACAAGTAGGCGTGGAAATGCAAGTCCGCTTCGATAGCGGGTCTGCTTTTTAATTGTTTAGAGTTCGATGAACTGGTCTTTGGGGTTTCGGGAAGGTATGGGGGTTCGATTGCAACGGTTCAAAATGTATAACAAGTTCGAGGGGTAACAGGGATCTGATCTTTAGTTGAAAACTAGAGGCCAACAAGAGTCACAGGC

SSR107由SEQIDNO:11所示的核苷酸序列组成：

GCTCCTTTGTTGCGCGCTGGCAAGACGCGACGAGCTCTGATTCTACACGGACGTCTTCGGTTACCTTGGCACTGGGAAGGACGATGGACATGGAATAGAGGTGTCCGAAATGCGAGCCATGTATGCGCTCTAGGTGCGTTGATCACCACTCTGCGCTCGTTTTTCTCATCCTTAGGCGATTTGCGCATAGGTGCATAGAGGAGAGAGAGAGACGCGAGTCATGTTAGCGTTCGATAGGTGTGTTTCAACGGCTCTGCGCTCTCTTTTCTTTGCTCAGATAAGGTCGCATAGGTGCCCAGAGCGCCTGTCATTCCCCCTTCTCCATCACCTTCTACGAGCGCCAGACAGAGCTGTATAACCTGGCGGGATGCGCAAACTCGTGCAACGAACGACCCGTCGCGGGCGAATGCAT

SSR124，由SEQIDNO:12所示的核苷酸序列组成：

CATGATGAACAGAACAATGTACGCGGAACAGAAAAGCTCGTCATAAGGCCCAAAAATTGAGAGGGTGCATGGAGGTGGACCGGCCATTTGATTCAAATGACAGCTGTCCCGTCGACGTCATCCCCTATCCTCCACGAAAGTATAAAGGTCAACACGAACGACTGAACTTTCCCCCCATCCCTCATACCTCATCATGTCATACAACAACAACAACAACTCTGATTCCTACGGCTCGAACGACAACTCGAACTCCTCCCGCAACGAGGATTCGTCCAACACCTACGGCGGTGGAGATCGCGAGTCCTCCAACAACTCTTCGTCGTACGGCAATGATTCCTCCGCTCGTGCTACGACCACTTCCTCGTACGGCGACAACGATCGTTCTTCCTCCAACAACAACTCTAACACCAACTCC

SSR133，由SEQIDNO:13所示的核苷酸序列组成：

GACGTTCAGGAAATGAACGTCGAGTGATTCAGGACGTCTACGAGACCAATGCTATACGGATATTTAATTCTATCTAGTTTACTTACTATTCTTGCCTTATACCAACCTTATACTAAATGATGATCTACGTTGTTGAAGTGCTTTAGCCGTCGGCCGATCGAATCCAGGCCTTCGCCTTGGTCTACGAAACTAGCTCCTCTTCTCTCTCTCTCTCATGTCGCAGTCAACAATCTCAACGACCTTTACAGAGTCGCCTCCATCATCGCCTAGTGGATGGATTGACTCGTCTCCCCCATCATCACCTGGCGGAGAAGCCCCAGACATTAGCTTCGACCATCCCTATGCTGGCTCTCAGAAGCTCACACGTAAACCGAAAGACTACGACCGGGAAGCGCGTGGGTTCAGGAAACCTCG

上述SSR分子标记的引物序列分别为：

SSR2-F，由SEQIDNO:14所示的核苷酸序列组成：

GCACGCTCCTAAACCTATCG

SSR2-R，由SEQIDNO:15所示的核苷酸序列组成：

CGACTTGTCGAGGAAGATCC

SSR7-F，由SEQIDNO:16所示的核苷酸序列组成：

ACGCTAATCCGCTTGTTCAT

SSR7-R，由SEQIDNO:17所示的核苷酸序列组成：

TCGCGTCACTCGTGTAAGTC

SSR15-F，由SEQIDNO:18所示的核苷酸序列组成：

GATGACGAGGACAGTGACGA

SSR15-R，由SEQIDNO:19所示的核苷酸序列组成：

CCTCCTTCCTCCTCCATAGC

SSR21-F，由SEQIDNO:20所示的核苷酸序列组成：

GAAGCTGATCCTTGGCTTTG

SSR21-R，由SEQIDNO:21所示的核苷酸序列组成：

CTAGACACACCGCCTCTTCC

SSR22-F，由SEQIDNO:22所示的核苷酸序列组成：

TCTTCGGATGCTTTGGAATC

SSR22-R，由SEQIDNO:23所示的核苷酸序列组成：

TCGTTCTCTTTGCACACGTC

SSR23-F，由SEQIDNO:24所示的核苷酸序列组成：

AAGTCATCGACGAGCCTAGC

SSR23-R，由SEQIDNO:25所示的核苷酸序列组成：

CGAACGAAGGGAATGTCTGT

SSR32-F，由SEQIDNO:26所示的核苷酸序列组成：

CGTCGTTCAAGGTGTCGATG

SSR32-R，由SEQIDNO:27所示的核苷酸序列组成：

GACCGGTTGTTTGTTCCACT

SSR45-F，由SEQIDNO:28所示的核苷酸序列组成：

CCCAACACCGGACATATACA

SSR45-R，由SEQIDNO:29所示的核苷酸序列组成：

GTTGGTTAGGGATGTGACGC

SSR87-F，由SEQIDNO:30所示的核苷酸序列组成：

CGCTTGTCCATGTCGTTCTC

SSR87-R，由SEQIDNO:31所示的核苷酸序列组成：

TGCTGACTGATCTGACAATGC

SSR95-F，由SEQIDNO:32所示的核苷酸序列组成：

ACAACTTAGCGGTTGGCTTG

SSR95-R，由SEQIDNO:33所示的核苷酸序列组成：

CTATCGAAGCGGACTTGCAT

SSR107-F，由SEQIDNO:34所示的核苷酸序列组成：

ACACGGACGTCTTCGGTTAC

SSR107-R，由SEQIDNO:35所示的核苷酸序列组成：

AGAGCCGTTGAAACACACCT

SSR124-F，由SEQIDNO:36所示的核苷酸序列组成：

AATTGAGAGGGTGCATGGAG

SSR124-R，由SEQIDNO:37所示的核苷酸序列组成：

GTGTTGGACGAATCCTCGTT

SSR133-F，由SEQIDNO:38所示的核苷酸序列组成：

TGAACGTCGAGTGATTCAGG

SSR133-R，由SEQIDNO:39所示的核苷酸序列组成：

GGAGACGAGTCAATCCATCC

4.SSR位点遗传多样性信息计算：

将获得的SSR数据运用PopGene32和PIC_CALC软件进行各位点的遗传多样性指标及多态性信息含量(Polymorphisminformationcontent，PIC)计算，结果如表2，13个SSR位点在55个金针菇样品中的等位基因数(Na)为2-8个，平均4.2个，香浓多样性指数(I)平均值为0.821，观测杂合度(Ho)平均值为0.401，期望杂合度(He)平均值为0.455，多态性信息含量(PIC)平均值为0.426，结果表明13个SSR位点在金针菇样本中具有较高的多态性。用软件NTsys2.10e构建样品间的UPGMA树，结果如图1，13个SSR位点可将55个金针菇菌株区分开。

表213个微卫星位点的遗传多样性信息

Claims (9)

1.金针菇SSR分子标记，其特征在于其为序列表中SEQIDNO:1至SEQIDNO:13中的任意一个SSR位点。

2.在权利要求1所述的金针菇SSR分子标记位点两端的侧翼序列上的金针菇SSR引物，其特征在于所述的金针菇SSR引物具有序列表中SEQIDNO:14至SEQIDNO:39中所示的碱基序列。

3.如权利要求1所述的金针菇SSR分子标记，其特征在于所述金针菇SSR分子标记13个SSR位点在55个金针菇样品中的等位基因数Na为2-8个，平均4.2个，香浓多样性指数I平均值为0.821，观测杂合度Ho平均值为0.401，期望杂合度He平均值为0.455，多态性信息含量PIC平均值为0.426，13个SSR位点在金针菇样本中具有较高的多态性。

4.如权利要求1或2所述的金针菇SSR分子标记或金针菇SSR引物，其特征在于所述的金针菇SSR分子标记及对应SSR引物的核苷酸序列为表1，

表1SSR位点及引物序列

5.权利要求1所述的金针菇SSR分子标记的开发方法，其特征在于该方法包括下述步骤：用生物信息学方法检测金针菇基因组序列中的SSR序列，选取部分SSR序列进行引物开发，运用不同金针菇菌株进行SSR位点的筛选，筛选出13对多态性较高的SSR分子标记，上述SSR标记及对应引物的核苷酸序列为表1，

表1SSR位点及引物序列

6.权利要求1所述的金针菇SSR分子标记和权利要求2所述的金针菇SSR引物在鉴别金针菇不同品种中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用是用已有的金针菇基因组序列，用生物信息学方法检测其中的SSR位点，选取部分SSR位点进行引物开发，用不同种类金针菇菌株进行SSR位点筛选出多态性较高的SSR分子标记，用不同SSR位点的荧光引物对不同种类的金针菇菌株的DNA进行PCR扩增，然后将PCR产物用ABI3730设备进行毛细管电泳，用Genemapper软件分析SSR数据，通过对SSR数据比对鉴定出不同种类的金针菇菌株。

8.对金针菇不同菌株进行鉴定的SSR标记及引物开发的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：用软件MISA和Primer3设计金针菇基因组SSR位点及其引物，用改良的CTAB法提取金针菇DNA，将所设计的SSR引物对金针菇DNA进行PCR扩增、检测。

9.如权利要求8所述的对金针菇不同菌株进行鉴定的SSR标记方法，其特征在于该方法具体包括下述步骤：

金针菇基因组SSR位点开发及引物设计：从NCBI上下载金针菇基因组数据，运用软件MISA对其基因组SSR位点进行检测，运用软件Primer3对被检测到的SSR位点在其上游及下游200bp范围内进行引物开发，引物开发条件为：引物长度在18bp-23bp之间，引物TM值在57-62之间，GC含量在30％-70％之间；

金针菇基因组提取及检测：其中总DNA提取用改进的CTAB法：

(1)用接种刀刮取培养皿中的菌丝，放于2ml离心管中，加入少量石英砂、PVP和350μl在65℃下预热的4×CTAB提取液，提取液内含0.2％的β-巯基乙醇，研磨，菌丝磨匀后，再加入上述4×CTAB提取液400μl振荡混匀，在65℃水浴锅中温浴2～4h，30min摇匀一次；

(2)将温浴材料取出置于室温下，待其冷却到室温后加入750μl24︰1氯仿-异戊醇，摇匀，12000r/min下离心10min；

(3)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，摇匀，12000r/min下离心10min；

(4)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入80％体积的异丙醇，预冷至-20℃，充分混匀，于-20℃冰箱中放置1～2h；

(5)自冰箱中取出，恢复到室温后，12000r/min下离心15min，弃上清液；

(6)用500μl的70％的乙醇和无水乙醇各冲洗1～2次，每次12000r/min室温离心1min后弃上清液，然后将离心管置于37℃恒温箱中约20～30min，使乙醇充分挥发，或者开盖使其自然干燥，干燥后加入灭菌的蒸馏水；

(7)用核酸浓度检测仪检测DNA浓度，将浓度调节至100ng/μl，置于-20℃保存；

SSR位点的PCR扩增检测：从上述筛选到的SSR位点中随机选取124个位点对8个不同来源的金针菇菌株进行初步筛选，检测扩增条带的有无，PCR反应体系为：100ng/μl的DNA模板1μl，25mg/mlBSA1μl，10×PCRBuffer2.5μl，dNTP10mm0.5μl，正向引物5um1μl，反向引物5um1μl，Taq酶0.3μl，ddH₂015.7μl，PCR反应条件为：94℃：4min，(94℃30s，55℃30s，72℃30s)×35cycles，72℃8min，PCR产物点样于1％浓度的琼脂糖胶中，放入1×TAE缓冲液中进行电泳检测，经检测有109对引物在8个金针菇菌株中扩增出清晰明亮的条带，从中选取13对引物进行荧光引物合成，后将13对荧光引物及55个金针菇菌株DNA样品进行荧光引物扩增，并用ABI3730xl设备检测扩增产物，使用Genemapper软件分析、记录SSR数据；

SSR位点遗传多样性信息计算：将获得的SSR数据运用PopGene32和PIC_CALC软件进行各位点的遗传多样性指标及多态性信息含量计算，结果如表2，13个SSR位点在55个金针菇样品中的等位基因数Na为2-8个，平均4.2个，香浓多样性指数I平均值为0.821，观测杂合度Ho平均值为0.401，期望杂合度He平均值为0.455，多态性信息含量PIC平均值为0.426，结果表明13个SSR位点在金针菇样本中具有较高的多态性；用软件NTsys2.10e构建样品间的UPGMA树，结果如图1，13个SSR位点将55个金针菇菌株区分开，

表213个微卫星位点的遗传多样性信息