CN104017899A - 海马的鉴定方法 - Google Patents

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温珑莲
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万德光
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明涉及海马的鉴定方法，属于分子生物学领域。本发明要解决的技术问题，是提供一种海马的鉴定方法。本发明海马的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：a、提取海马总DNA；b、PCR扩增：对海马总DNA进行PCR扩增，得COI基因序列；c、PCR产物测序；d、序列比对，确定海马种类。本发明海马的鉴定方法不受形态特征的限制，能在缺少形态特征而无法利用传统形态分类法进行海马物种的鉴别，同时具有准确性高等优点，为我国海马的系统学和海马资源研究提供科学依据，为海马资源的生物多样性用和资源保护提供可靠依据。

Description

海马的鉴定方法
技术领域
本发明涉及海马的鉴定方法，属于分子生物学领域。
背景技术
目前，中药材主要有以下几种常用鉴定手段：基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定等，而这些鉴定方法存在一定的缺陷：(1)中药材的表型可塑性和遗传可变性容易导致鉴定结果错误；(2)受生物性别和发育阶段的限制；(3)无法准确鉴定许多群体中存在的隐存分类单元；(4)现代互式鉴定系统要求较高的专业技术知识和经验，化学方法多不能用于物种鉴别。同时我国关于海马的系统学和形态学研究几乎为零。《中国鱼类系统检索》中根据较为简单的形态特征对我国海马属的6个种进行了分类，不能称为我国海马形态鉴定的重要依据；2010年《中国药典》对所收载的5个种进行了形态学描述，除H.kelloggi的描述较为详细外，其他4个均较为简略，不能有效的进行准确鉴别；《中国动物志》·海龙科也尚未出版，不能对我国海马属的动物准确物种鉴定有指导作用。
综上，由于传统形态学易受个体外观形态和鉴定者主观意识的影响的局限性，因此选择稳定性高、通用性强、高效快捷的海马的鉴定方法对市售海马商品种进行准确鉴定和分类研究，根据研究结果完善和修订市售海马药材的传统形态鉴定，从而改善海马药材混乱的销售现状，加强海马药材的质量控制，提高海马的临床疗效和临床用药安全，具有积极意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种海马的鉴定方法。
本发明海马的鉴定方法，包括如下步骤：
a、提取海马总DNA；
b、PCR扩增：对海马总DNA进行PCR扩增，得COI基因序列；
c、PCR产物测序；
d、序列比对，确定海马种类。
其中，COI指的是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I，以COI这个特定的片段为DNA条形编码的基础，用于物种鉴定，又称为DNA条形码技术。
进一步的，提取海马总DNA的方法可以采用常用的DNA提取方法，如改良CTAB法、高盐法、SDS法、蛋白酶K法(酚—氯仿抽提法)和试剂盒法等，但为了提高提取效果，本发明优选采用试剂盒法提取海马总DNA。
进一步的，引物的扩增效率是评价COI基因是否能够成为DNA条形码标准基因的重要依据，本发明海马的鉴定方法，所述b步骤中PCR扩增的引物为FishF1、FishF2、FishR1和FishR2；其中，FishF1序列如Seq ID NO.1所示，即FishF1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；FishF2序列如Seq ID NO.2所示，即FishF2：5’-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’；FishR1序列如Seq ID NO.3所示，即FishR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；FishR2序列如Seq ID NO.4所示，即FishR2：5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’。
进一步的，为了提高PCR扩增效率和增强PCR扩增效果，本发明海马的鉴定方法中PCR扩增体系为25μl，其中，2×PCR MixMaster12.5ul，FishF1 1ul，FishF2 1ul，FishR1 1ul，FishR2 1ul，海马总DNA2ul，ddH2O补足至25ul。
进一步的，为了获得高浓度的扩增产物，本发明海马的鉴定方法中PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；94℃0.5min；50℃0.5min；72℃1min；共35个循环；72℃延伸10min。
进一步的，为了检测海马总DNA满足PCR扩增的要求，在a、b步骤之间，优选对海马总DNA采用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10～20min，在全自动凝胶成像仪中对胶板进行拍照。
同样地，为了检测PCR产物浓度是否满足测序要求，在b、c步骤之间，还对PCR产物进行电泳检测，其采用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10～20min。
进一步的，将PCR扩增得到的序列与基因库中的海马序列进行比对，以此鉴定海马的物种。
本发明有益效果：
(1)不受形态特征的限制，能在缺少形态特征而无法利用传统形态分类法的情况下进行海马物种的鉴别；
(2)不受个体性别和发育阶段的限制，本发明海马的鉴定方法可排除物种的表型可塑性和遗传可变性等影响因素，在DNA分子水平上提供一种可靠的分类依据；
(3)不受研究者的专业水平限制，未掌握形态分类学知识的研究者应用本方法也可对海马物种进行鉴定；
(4)为我国海马的系统学和海马资源研究提供科学依据，为海马资源的生物多样性用和资源保护提供可靠依据；
(5)可以改善市售海马混乱的流通现状、加强海马药材质量标准的控制、加速海马药材质量标准的建立，同时提高了海马的临床用药安全。
附图说明
图1：不同DNA提取方法DNA提取效果对比图；
其中，M-DL2000，1-试剂盒法，2-改良的CTAB法，3-SDS法，4-蛋白酶K法，5-高盐法；
图2：试剂盒法DNA提取效果图；
其中，M-DL2000，1-H.trimaculatus，2-H.kelloggi，3-H.histrix，4-H.comes，5-H.ingens；
图3蛋白酶K法DNA提取效果图；
其中，M-DL2000，1-H.trimaculatus，2-H.kelloggi，3-H.histrix，4-H.comes，5-H.ingens；
图4：所有样品的DNA提取图；
其中，M-DL2000；1-H.trimaculatus，2-H.kelloggi，3-H.histrix，4-H.comes，5-H.ingens；6-H.Jayakaris，7-H.reidi，8-H.erectus，9-H.spinosissimus，10-H.fuscus，11-H.algiricus，12-H.angustus，13-H.barbouri，14-H.kuda，15-H.brewicep；
图5：不同引物PCR扩增效果凝胶电泳图；
其中，M-DL2000，1-空白对照，2和4-第二组引物，3和5-第一组引物；
图6：温度梯度考察凝胶电泳图；
其中，M-DL2000，1-45℃，2-45.7℃，3-46.7℃，4-48.1℃，5-50.2℃，6-51.6℃，7-52.6℃，8-53℃，9-空白对照；
图7：市售海马商品药材PCR扩增结果图；
其中，M-DL2000，1和2-H.fuscus，3和4-H.ingens，5和6-H.spinosissimus，7和8-H.kuda，9和10-H.erectus，11和12-H.brewiceps，13和14-H.angustus，15和16-H.barbouri，17和18-H.comes，19和20-H.reidi；
图8：市售海马商品药材PCR扩增结果图；
其中，M-DL2000，21和22-H.histrix，23和24-H.algiricus，25和26-H.Jayakaris，27和28-H.trimaculatus，29和30-H.kelloggi；
图9：9种市售海马商品种线粒体COI基因NJ树；
图10：9种市售海马商品种线粒体COI基因NJ树；
图11：海马药材情况图；
其中：①-S01，②-S02，③-S03；
图12：DNA提取结果图；
其中，M-DL2000，1-S01，2-S02，3-S03；
图13：PCR扩增结果图；
其中，M-DL2000，1-S01，2-S02，3-S03，4-空白对照。
具体实施方式
本发明海马的鉴定方法，包括如下步骤：
a、提取海马总DNA；
b、PCR扩增：对海马总DNA进行PCR扩增，得COI基因序列；
c、PCR产物测序；
d、序列比对，确定海马种类。
其中，COI指的是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I，以COI这个特定的片段为DNA条形编码的基础，用于物种鉴定，又称为DNA条形码技术。
进一步的，提取海马总DNA的方法可以采用常用的DNA提取方法，如改良CTAB法、高盐法、SDS法、蛋白酶K法(酚—氯仿抽提法)和试剂盒法等，但为了提高提取效果，本发明优选采用试剂盒法提取海马总DNA。
进一步的，引物的扩增效率是评价COI基因是否能够成为DNA条形码标准基因的重要依据，本发明海马的鉴定方法，所述b步骤中PCR扩增的引物为FishF1、FishF2、FishR1和FishR2；其中，FishF1序列如Seq ID NO.1所示，即FishF1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；FishF2序列如Seq ID NO.2所示，即FishF2：5’-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’；FishR1序列如Seq ID NO.3所示，即FishR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；FishR2序列如Seq ID NO.4所示，即FishR2：5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’。
进一步的，为了提高PCR扩增效率和增强PCR扩增效果，本发明海马的鉴定方法中PCR扩增体系为25μl，其中，2×PCR MixMaster12.5ul，FishF1 1ul，FishF2 1ul，FishR1 1ul，FishR2 1ul，海马总DNA2ul，ddH2O补足至25ul。
进一步的，为了获得高浓度的扩增产物，本发明海马的鉴定方法中PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；94℃0.5min；50℃0.5min；72℃1min；共35个循环；72℃延伸10min。
进一步的，为了检测海马总DNA满足PCR扩增的要求，在a、b步骤之间，优选对海马总DNA采用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10～20min，在全自动凝胶成像仪中对胶板进行拍照。
同样地，为了检测PCR产物浓度是否满足测序要求，在b、c步骤之间，还对PCR产物进行电泳检测，其采用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10～20min。
进一步的，将PCR扩增得到的序列与基因库中的海马序列进行比对，以此鉴定海马的物种。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
进一步的，将PCR扩增得到的序列与基因库中的海马序列进行比对，以此鉴定海马的物种。
本实施例中海马药材为干品，购于成都市荷花池中药材专业市场、河北安国中药材专业市场、安徽亳州中药材专业市场(以下简写为荷花池、安国、亳州)，具体情况如表1；取样依据是海马的表型特征，海马分类主要参考Lourie等的海马分类和鉴别方法(Lourie SA,Vincent A C J,Hall H J.Seahorses:an identification guide to the world's speciesand their conservation[M].Project Seahorse,1999；Foster S J,Cooper E W T,Vincent AC J.A guide to the identification of seahorses[M].Project Seahorse and TRAFFIC NorthAmerica,2004)。
表1 本实验所用的海马样本种类、采集地及拉丁名
名称 拉丁名 收集地 名称 拉丁名 收集地
三斑海马 H.trimaculatus 荷花池 大海马 H.kelloggi 荷花池
刺海马 H.histrix 安国 太平洋海马 H.ingens 荷花池
虎尾海马 H.comes 荷花池 吻海马 H.reidi 亳州
贾氏海马 H.Jayakaris 荷花池 棘海马 H.spinosissimus 荷花池
直立海马 H.erectus 安国 西非海马 H.algiricus 安国
短吻海马 H.fuscus 亳州 鲍氏海马 H.barbouri 安国
窄腹海马 H.angustus 荷花池 短头海马 H.brewicep 亳州
管海马 H.kuda 荷花池
本发明采用的主要试剂详见表2，常用试剂均为分析纯。
表2 本发明用主要试剂
试剂名称 生产厂家
Proteinase K TaKaRa
DNAFragment Purification Kit TaKaRa
Agarose TaKaRa
6X—Loading Buffer Takara
续表2
DNA Marker DL2000 Bioteke Gorporation
DNA Marker L15000 Bioteke Gorporation
2X Taq酶 博迈德生物
PCR扩增用引物 百泰克生物
DNA提取试剂盒 TIANGEN公司
Tris-酚饱和溶液 华舜生物有限公司
EDTA、NaCl、NaAc、KAc、氯仿、异戊醇、冰乙酸、浓HCl、NaOH(固体)、Tris，以上试剂均为分析纯(成都市科龙化工试剂厂)；CTAB：Cat#co833-100G，Hige Purity(重庆升博科技有限公司)。本发明实施例所采用的主要仪器详见表3。
表3 本实验用的主要仪器种类
仪器名称 型号 生产厂家
台式高速冷冻离心机 AllegraX-22R Centrifuge BECKMAN COULTER
电子恒温水浴锅 HHS-S 上海光地仪器设备有限公司
多用电泳仪 DYY-III-12B型 北京市六一仪器厂
电泳槽 DYY-II-34A、DYY-II-33B型 北京市六一仪器厂
凝胶成像分析系统 GELDOCEQ BIO-RAD
电热恒温鼓风干燥箱 DGG-9070A型 成都永益实验仪器有限公司
PCR仪 icycler BIO-RAD
2 实验方法
2.1 实验试剂的配制
改良CTAB法所用试剂：0.5mol/L EDTA，1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，5mol/L NaCl，2×CTAB Buffer，3mol/L NaAc，3mol/L KAc。
高盐法所用试剂：均质盐缓冲液：0.4mol/L NaCl,1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，2mmol/LEDTA(pH8.0)。
SDS法所用试剂：DNA提取液：1.5％SDS，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L EDTA(pH8.0)，0.5mol/L NaCl,1％2-巯基乙醇(使用前加入)。
蛋白酶K法所使用试剂：SET Buffer：0.15mol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，lmmol/L EDTA氯仿：异戊醇(24:1)。
TE Buffer：精密量取10ml1mol/L Tris-HCl(pH8.0)、2ml0.5mol/L EDTA，混匀，并用ddH2O定容在50ml。
2.2 总DNA提取
本实验从海马药材(干品)提取基因组DNA，并建立一套提取和纯化DNA的方法，为海马的后续相关研究建立方法基础。主要有5种方法：改良的CTAB法；高盐法；SDS法；蛋白酶K法；试剂盒法。
2.2.1 样品处理
海马样品从肛门后4～7mm处剪取尾部，沿剪取得的尾部横截面剥取外骨骼及皮肤约10mm，取肌肉组织0.05～0.5g，放入1.5ml或2.0ml经高压灭菌的离心管(EP管)中，并分别做好标记。
2.2.2 DNA提取
2.2.2.1 改良的CTAB法
具体操作步骤同参考文献中的改良的CTAB法，参考文献为Yan M M,Wei G C,Pan X H,Ma,H L,Li W Z.A method suitable for extracting genomic DNA from animal andplant―modified CTAB method[J].Agricultural Science&Technology.2008,9(2):39-41。
2.2.2.2 高盐法
具体操作步骤同参考文献中的高盐法，参考文献为Aljanabi S M,Martinez I.Universaland rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-basedtechniques[J].Nucleic Acids Research,1997,25(22):4692-4693。
2.2.2.3 SDS法
具体操作步骤同参考文献中的SDS法，参考文献为段中岗,黄琼林,杨锦芬,刁玲武，詹若挺，何瑞，徐晖，严萍，陈蔚文.适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法的研究[J].中药新药与临床药理.2009,20(5):480-484。
2.2.2.4 蛋白酶K法(酚—氯仿抽提法)
具体操作步骤同参考文献中的蛋白酶K法，参考文献为王培训,周联,赖小平.分子生物技术与中药鉴别-RAPD技术的研究与应用[M].广州:广东世界图书出版有限公司,2002:6-11。
2.2.2.5 试剂盒法
具体操作同试剂盒操作步骤。
2.2.3 电泳检测
采用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10～20min，在全自动凝胶成像仪中对胶板进行拍照。
2.2.4 检测结果分析
分别对改良CTAB法、高盐法、SDS法、蛋白酶K法及试剂盒法5种方法所提取的样品总DNA进行电泳检测，结果如图1。由图中可知，不同提取方法对DNA提取效果存在较为明显的差异，其中：蛋白酶K法(第四泳道)和试剂盒法(第一泳道)有较为明显的DNA电泳条带，尤其是试剂盒法；其他方法DNA电泳条带则相对较暗，改良的CTAB法和SDS法几乎不能成功对样品提取总DNA。在此基础上，进一步对蛋白酶K法和试剂盒法2种提取方法的通用性进行了验证，分别对5种市售海马商品药材样品提取DNA。如图2、图3所示，两种方法均获得一定成功，其中试剂盒法对5个样品成功提取4个样品总DNA，蛋白酶K法则仅有2个样品的总DNA提取较为成功，因此试剂盒法较蛋白酶K法通用性和提取效果更好，因此本研究采用试剂盒法提取海马商品药材总DNA，图4是利用试剂盒法提取得到的表1中所有海马样品的DNA提取图。
2.3 PCR扩增
2.3.1 引物选择
通用引物的扩增效率是评价COI基因是否能够成为DNA条形码标准基因的重要依据，因此首先对引物进行选择，两组COI通用引物在相同实验条件下采用文献报道的扩增体系和程序进行PCR扩增实验，根据凝胶检测结果选择最佳引物。在查阅了大量国内外动植物DNA条形码文献基础上，结合国内动植物DNA条形码研究现状，选择了两组线粒体COI基因的通用引物。第一组：LCOI149和HCOI2198，几乎可以作为所有动物DNA条形码研究时PCR扩增用引物；第二组：FishF1、FishF2、FishR1、FishR2，主要是作为鱼类动物DNA条形码研究时PCR扩增用引物。
第一组：线粒体COI基因的通用引物：
LCOI149：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；
HC012198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
第二组：线粒体COI基因的通用引物：
FishF1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；
FishF2：5’-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’；
FishR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；
FishR2：5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’。
2.3.2 退火温度考察
PCR扩增体系选择25ul，扩增程序根据引物采用不同的程序。扩增体系(25ul)：2×PCR MixMaster12.5ul，引物各1ul，DNA模板2ul，ddH2O补足至25ul。第一组COI基因通用引物使用的PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃：1min，45℃：1.5min，72℃：1.5min，共5个循环；94℃：1min，50℃：1.5min，72℃：1min，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。第二组COI基因通用引物使用的PCR反应程序：95℃预变性2min；94℃：0.5min，50℃：0.5min，72℃：1min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
退火温度的选择是PCR反应条件选择的核心内容，因此在确定的引物条件下对最佳退火温度进行了考察。根据文献选择退火温度的范围为：50～60℃,以1～2℃为一个温度梯度，分别对2个来源的组COI通用引物进行梯度退火温度选择试验，并根据试验结果选择PCR成功率及条带清晰度均较高者的温度为最佳退火温度。
2.3.3 PCR结果检测
采用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10～20min，在全自动凝胶成像仪中对胶板进行拍照。
2.3.4 检测结果分析
2.3.4.1 扩增引物选择
根据凝胶电泳检测结果(如图5所示)可知，第二组线粒体COI基因的通用引物的扩增效果、稳定性及通用性远远好于第一组线粒体COI基因的通用引物。因此根据实验结果选择第二组线粒体COI基因的通用引物作为市售海马商品药材DNA条形码研究的COI基因的通用引物。
2.3.4.2 退火温度选择
为了提高PCR扩增效率和增强PCR扩增效果，在确定了最佳引物的情况下，对退火温度进行了范围为：45～53℃的梯度考察，以确定最佳退火温度。根据实验结果(如图6所示)可知：当退火温度在50℃左右(第5、6泳道)时较其他的泳道目的条带清晰，亮度更好，因此选择最佳退火温度为50℃。
综上所述，得到最佳最优PCR扩增反应体系和程序。最优PCR扩增反应体系(25ul)：2×PCR MixMaster12.5ul，FishF1 1ul，FishF2 1ul，FishR1 1ul，FishR2 1ul，DNA模板2ul，ddH2O补足至25ul。最优PCR扩增反应程序：95℃预变性2min；94℃：0.5min，50℃：0.5min，72℃：1min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
采用最优PCR扩增体系和扩增程序对所有购回的海马商品药材进行扩增，均得到了较为理想的扩增结果，扩增结果如图7、图8。
2.4 PCR产物测序
PCR扩增产物经纯化试剂盒(多功能DNA纯化回收试剂盒，百泰克公司)进行纯化回收，纯化产物直接送检用于序列测定，使用通用引物进行双向测序。
3 结果分析
市售海马商品药材通过DNA提取、PCR扩增和PCR产物测序，最终得到了9个海马商品药材种的27个个体片段长为654bp的COI基因序列，成功率为100％。为了更好地完成对市售海马商品药材海马种的系统学和分类学研究，从GenBank中下载了不同种海马的序列，如表4所示。所得序列使用Codon Code Aligner软件(Codon Code Co.，Germany)对序列进行拼接，用MEGA5.1软件对序列的碱基组成、序列间的碱基变异、序列间的转换颠换频率及其比率进行计算，同时对遗传距离进行计算。遗传距离采用了Kimura two-parameter，即K2P距离模型，并采用了以下4个参数系统进行评估种间序列变异和种内序列变异：平均种间序列变异、平均最小种间距离、平均种内序列距离、平均种内最大距离。同时基于K2P参数模型用NJ邻接法(neighbor-2-joining method)、ML(Maximum-Likelihood)、ME(Minimum-Evolution)重复1000次bootstrap检验各分支的支持率来构建系统发育树，并以此鉴定各海马商品药材。
表4 GenBank中下载的海马序列
拉丁名 GenBank序列号
H.trimaculatus GQ502171.1、GQ502172.1、
H.kelloggi GQ502149.1、GQ502150.1、GQ502151.1
H.comes GQ502133.1、GQ50214.1、GQ502135.1
H.ingens GQ502148.1
H.cf.fuscus GQ502132.1、GQ502140.1
H.barbouri GQ502143.1、GQ502154.1、GQ502130.1
H.kuda GQ502153.1、GQ502154.1
H.mohnikei GQ502157.1、GQ502158.1、GQ502159.1
H.queenslandicus GQ502161.1、GQ502162.1、
3.1 DNA提取结果分析
为了得到较高提取效率、较强通用性的DNA提取方法，分别对改良的CTAB法、SDS法、高盐法、蛋白酶K法及试剂盒法5种方法进行了DNA提取方法的考察。实验结果表明，改良的CTAB法及SDS法这两种方法虽然对大多数植物和部分动物能够有较好的提取效果，但由于海马样品干药材本身的特殊性：几乎是骨骼和体表组织、总DNA含量较其他新鲜组织低等原因，导致了这两种方法的提取效果较其他3种方法差，几乎不能成功对样品进行DNA提取；高盐法和蛋白酶K虽然能够成功对样品进行DNA提取，但通用性差不能完全适用于所有市售海马商品药材；试剂盒法不仅提取效果远远好于其他4种，且能够对所有海马种成功进行DNA提取，所以最终选择了试剂盒法。
3.2 碱基组成分析
本实验得到了市售海马商品药材共9种27条线粒体COI序列，经过人工校正去除不准确部分，得到的有效长度为654bp。当同GenBank上下载的海马序列对比分析后，所得9种海马商品药材序列中4种碱基的A、T、G、C的平均含量分别为：25.8％、33.6％、17.7％和22.9％。其中A+T平均含量为59.4％，明显高于G+C平均含量40.6％，不同市售种中A+T平均含量均要高于G+C平均含量(如表5-8)。同时4种碱基中G的含量较其他3种碱基含量低得多，这一现象符合了脊椎动物线粒体DNA的特点，在第二位和第三位碱基使用频率远远高于第一位的使用频率，表明密码子的使用也具有一定的偏向性(如表9)。654个位点中，保守位点(Conserved sites)488个，变异位点(Variable sites)156个，其中简约信息位点(Parsimonyinformative sites)145个，多在密码子的第三位点上发生序列变异(如表10)。
表5 27个市售海马品种的COI基因突变位点修改blast结果
表6 所得27个市售海马品种的COI基因突变位点修改blast结果
表7 所得27个市售海马品种的COI基因突变位点修改blast结果
续表7
HM007-02 T...TT...C AT..T..T.. GTT.CCC.C. AT.C.TT..C
HM007-03 T...TT.CCC AT..T..T.. .AT.TC..CG AT..G.TGC.
HM008-02 T...TT.CCC AT..T..T.. .AT.TC..CG AT..G.TGC.
HM008-03 T…TT.CCC AT..T..T.. .AT.TC..CG AT..G.TGC.
HM009-01 T...TT.CCC AT..T..T.. .AT.TC..CG AT..G.TGC.
HM009-01’ T...TT..CC AT..T..T.. GAT.TC..CG AT.....GC.
HM009-02 T...TT.CCC AT..T..T.. .AT.TC..CG AT..G.TGC.
HM009-02’ T...TT..CC AT..T..T.. GAT.TC..CG AT.....GC.
HM009-03 T...TT..CC AT..T..T.. GAT.TC..CG AT.....GC.
HM010-01 T...TT.CCC AT..T..T.. .AT.TC..CG AT..G.TGC.
HM010-02 T...TT.CCC AT..T..T.. .AT.TC..CG AT..G.TGC.
HM011-01 ..ACTT..CC A...TG.T.. .ATTTC.CCG .T..G.TT.A
HM012-01 ..ACTT..CC A...TG.T.. .ATTTC.CCG .T..G.TT.A
HM013-0l T...TT.CCC AT..T..T.. .AT.TC..CG AT..G.TGC.
HM013-02 T...TT.CCC AT..T..T.. .AT.TC..CG AT..G.TGC.
HM014-01 ..A.TTC.CC G.AG..C.GG .TT....... T.G..TTT.C
HM014-02 ..A.TTC.CC G.AG..C.GG .TT....... T.G..TTT.C
HM015-01 T...TT...C AT..T..T.. GTT.CCC.C. AT.C.TT..C
HM015-02 T...TT...C AT..T..T.. GTT.CCC.C. AT.C.TT..C
表8 所得27个市售海马品种的COI基因突变位点修改blast结果
续表8
HM012-01 A.T.....A. .T.AA.C.TC ....C
HM013-01 ...T..C.A. .TC.A.CCT. ....C
HM013-02 ...T..C.A. .TC.A.CCT. ....C
HM014-01 AC.TT.C.AT TT..C...TC T...C
HM014-02 AC.TT.C.AT TT..C...TC T...C
HM015-01 A..C..C.AT .T.AA.AC.C ..G.C
HM015-02 A..C..C.AT .T.AA.AC.C ..G.C
表9 9种海马商品药材线粒体COI序列碱基组成(％)
物种 T C A G
H.trimaculatus 33.5 23.1 27.0 16.4
H.kelloggi 33.2 22.7 26.5 17.6
H.comes 33.8 22.6 26.8 16.8
H.ingens 33.5 23.0 26.0 17.5
H.cf.fuscus 34.3 22.4 25.6 17.8
H.barbouri 32.2 23.4 26.4 18.0
H.kuda 33.8 23.0 25.1 18.1
H.mohnikei 33.7 23.1 26.5 16.7
H.queenslandicus 33.6 22.7 26.1 17.5
表10 9种市售海马商品药材COI基因密码子碱基的使用频率
3.3 遗传距离分析
将排列好的27个样品片段，使用MEGA5.1软件，采用K2P参数模型，计算不同市售海马商品药材线粒体COI基因种内种间遗传距离，结果见表11和表12。结果表明，基于COI序列计算出的种内、种间遗传距离的变化范围分别为：0.000～0.0124和0.0272～0.1485，平均值分别为：0.0033和0.0853。实验中的9个市售海马商品种中H.kuda的种内个体间遗传距离最大为：0.0124(1.24％)，；H.cf.fuscus和H.mohnikei的种内遗传距离最小，仅为0.000。不同种之间相互对比，H.kuda和H.mohnikei的种间遗传距离最大，达到0.1485(14.85％)；H.ingens和H.cf.fuscus的种间遗传距离最小，为0.0272(2.72％)。在对线粒体基因的生物地理学分析研究后，目前一般认为：种内变异的普遍标准是2％，即大于2％则为种间差异。本研究中，9种市售海马商品种的平均种间遗传距离为0.0853(8.53％)，是种内平均遗传距离0.0033(0.33％)的20倍以上，明显符合物种遗传分化的“标准序列阈值”，同时二者之间明显的差异，表明市售海马商品种线粒体COI基因既具有变异性也具有相对的稳定性，是非常符合DNA条形码的要求，是可以用于市售海马商品种的鉴定。
表11 9种市售海马商品药材种间平均遗传距离
H.trimac H.kel H.com H.kud H.ing H.barb H.queensla H.cf.f
H.kelloggi 0.1227
H.comes 0.1128 0.126
H.kuda 0.1380 0.071 0.136
H.ingens 0.1264 0.073 0.124 0.036
H.barbouri 0.1296 0.119 0.066 0.129 0.123
H.queensla 0.1349 0.070 0.126 0.090 0.083 0.1342
H.cf.fuscu 0.1296 0.066 0.129 0.022 0.027 0.1274 0.0880
H.mohnikei 0.1239 0.142 0.127 0.148 0.139 0.1356 0.1460 0.1416
表12 基于COI序列数据的9种市售海马商品药材种内不同个体的遗传距离
物种名 样品数 最小值 最大值 平均值
H.trimaculatus 1 \ \ \
H.kelloggi 3 0.0031 0.0062 0.0041
H.comes 1 \ \ \
H.kuda 10 0.000 0.0124 0.0043
H.ingens 1 \ \ \
H.barbouri 3 0.000 0.0108 0.0072
H.queenslandicus 3 0.0031 0.0062 0.0041
H.cf.fuscus 3 0.000 0.000 0.000
H.mohnikei 2 0.000 0.000 0.000
总计 27 0.000 0.0108 0.0033
3.4 分子系统发育树的构建
对物种进行有效鉴定的一个关键因素是：同一物种条形码序列是否能够在同一系统树上形成独立单系群。为了避免单一方法的运算方法产生的误差，本研究以K2P为模型，采用邻接法构建了NJ系统树、最大简约法构建了MP系统树以及ML系统树。NJ树采用D-Transitions+Transversions的方法计算，并进行自展检验1000次。同Genbank上下载的相关海马序列一起构建了NJ树(如图9、10)显示，9个市售海马商品种形成9个单系，同一商品种的不同个体严格聚在一起形成单系，且节点处支持率极高，自检举值均为99～100％。ML树、ME树与NJ树有相似的拓扑结构，因而证明了市售海马商品种线粒体COI基因在种内具有高度的保守性，同时在种间也具有明显的差异性，表明是可以用于市售海马商品种的鉴定。
从图10中，可以清楚的看到部分外观形态较为相似的品种，他们在一定程度上可以聚在一起形成一个大的分支，如：H.cf.fuscus、H.kuda和H.kelloggi三种、H.angustus和H.barbouri两种、H.kuda和H.reidi两种海马等，它们部分的COI基因列聚在一起形成一个单支，从而解释了COI基因相似度越高，亲缘关系越近，在外观形态上也越相似，所以在形态鉴定的初步研究中外观形态越相近不易鉴别的品种，其如：H.angustus、H.barbouri以及H.jayakari三者外观形态相近，其在关系发育树上越靠近。从而也说明了传统形态学在面对外观形态较为相似的海马品种时，无法进行准确鉴定分类，需要借助更为准确的手段辅助完成鉴定。同时也可以看到，部分外观鉴别特征较为明显、传统形态鉴定同DNA条形码鉴定结果一致的品种，其明显单独聚在一起成单支，如H.trimaculatus、H.queenslandicus。所以DNA条形码技术是建立在传统形态学基础上的，是对传统形态学进一步的完善，因此为了更好的对海马药材进行形态学研究需将传统形态学与DNA条形码研究有机的结合起来，为海马药材的研究奠定科学基础。
4、小结与讨论
在得到了市售海马商品药材种的线粒体COI基因序列后，对市售海马商品药材种COI基因的碱基组成、种内遗传距离、种间遗传距离进行了计算分析，采用K2P参数模型，用邻接法、最大简约法等分别构建了NJ、ML、MP分子系统数。研究结果表明：9种市售海马商品药材的COI基因碱基的A、T、G、C的平均含量分别为：25.8％、33.6％、17.7％和22.9％，其中A+T平均含量为59.4％明显高于G+C的平均含量40.6％，同时4种碱基中G的含量较其他3种碱基含量低得多，这一现象符合了脊椎动物线粒体DNA的特点；遗传距离结果显示，9种市售海马商品种的平均种间遗传距离为0.0853(8.53％)，种内平均遗传距离为0.0033(0.33％)，种间是种内遗传距离的20倍以上，这个种内、种间遗传距离二者之间明显的差异，表明市售海马商品种线粒体COI基因既具有变异性也具有相对的稳定性，是非常符合DNA条形码的要求，是可以用于市售海马商品种的鉴定；NJ树显示，9个市售海马商品种形成9个单系，同一商品种的不同个体严格聚在一起形成单系，且节点处支持率极高，自检举值均为99～100％。ML树、MP树与NJ树有相似的拓扑结构。3种方法得到的系统发育树均表明市售海马商品种的线粒体COI基因在种内具有高度的保守性，同时在种间也具有明显的差异性，表明DNA条形码是可以用于市售海马商品种的鉴定和我国海马的分类。
综上所述，以线粒体COI基因作为市售海马商品药材种的DNA条形码能够对9种市售海马商品药材进行有效的区别，且鉴定结果快速、准确。因此DNA条形码的实验结果完善了前期市售海马商品药材的传统形态鉴定结果，对前期因外观形态较为相似不能有效鉴别的商品种亦进行了准确的鉴别，如：前期根据外观形态鉴定有H.angustus、H.jayakari、H.barbouri3个市售商品种，DNA条形码研究结果则认为这3个商品种均为H.barbouri种；前期鉴定认为有H.erectus、H.kuda、H.algiricus3个市售海马商品种，DNA条形码研究结果则表明这3种均为H.kuda种。由此可以看出，在对市售海马鉴定分类方面，DNA条形码较传统形态鉴定具有突出的优势：准确、快速，不受物种外观形态的影响，其可以作为一种辅助传统形态鉴定和分类学的新型技术对海马的传统形态鉴定进行有效的补充和完善。
因此市售海马的DNA条形码研究，一方面可以根据研究结果结合分子系统学的研究方法进一步对我国市售海马的系统学进行研究，为我国海马的系统学和海马资源研究提供科学依据，为海马资源的生物多样性用和资源保护提供可靠依据；另一方面可以改善市售海马混乱的流通现状、加强海马药材质量标准的控制、加速海马药材质量标准的建立，同时提高了海马的临床用药安全。
实施例2
1、实验材料和试剂
药材：海马药材购于成都荷花池中药材市场，选取鉴别特征不明显或身体残破不全因而无法进行准确形态鉴定的海马药材作为样品进行实验，分别进行编号为：成都荷花池S01、成都荷花池S02、河北安国S03，具体情况如图11。
2、实验方法
2.1 总DNA提取
2.1.1 DNA提取
采用实施例1中的试剂盒法提取海马总DNA。
2.1.2 电泳检测
采用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10～20min，在全自动凝胶成像仪中对胶板进行拍照，结果如图12。
2.2 PCR扩增及测序
2.2.1 PCR扩增
PCR扩增的引物为FishF1、FishF2、FishR1和FishR2；其中，FishF1序列如Seq ID NO.1所示，即FishF1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；FishF2序列如Seq ID NO.2所示，即FishF2：5’-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’；FishR1序列如Seq ID NO.3所示，即FishR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；FishR2序列如Seq ID NO.4所示，即FishR2：5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’。
PCR扩增体系为25μl，其中，2×PCR Mix Master12.5ul，FishF1 1ul，FishF2 1ul，FishR1 1ul，FishR2 1ul，海马总DNA2ul，ddH2O补足至25ul。
PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；94℃0.5min；50℃0.5min；72℃1min；共35个循环；72℃延伸10min。
2.2.2 PCR结果检测
采用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10～20min，在全自动凝胶成像仪中对胶板进行拍照，结果见图13。
2.2.3 PCR产物测序
PCR扩增产物经纯化试剂盒(多功能DNA纯化回收试剂盒，百泰克公司)进行纯化回收，纯化产物直接送检用于序列测定，使用通用引物进行双向测序。
3、结果和数据分析
3.1测序结果分析
S01、S02、S03的部分COI碱基序列分别如Seq ID NO.5、Seq ID NO.6、Seq ID NO.7所示。在Genbanks进行Blast比对，得到：S01同Genbank中编号为GQ502153.1的海马种相似度达到99％，所以S01是H.kuda；S02、S03同Genbank中编号为GQ502167.1的海马种相似度达到99％、S02、S03所以是H.spinosissinus。
4、小结与讨论
在得到了市售海马商品药材种的线粒体COI基因序列后，对市售海马商品药材种COI基因的碱基组成(A＝25.8％,T＝33.6％,G＝17.7％,C＝22.9％)、种内平均遗传距离(0.0033)、种间平均遗传距离(0.0853)进行了计算分析，结果表明DNA条形码技术用于鉴定随机市售海马种是成功的，是可以用于随机市售海马种的鉴定和分类。
综上所述，以线粒体COI基因作为市售海马商品种的DNA条形码的标准基因能够对随机市售海马商品药材进行有效的区别，DNA条形码技术可以对市售海马种进行准备、快速的鉴定，从而建立了市售海马药材的DNA条形码鉴定技术。

Claims (7)

1.海马的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、提取海马总DNA；
b、PCR扩增：对海马总DNA进行PCR扩增，扩增产物为COI基因序列；
c、PCR产物测序；
d、序列比对，确定海马种类。
2.根据权利要求1所述的海马的鉴定方法，其特征在于：所述a步骤采用试剂盒法提取海马总DNA。
3.根据权利要求1所述的海马的鉴定方法，其特征在于：所述b步骤中PCR扩增的引物为FishF1、FishF2、FishR1和FishR2；其中，FishF1序列如Seq ID NO.1所示，FishF2序列如Seq ID NO.2所示，FishR1序列如Seq ID NO.3所示，FishR2序列如Seq ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的海马的鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增体系为25μl，其中，2×PCR Mix Master12.5ul，FishF1 1ul，FishF2 1ul，FishR1 1ul，FishR2 1ul，海马总DNA 2ul，ddH2O补足至25ul。
5.根据权利要求4所述的海马的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；94℃0.5min；50℃0.5min；72℃1min；共35个循环；72℃延伸10min。
6.根据权利要求1所述的海马的鉴定方法，其特征在于：在a、b步骤之间，还对海马总DNA进行电泳检测，其采用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10～20min。
7.根据权利要求1所述的海马的鉴定方法，其特征在于：在b、c步骤之间，还对PCR产物进行电泳检测，其采用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10～20min。
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