CN110484633B - 一种用于海马药材鉴定的引物、dna序列及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于海马药材鉴定的引物、DNA序列及鉴定方法，属于分子生物学领域，所述引物的序列如下：ATP6‑F：5'‑CAACCCCTTGAAACTGACAATGACA‑3'ATP‑R：5'‑GCTTGRATTATAGCAACGGCTACTTC‑3'。所述序列如SEQ ID NO：3‑68所示，或与SEQ ID NO：3‑68所示的序列具有至少99％序列同源性的序列。该方法可以实现对三斑海马、棘海马、太平洋海马、直立海马和鲍氏海马的准确鉴定。具体的说，本发明针对COI条形码在鉴定海马药材中的问题，引入一种以线粒体基因组中ATP6的DNA序列为基础的分子标记，为海马药材的种属鉴定提供一种快速、可靠和准确的新方法。

Description

一种用于海马药材鉴定的引物、DNA序列及鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种用于海马药材鉴定的引物、DNA序列及鉴定方法，属于分子生物学领域。
背景技术
海马作为传统的名贵中药材，具有温肾壮阳，散结消肿等功效，在药品保健品开发领域具有广阔的应用前景。我国是海马主要的消费地区，其每年的市场交易量在3000-4000万条之间，并呈逐年扩大的趋势。
海马是一种典型的多基原中药材品种，2015版《中国药典》规定的正品海马来源为线纹海马(Hip pocampus kelloggi)、刺海马(Hippocampus histrix)、大海马(Hippocampuskuda)、三斑海马(Hippoc ampus trimaculatus)或小海马(Hippocampusmohnikei)的干燥体，其基原动物均属海龙科海马属，亲缘关系较近，性状差异不明显，且《中国药典》对海马性状的描述较为笼统在实际鉴别应用过程中缺乏指导意义。市场上除药典规定的正品海马外，棘海马(Hippocampus spinosissimus)、太平洋海马(Hippocampusingens)、鲍氏海马(Hippocampus barbouri)和直立海马(Hippocampus erectus)等非药典品种也流动使用。
海马药材的正伪品亲缘关系较近，相互之间的性状相似点较多，其胸鳍和背鳍的鳍条数目等鉴定特征在海马药材干品中缺失，为药材品种的鉴别带来了更大的挑战。市场流通中商品海马无严格规范的分类销售标准，多根据棘刺长短、斑纹颜色及产地进行区分。此外，海马药材通常以药材粉末形式流通，难以使用传统鉴定方法区分海马品种，市售海马药材的掺伪掺假等现象日益加剧，为其临床用药带来了安全隐患。
DNA条形码是利用一段公认的短而标准的片段作为标记物对物种进行快速、准确的鉴定的新型分子生物学技术。COI条形码作为动物类药材分子鉴定的标准比对序列，在药材的分子鉴定和基原鉴别领域被广泛应用。但COI基因在鉴定海马药材等近亲缘物种过程中，会出现无法准确区分鉴定的情况。蒋超等通过COI条形码对市场上常见的海马品种进行分子鉴定，结果表明，单纯的COI条形码可准确区分大部分海马药材，但对亲缘关系较近的库达系海马无法准确区分品种(蒋超,刘富艳,金艳,等.基于形态和DNA序列分析的海马类药材商品基原调查[J].中国中药杂志,2018,43(23):4553.)。张改霞等通过COI对海马21个物种进行聚类分析，发现昆士兰海马与棘海马聚为一支，不能互相区分，提示对亲缘关系较近的海马样品需要开发新的分子标记物(张改霞,刘金欣,贾静,等.基于COI条形码的海马药材及其混伪品分子鉴定[J].中国药学杂志,2015,50(17):1469.)。以上结果说明，需要开发新的技术，对市售的海马药材进行准确的鉴定区分。
发明内容
本发明的目的是针对目前市场上海马药材的品种众多，且不同品种间缺乏有效的快速准确的鉴别手段的问题，提供一种海马药材鉴定的方法，该方法可以实现对三斑海马、棘海马、太平洋海马、直立海马和鲍氏海马的准确鉴定。具体的说，本发明针对COI条形码在鉴定海马药材中的问题，引入一种以线粒体基因组中ATP6的DNA序列为基础的分子标记，为海马药材的种属鉴定提供一种快速、可靠和准确的新方法。
本发明提供一种海马药材的基因片段，用于海马药材的准确鉴定。
本发明提供一种海马药材的ATP6基因的DNA序列，其包含如下SEQ ID NO：3-68所示的序列或与SEQ ID NO：3-68所示的序列具有至少99％序列同源性的序列。
本发明还提供一种海马药材的分子鉴定方法，包括以下步骤：
1)利用SDS裂解法提取待测海马药材的基因组DNA，保存于-20摄氏度；
2)采用ATP-F和ATP-R引物对步骤1)提取的基因组DNA作PCR扩增，
ATP-F：5'-CAACCCCTTGAAACTGACAATGACA-3'
ATP-R：5'-GCTTGRATTATAGCAACGGCTACTTC-3'；
3)扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，SYBR Green染色，观察DNA扩增结果；
4)对扩增获得的DNA片段进行回收和纯化；
5)将纯化后DNA片段做双向测序反应；
6)将测得DNA序列与SEQ ID NO：3-68作序列比对，计算遗传距离；
7)若比对结果表明，待测样品的ATP6序列与SEQ ID NO:3-13序列间的遗传距离小于或等于0.012，且ATP6序列与SEQ ID NO:14-68序列间的遗传距离大于或等于0.138，则待测海马样品就是三斑海马Hi ppocampus trimaculatus；
待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:14-25序列间的遗传距离小于或等于0.015，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-13和SEQ ID NO:26-68序列间的遗传距离大于或等于0.094，则待测海马样品就是棘海马Hi ppocampus spinosissimus；
待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:26-35序列间的遗传距离小于或等于0.0101，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-25和SEQ ID NO:36-68序列间的遗传距离大于或等于0.0597，则待测海马样品就是太平洋海马Hippocampus ingens；
待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:36-47序列间的遗传距离小于或等于0.013，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-35和SEQ ID NO:48-68序列间的遗传距离大于或等于0.1391，则待测海马样品就是直立海马Hippocampus erectus；
待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:48-55序列间的遗传距离小于或等于0.003，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-47和SEQ ID NO:56-68序列间的遗传距离大于或等于0.126，则待测海马样品就是鲍氏海马Hippocampus barbouri。
优选的，步骤2)所述PCR扩增体系为：反应总体系为50μL，其中10×PCR buffer 5μL，rTaq酶0.5μL，dNTP Mix 5μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 200ng，加超纯水补充至50μl。
优选的，步骤2)所述PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，48-53℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸15分钟。
本发明还涉及将上述分子鉴定的方法用于快速区分鉴别海马药材的用途。
本发明还涉及一种用于鉴定海马药材品种的引物，序列为：
ATP-F：5'-CAACCCCTTGAAACTGACAATGACA-3'
ATP-R：5'-GCTTGRATTATAGCAACGGCTACTTC-3'；
本发明的有益效果：
1.海马药材的《中国药典》收载品种和非收载品种的亲缘关系较近，而现有的COI条形码无法对亲缘关系较近的海马品种进行准确区分。与CO I序列相比，本发明所获得的的ATP6序列含有低的变异碱基数和丰富的信息内容，该基因具有种内差异小和种间差异大的特点。将待检测的海马样品的AT P6序列与本发明提供的序列进行比对，计算不同序列间的遗传距离，可以快速准确的判断海马样品的种类，为不同海马品种的后续开发利用奠定了基础。
2.本发明提供的ATP6基因的扩增引物，具有PCR扩增效率和测序成功率高的特点，鉴定方法操作简单，检测结果清晰准确。
附图说明
图1三斑海马与其他海马的遗传距离分析图
图2棘海马与其他海马的遗传距离分析图
图3基于ATP6条形码序列构建的棘海马及其他海马海龙的NJ树分析
图4太平洋海马与其他海马的遗传距离分析图
图5基于ATP6条形码序列构建的太平洋海马及其他海马海龙的NJ树分析
图6直立海马与其他海马的遗传距离分析图
图7基于ATP6条形码序列构建的直立海马及其他海马海龙的NJ树分析
图8鲍氏海马与其他海马的遗传距离分析图
图9基于ATP6条形码序列构建的鲍氏海马及其他海马海龙的NJ树分析
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1海马药材的基因组DNA提取
取海马药材的样品，用75％酒精擦拭尾部，剪取5mg尾部组织，置于EP管中，参照海洋动物DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，中国)说明书提取样本总DNA，将提取的样品置于-20℃冰箱，过夜。
实施例2ATP6条形码基因的扩增
ATP6是本发明根据海马属物种已知线粒体基因全序列，自行设计，具体序列信息如下：
正向引物ATP-F序列为：
5'-CAACCCCTTGAAACTGACAATGACA-3'，
反向引物ATP-R序列为：
5'-GCTTGRATTATAGCAACGGCTACTTC-3'。
PCR扩增反应均采用相同反应体系：反应总体系为50μL，超纯水32.5μL，10×PCRbuffer 5μL，rTaq酶0.5μL，dNTP Mix 5μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 5μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，48-53℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸15min。扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳后，通过凝胶成像系统(Bio-rad,USA)检测成像。将获得明亮单一条带的PCR扩增产物，送至上海桑尼生物科技有限公司进行双向测序。
实施例3三斑海马的ATP6条形码序列分析
本发明对三斑海马样品的ATP6基因进行了PCR扩增及测序，采用Mega7.0软件对三斑海马基因序列GC含量，碱基变异位点、信息位点和转换/颠换等进行分析，序列分析结果见表1。三斑海马的ATP6序列全长变化范围为603-605bp，GC平均含量为36.81％。对三斑海马的ATP6序列的单倍型数目和变异位点分析发现，不同的条形码序列存在丰富的单倍型多样性和变异率，其中ATP6序列存在11种单倍型，提示ATP6序列在三斑海马种内存在较大的遗传多样性，可用于后续的地理和群体遗传学研究。ATP6序列的变异位点百分比为2.487％，ATP6转换值和颠倒值分别为3和1(表1)。
如图1所示，通过对三斑海马及其混伪品的不同ATP6基因的序列遗传距离分析结果表明，三斑海马与四种正品海马(线纹海马、刺海马、大海马、小海马)和四种伪品海马(太平洋海马、虎尾海马、棘海马、直立海马)ATP6基因序列遗传距离变化范围均大于三斑海马种内序列遗传距离。基于ATP6序列分析表明，三斑海马的最大种内遗传距离显著小于最小的种间遗传距离，其中ATP序列三斑海马最大的种内遗传距离和最小种间遗传距离分别是0.012和0.138(大海马)，基于ATP序列的三斑海马最小种间遗传距离分别是其最大种内遗传距离的11.5倍，不存在条形码重叠部分，可用于准确区分三斑海马与其它海马品种。基于ATP6序列的平均种间遗传距离分别为0.158，远大于目前通用的COI序列的平均遗传距离(0.115)，提示ATP6基因在不同海马品种间的进化速率较CO I基因快，更适宜用于近亲缘物种的鉴定分析。
实施例4棘海马ATP6条形码序列分析
通过Blast对测序所得序列的准确性和方向进行检验，利用Bioedit对反向序列校正，删除上下游引物。通过MEGA 7计算分析序列的碱基组成、变异位点和信息位点，基于Kimura 2-Parameter(K2P)模型计算棘海马的种内距离以及和其他海马的种间距离，通过邻接Neighbor-Joining(NJ树)法构建系统发育进化树，Bootstap值设为1000重复，并分析物种间亲缘关系。
本发明对棘海马样品的ATP6进行了PCR和测序，利用MEGA 7对序列的碱基组成、变异位点、信息位点、颠换和转换进行分析，结果表明：棘海马样品的ATP6序列长度为602-603bp，GC碱基平均含量为35.37％。其中ATP6序列的GC碱基平均含量均低于AT碱基平均含量。ATP6序列存在16个变异位点，其序列在种内的变异率为2.653％，ATP6基因的变异位点中存在8个信息位点，其转换、颠换值分别为4和1，序列信息见表1。基于K2P参数模型，计算获得的棘海马样品和其他市场常见的正伪品海马样品中ATP6条形码序列的种内与种间遗传距离，结果如图2所示。基于ATP6序列的分析结果表明，棘海马的种内遗传变化范围为0-0.015，平均种内遗传距离为0.008，其最大的种间遗传距离分别出现在11号样品与03号、06号样品间，为0.015。棘海马ATP6基因在不同海马间的种间遗传距离变化范围为0.094-0.196，最小种间遗传距离和最大种间遗传距离分别出现在线纹海马与刺海马中，为0.094。棘海马与其他海马的最小种间遗传距离均远大于其最大种内遗传距离，存在明显的条形码间隔，提示可用于后续棘海马的分子鉴定研究。
为进一步明确不同DNA条形码序列对棘海马样品鉴别的准确度，本发明基于棘海马样品、其他10种正伪品海马和2种海龙样品的ATP6条形码序列构建了NJ系统发育树，进行聚类分析，见图3。基于ATP6构建的NJ系统发育树显示，棘海马样品单独聚为一个大分支，支持度均为100％，明显区分于其他海马海龙样品，说明ATP6条形码可用作棘海马的分子鉴别研究。在ATP6序列构建的NJ数中，棘海马首先与线纹海马聚为一支，支持度为76％，两者形成的亚群后与大海马、吻海马聚为一支，支持度68％。以上结果提示棘海马与药典正品海马线纹海马和大海马的亲缘关系较近，且棘海马与线纹海马的亲缘关系可能更近，与Wang等基于线粒体全序列构建的进化树的亲缘关系分析结果一致。以上结果提示可将棘海马作为药用海马的潜在替代品种用于后续的开发利用。本发明结果表明，ATP6条形码均可以准确鉴别棘海马与其他市场常见的海马品种，并可以作为鉴定海马药材地理来源的DNA条形码用于后续的应用。
实施例5太平洋海马的ATP6条形码序列分析
本发明对太平洋海马样品的ATP6序列进行扩增测序，利用MEGA7.0比较序列的碱基组成、GC含量、变异位点、信息位点等信息；基于K2P模型计算太平洋海马的种内和种间遗传距离，NJ法构建太平洋海马与常见市售海马(三斑海马、直立海马、棘海马、小海马、线纹海马、大海马、刺海马)的系统聚类树。结果表明：太平洋海马的ATP6长度为603bp，GC碱基平均含量为36.58％。ATP6序列存在12个变异位点，其序列在种内的变异率为1.990％，ATP6基因的变异位点中存在7个信息位点，转化值为4，不存在颠倒现象(见表1)。
如图4所示，基于太平洋海马ATP6序列计算的种内种间遗传距离结果表明，ATP6序列最大种内遗传距离为0.0101。太平洋海马与其它7种正伪品海马的种间遗传距离分析结果表明，ATP6序列与大海马的种间遗传距离最小0.0597，太平洋海马的最小种间遗传距离是最大种内遗传距离的5.91倍，存在条形码间隔，可应用于后续太平洋海马的分子鉴定研究。
如图5所示，基于ATP6构建的NJ系统发育树显示，太平洋海马样品单独聚为一个大分支，支持度达100％，能与其他海马海龙样品明显区分。后与大海马聚为一支，支持率为100％，提示太平洋海马与大海马的亲缘关系较近，为市面上常用太平洋海马替代大海马提供了依据。在太平洋海马大分支中存在7个分支，支持率均在50％以上。本发明结果表明，ATP6基因可以作为鉴定海马药材地理来源的DNA条形码，用于后续开发研究。
实施例6直立海马的ATP6条形码序列分析
本发明对直立海马的ATP6序列进行PCR扩增和双向测序，采用Mega7软件对直立海马基因序列GC含量，碱基变异位点、信息位点和转换/颠换等进行分析，序列分析结果见表1。直立海马ATP6基因序列的长度为603bp-604bp，GC碱基平均含量为39.67％，GC碱基平均含量低于AT碱基平均含量。AT P6序列在直立海马样品中存在4种单倍型，8个变异位点，变异率为1.32％，其转换值为3，不存在颠倒现象(见表1)。。
如图6所示，基于K2P参数模型，计算获得的直立海马样品和其他市场常见的正伪品海马样品中ATP6条形码序列的种内与种间遗传距离。结果显示，ATP6基因序列的种内遗传距离变化范围为0-0.013，平均种内遗传距离为0.004。与其他海马品种的种间遗传距离变化范围为0.155-0.208，平均种间遗传距离为0.175。最小种间遗传距离(0.155)是其最大种内遗传距离(0.013)的11.9倍，大于10倍，不存在条形码重叠部分。
为进一步明确COI和ATP6条形码对直立海马样品鉴定的准确性，本发明通过构建直立海马及其他海马海龙样品相应条形码的NJ系统发育树，并对其进行分析。如图7所示，基于ATP6基因序列构建的NJ树显示，12个直立海马样品单独聚为一个大分支，且分支支持率为99％，明显与其他海马物种区分，且其他海马物种各自聚成一个小分支，形成良好的单系性，说明ATP6条形码序列均可作为直立海马与其他海马的鉴别基因条形码。其中，线纹海马与棘海马、大海马和太平洋海马聚为一支的Boot sharp值为66％，表明NJ结构稳定性好，提示直立海马与药用正品海马的亲缘关系较为接近，且可信度较高，该结果提示后期直立海马可以作为药用海马的潜在替代品进行开发研究。
实施例7鲍氏海马的ATP6条形码序列分析
本发明对鲍氏海马的ATP6基因序列进行了PCR扩增和双向测序，采用Mega 7软件对ATP6序列的GC含量，碱基变异位点、信息位点和转换/颠换等进行分析，序列分析结果见表1。结果表明，ATP6序列全长603bp，GC碱基平均含量为35.53％，GC碱基平均含量低于AT碱基平均含量。ATP6序列在鲍氏海马样品中存在3种单倍型，2个变异位点，变异率为0.33％，变异位点中存在一个信息位点，其转换值为1，不存在颠倒现象(见表1)。
将获得的8个鲍氏海马样品和其他正伪品海马样品的ATP6基因的序列进行分析，如图8所示，基于K2P参数模型计算分析鲍氏海马ATP6条形码序列的种内与种间遗传距离变化情况，研究结果表明，基于ATP6序列的鲍氏海马种内遗传距离为0-0.003，与其他7种海马品种间的种间遗传距离范围为0.126-0.174，种间最小遗传距离(0.126)是其最大种内遗传距离(0.003)的42倍，不存在条形码重叠部分，可用于准确区分鲍氏海马与其他7种常见的海马正伪品。
为进一步明确不同条形码序列在鲍氏海马和其他海马正伪品样品间的鉴别能力，本文以K2P为参数模型，基于ATP6序列采用邻接法构建鲍氏海马、其余7种正伪品海马以及2种海龙的NJ聚类树，并通过bootstrap(1000次重复)检验各分支支持率。如图9所示，基于ATP6序列构建的NJ树中，8个鲍氏海马样本单独聚成一个大分支，明显区分于其他海马品种，且节点支持率为100％，说明ATP6条形码对鲍氏海马分子鉴定的准确性好，可信度高。
表1ATP6条形码序列分析结果表
Figure GDA0004144055280000071
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表信息:
DTD版本: V1_3
文件名: 一种用于海马药材鉴定的引物、DNA序列及鉴定方法.xml
软件名称: WIPO Sequence
软件版本: 2.2.0
生成日期: 2023-03-24
基本信息:
当前申请 / 知识产权局: CN
当前申请 / 申请号: 201910753225.7
当前申请 / 申请日: 2019-08-15
当前申请 / 申请人档案名: 2019
申请人姓名或名称: 浙江中医药大学
申请人姓名或名称 / 语言: zh
申请人姓名或名称 / 拉丁名称: Zhejiang Chinese Medical University
发明名称: 一种用于海马药材鉴定的引物、DNA序列及鉴定方法 ( zh )
序列总量: 68
序列:
序列号 (ID): 1
长度: 25
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..25
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
残基:
caaccccttg aaactgacaa tgaca 25
序列号 (ID): 2
长度: 26
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..26
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
残基:
gcttgratta tagcaacggc tacttc 26
序列号 (ID): 3
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus trimaculatus
残基:
ctaagctttt ttgaccaatt ttctagccct atattcttag gaatccctttaatagcttta 60
gctattataa tcccatgaat tatattcccg actccctctt ctcgctgaataaataaccgc 120
ttactcacac tacaaaactg atttattaac ttatttacaa aacaacttcttctccctcta 180
aacacaacag gtcataaatg agcattaatt ttcgcatctt taataattttcctaattact 240
ttaaacatat taggactcct tccctatact ttcaccccca caacccaattatcattaaac 300
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acacactcct taggacacct attaccagaa ggaacgccag taccattaatccccgtactt 420
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> organism, Hippocampus barbouri
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> organism, Hippocampus barbouri
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> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus barbouri
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> organism, Hippocampus kelloggi
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序列号 (ID): 57
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus kelloggi
残基:
ttaagctttt ttgaccaatt tattagcccc atatttttag gtatcccattaatagcttta 60
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序列号 (ID): 58
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus kelloggi
残基:
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atgcttacat tacaaaactg gtttattaac ttatttacaa aacaactccttctcccttta 180
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ttaaatatac ttggattact tccctacacc ttcaccccta caactcaattatccctaaat 300
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序列号 (ID): 59
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus kuda
残基:
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atacttacac tacaaaactg atttattaac ttatttacaa aacaacttcttctcccttta 180
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ttg 603
序列号 (ID): 60
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus kuda
残基:
ttaagctttt ttgaccaatt tattagtccc atatttttag gcattccattaatagctttg 60
gctattataa tcccttgaat tatattcccc accccttctt cccgctgaataaacaaccgc 120
atacttacac tacaaaactg atttattaac ttatttacaa aacaacttcttctcccttta 180
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序列号 (ID): 61
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus mohnikei
残基:
ttaagctttt ttgaccaatt ttctagtcct gtgtttttag gaatccctttaatagcttta 60
gctattataa ttccatgaat catattccca accccctcct ctcgttgaataaataatcgt 120
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gcaaatttaa ccgcaggaca cttacttatt caacttatcg caacagcagcctttgtccta 540
atacctttaa tacctacagt tgcattatta acaacaattt tattattcctgttaacactc 600
tta 603
序列号 (ID): 62
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus mohnikei
残基:
ttaagctttt ttgaccaatt ttctagtcct gtgtttttag gaatccctttaatagcttta 60
gctattataa ttccatgaat catattccca accccctcct ctcgttgaataaataatcgt 120
atgcttacat tacaaaactg atttattaac ttatttacaa aacagctactcctccccctt 180
aacacagcag gtcataaatg agcattaatt ttcgcatcgc taataattttcttaatctcc 240
ctaaacatat taggattact cccttacacc ttcaccccaa caacccagctgtcattaaat 300
ataggactag ctgtaccatt atgactagca accgttatta tcgggatacgaaatcaacct 360
acacattctt taggccatct attaccagaa ggcacacctg taccactaatccccgtactt 420
attattatcg agacaattag cctctttatt cgacctattg ccctaggcgtccgactaaca 480
gcaaatttaa ccgcaggaca cttacttatt caacttatcg caacagcagcctttgtccta 540
atacctttaa tacctacagt tgcattatta acaacaattt tattattcctgttaacactc 600
tta 603
序列号 (ID): 63
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus histrix
残基:
ctaagctttt ttgaccaatt ctctagtccc atgtttctag gaatcccactaatagcttta 60
gctattataa ttccttgaat tatattcccc accccttctt ctcgttgaattaataaccgt 120
gtgctcacac tacaaaactg atttattaat ttatttacaa aacaacttctccttcctctc 180
aacatagcag gtcataaatg agcattaatt ttcgcatccc taataatcttcttaatctcc 240
ataaacatac tagggctgct tccctacacc ttcaccccta caacccaactatcattaaat 300
ataggattag ctgtaccttt gtgactagca actgttatta tcggaatacgaaaccaacca 360
acacactctc taggccactt actaccagaa ggcacacctg tgccactaatccctgtactt 420
atcatcattg aaacaattag tttatttatt cgacctattg ccctaggtgttcgacttaca 480
gcaaatttaa ccgcaggaca cctactcatc caactcattg caacagcagcatttgtacta 540
atgccgttaa tacctacaat tgctctacta acaacaacat tgctattcctactaacacta 600
ctg 603
序列号 (ID): 64
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus histrix
残基:
ctaagctttt ttgaccaatt ctctagtccc atgtttctag gaatcccactaatagcttta 60
gctattataa ttccttgaat tatattcccc accccttctt ctcgttgaattaataaccgt 120
gtgctcacac tacaaaactg atttattaat ttatttacaa aacaacttctccttcctctc 180
aacatagcag gtcataaatg agcattaatt ttcgcatccc taataatcttcttaatctcc 240
ataaacatac tagggctgct tccctacacc ttcaccccta caacccaactatcattaaat 300
ataggattag ctgtaccttt gtgactagca actgttatta tcggaatacgaaaccaacca 360
acacactctc taggccactt actaccagaa ggcacacctg tgccactaatccctgtactt 420
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序列号 (ID): 65
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus comes
残基:
ctaagcttct tcgaccaatt ctctagtccc atatttttag gaatcccattaatagcttta 60
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gcaaatttaa ctgcaggaca cttacttatc caacttattg caacagcagcattcgtgcta 540
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序列号 (ID): 66
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分子类型: DNA
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- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus comes
残基:
ctaagcttct tcgaccaatt ctctagtccc atatttttag gaatcccattaatagcttta 60
gctattatac ttccttgaat catatttcct accccctcct ctcgttgaatcaataatcgc 120
atactcacac tacaaaactg atttatcaac ttatttacaa aacaacttctcctccctcta 180
aatacagcag gtcataaatg agcattaatt tttgcatctt taataattttcctaatctcc 240
ctaaacatat taggattact tccctacacc ttcaccccta caacccagctatcattaaac 300
ataggactag ccgtaccttt atgactagca actgttatta ttgggatacgaaatcaacca 360
acacactctc taggccatct actaccagaa ggcacacctg tgccactaatccctgtactt 420
attattattg aaacaattag cctatttatt cgacctattg ccctaggcgttcgactaaca 480
gcaaatttaa ctgcaggaca cttacttatc caacttattg caacagcagcattcgtgcta 540
atgccgttaa tacccacaat tgcattatta acaacagttt tattattcttactaacatta 600
ttg 603
序列号 (ID): 67
长度: 602
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..602
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus comes
残基:
ctaagttttt cgaccaattc tctagtccca tatttttagg aatcccattaatagctttag 60
ctattatact tccttgaatc atatttccta ccccctcctc tcgttgaatcaataatcgca 120
tactcacact acaaaactga tttatcaact tatttacaaa acaacttctcctccctctaa 180
atacagcagg tcataaatga gcattaattt ttgcatcttt aataattttcctaatctccc 240
taaacatatt aggactactt ccctacacct tcacccctac aacccagctatcattaaaca 300
taggactagc cgtaccttta tgactagcaa ctgttattat tgggatacgaaatcaaccaa 360
cacactctct aggccatcta ctaccagaag gcacacctgt gccactaatccctgtactta 420
ttattattga aacaattagc ctatttattc gacctattgc cctaggcgttcgactaacag 480
caaatttaac tgcaggacac ttacttatcc aacttattgc aacagcagcattcgtgctaa 540
tgccgttaat acccacaatt gcattattaa caacagtttt attattcttactaacattat 600
tg 602
序列号 (ID): 68
长度: 603
分子类型: DNA
特征 位置/限定符:
- source, 1..603
> mol_type, genomic DNA
> organism, Hippocampus comes
残基:
ctaagcttct tcgaccaatt ctctagtccc atatttttag gaatcccattaatagcttta 60
gctattatac ttccttgaat catatttcct accccctcct ctcgttgaatcaataatcga 120
atactcacac tacaaaactg atttatcaac ttatttacaa aacaacttctcctccctcta 180
aatacagcag gtcataaatg agcattaatt tttgcatctt taataattttcctaatctcc 240
ctaaacatat taggattact tccctacacc ttcaccccta caacccagctatcattaaac 300
ataggactag ccgtaccttt atgactagca actgttatta ttgggatacgaaatcaacca 360
acacactctc taggccatct actaccagaa ggcacacctg tgccactaatccctgtactt 420
attattattg aaacaattag cctatttatt cgacctattg ccctaggcgttcgactaaca 480
gcaaatttaa ctgcaggaca cttacttatc caacttattg caacagcagcattcgtgcta 540
atgccgttaa tacccacaat tgcattatta acaacagttt tattattcttactaacatta 600
ttg 603
END

Claims (3)

1.一种海马药材的分子鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)用SDS裂解法提取待测海马药材的基因组DNA，保存于-20摄氏度；
2)采用ATP-F和ATP-R引物对步骤1)提取的基因组DNA作PCR扩增；
ATP-F：5'-CAACCCCTTGAAACTGACAATGACA-3'
ATP-R：5'-GCTTGRATTATAGCAACGGCTACTTC-3'；
3)扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，SYBRGreen染色，观察DNA扩增结果；
4)对扩增获得的DNA片段进行回收和纯化；
5)将纯化后DNA片段做双向测序反应；
6)将测得ATP6序列与SEQ ID NO：3-68作序列比对，计算遗传距离；
7)根据比对结果，判定待测海马样品的种类；
待测样品的ATP6序列与SEQ ID NO:3-13序列间的遗传距离小于或等于0.012，且ATP6序列与SEQ ID NO:14-68序列间的遗传距离大于或等于0.138，则待测海马样品就是三斑海马Hippocampustrimacu latus；
待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:14-25序列间的遗传距离小于或等于0.015，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-13和SEQ ID NO:26-68序列间的遗传距离大于或等于0.094，则待测海马样品就是棘海马Hi ppocampusspinosissimus；
待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:26-35序列间的遗传距离小于或等于0.0101，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-25和SEQ ID NO:36-68序列间的遗传距离大于或等于0.0597，则待测海马样品就是太平洋海马Hippocampusingens；
待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:36-47序列间的遗传距离小于或等于0.013，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-35和SEQ ID NO:48-68序列间的遗传距离大于或等于0.155，则待测海马样品就是直立海马Hippocampuserectus；
待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:48-55序列间的遗传距离小于或等于0.003，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-47和SEQ ID NO:56-68序列间的遗传距离大于或等于0.126，则待测海马样品就是鲍氏海马Hippocampusbarbouri。
2.根据权利要求1所述海马药材的分子鉴定方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增体系为：反应总体系为50μL，其中10×PCRbuffer5μL，rTaq酶0.5μL，dNTPMix5μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA200ng，加超纯水补充至50μl。
3.根据权利要求1所述海马药材的分子鉴定方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，48-53℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸15分钟。
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