CN107365839B

CN107365839B - 一种用于鹿科动物鉴定的引物及其应用

Info

Publication number: CN107365839B
Application number: CN201710551069.7A
Authority: CN
Inventors: 陈星�; 白加德; 宣晶; 刘艳菊; 张树苗; 李俊芳; 段建彬
Original assignee: Beijing Milu Ecological Experiment Center
Current assignee: Beijing Milu Ecological Experiment Center
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2017-07-07
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2037-07-07
Also published as: CN107365839A

Abstract

本发明提供了一种用于鹿科动物鉴定的引物及其应用。本发明的引物包括第一引物与第二引物，其中，第一引物为15～40bp且包括如SEQ ID No.1所示序列中的至少15bp的片段；第二引物为15～40bp且包括如SEQ ID No.2所示序列中的至少15bp的片段。本发明的引物对鹿科动物特异性较好，产物片段长度合适，并有很好的扩增效率，很好的解决了同类研究中扩增困难、容易得到错误序列信息的问题。

Description

一种用于鹿科动物鉴定的引物及其应用

技术领域

本发明是关于一种用于鹿科动物鉴定的引物及其应用。

背景技术

DNA条形编码(DNA Barcoding)技术是一种新的生物分类方法，它是分子生物学和生物信息学相结合的产物。这一概念认为，对地球上每一种生物能通过快速分析其DNA中的一小段加以识别。在最近几年里，该技术已成为生物分类学中研究的热点，在生物分类鉴定中具有重要作用，线粒体细胞色素C氧化酶I亚基(mtCOI)作为动物界DNA条形码的推荐序列在不同研究者和研究类群中得到了广泛的应用。

2009年以后，随着DNA提取技术、PCR技术及高通量测序技术的发展，特别是DNA条形码技术的推广和应用，广泛认可作为DNA条形码技术首选的线粒体COI基因被大量应用于国内对于鹿科动物的研究中。

在鹿科动物的亲缘关系研究中，连虹(2009)对我国的16种珍稀濒危野生动物进行了DNA条形码研究，范围涵盖鹿科、麝科、牛科、骆驼科(Camelidae)和马科(Equidae)，共计15属。基于655bp和404bp两段COI序列分析，讨论了鹿科动物与其他近源物种的系统发育关系。

在药材快速鉴定方面，COI基因作为DNA条形码的推荐序列，也被广泛应用于鹿科动物，如鹿茸饮片(张蓉等，2011；崔丽娜等，2012)、鹿类动物中药材(刘冬等，2014)。

此外，鹿科动物及其相关制品作为贸易品具有广泛的应用市场，其中不乏各种混伪品，传统方法往往难以辨别或需要较长时间的专业训练，因此，能够进行快速鉴定的DNA条形码技术在此类研究中得到了广泛的应用(Cai et al.，2015；Luo et al.，2013)。

蛋白质分析、PCR技术、DNA测序技术等新技术出现后，分子系统学及DNA分子技术的快速发展，对原有的形态学理论产生了质疑。Emerson&Tate(1993)用蛋白电泳分析了鹿亚科4个属10个种和亚种的进化关系，提出了新的观点，他们认为麋鹿属(Elaphurus)与鹿属(Cervus)关系较近，而鹿属中的水鹿(C.unicolor)与黇鹿属(Dama)和斑鹿属(Axis)的关系比其与鹿属其他种的关系更近。而Randi et al.(2001)基于mtDNA的D-loop全序列分析，探讨了鹿亚科(Cervinae)、麂亚科(Muntiacinae)25个种和亚种的系统发生关系。Polziehn&Strobeck(2002)基于mtDNA控制区的DNA序列对传统分类所建立的马鹿(C.elaphus)各个亚种进行了系统发育分析，认为传统分类上的马鹿并不是一个单系类群，应分为主要分布于欧洲、北非至中亚地区的赤鹿(欧洲马鹿)(C.elaphus)和分布于北美及东亚及西伯利亚地区的马鹿(加拿大马鹿)(C.canadensis)，前者在我国仅有塔里木赤鹿(C.elaphus yarkandensis)一个亚种。Hassanin et al.(2012)对现生鲸偶蹄目(Cetartiodactyla)物种的210条mtDNA完成全长测序，包含107属183种，并基于mtDNA全长序列重建了现生鲸偶蹄目物种的系统发育树，明确了进化分歧事件，并通过分子钟校正估算了演化时间。其结果显示鹿科动物与麝科(Moschidae)、牛科(Bovidae)有较近的亲缘关系，这一分支约在晚渐新世至早中新世由鲸偶蹄目分出，而麝科与牛科动物亲缘关系较近，且不同于传统分类学观点，认为麝科较鹿科晚分化，属于较进化的类群。

国内早期对鹿科动物分子水平的研究主要集中在线粒体DNA的细胞色素b基因(cytb)片段上，如李明等(1999)从水鹿、坡鹿、梅花鹿和马鹿等四种鹿属动物中探讨鹿属动物的系统进化关系：分别扩增出线粒体DNA的细胞色素b基因片段，并测定得到367bp的碱基序列，它们之间的序列差异在4.09％～7.08％之间。用NJ法、最大简约法和最大似然法进行分子系统进化树的构建和分析并得出，水鹿与坡鹿、梅花鹿和马鹿约在240～280万年前分化的，梅花鹿和马鹿大约在160万年前左右分化。2003年刘向华等根据cytb基因序列分析，探讨了鹿亚科及中国鹿属、马鹿亚种的进化关系。结果分析表明：现行分类系统中，斑鹿属可能并非单系发生，暗示应将豚鹿并入鹿属；麋鹿属与鹿属有较近的进化关系，也应并入鹿属；黇鹿属的进化地位有待进一步研究；归并后的鹿属为单系发生。中国马鹿各亚种在系统发生上是一单系群，其中马鹿天山亚种和阿尔泰亚种聚为最原始的一支。

截至2013年9月1日的数据库查询结果表明，鹿科动物的DNA条形码样本数据量已有了极大的增长。已有55类鹿科动物(种、亚种，包括部分异名)421条有效的DNA条形码信息(含3个物种的cytb序列信息)，其中真鹿亚科9属32类(种、亚种，包括部分异名)共计173条有效DNA条形码信息(COI序列大于500bp)。

COI基因的通用引物在鹿科动物中存在扩增困难的现象，许多文献都对此有记载(连虹，2009；张蓉et al.，2011)，没有鹿科动物专一性引物，没有相关试剂盒应用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于鹿科动物快速鉴定的特异性引物。

本发明的另一目的在于提供所述引物的应用。

一方面，本发明提供了一种引物，其包括第一引物与第二引物，其中，第一引物为15～40bp且包括如SEQ ID No.1所示序列中的至少15bp的片段；第二引物为15～40bp且包括如SEQ ID No.2所示序列中的至少15bp的片段。

SEQ ID No.1(5’-3’)：TATTTGGTGCCTGAGCAGGCATAGTCGGAACAGCC；

SEQ ID No.2(5’-3’)：GGTGACCAAAGAATCAGAACAAGTGTTGATA。

本发明的引物对鹿科动物特异性较好，产物片段长度合适，并有很好的扩增效率，很好的解决了同类研究中扩增困难、容易得到错误序列信息的问题。

根据本发明的具体实施方案，本发明的引物，其中，第一引物具有如SEQ ID No.1所示序列，或者为在SEQ ID No.1所示序列中经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸且与SEQ ID No.1具有相同功能的由SEQ ID No.1衍生的核苷酸序列。

根据本发明的具体实施方案，本发明的引物，其中，第二引物具有如SEQ ID No.2所示序列，或者为在SEQ ID No.2所示序列中经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸且与SEQ ID No.2具有相同功能的由SEQ ID No.2衍生的核苷酸序列。

根据本发明的具体实施方案，本发明的引物，为具有SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示序列的引物对。

本发明的特异性引物对，是基于Genbank已公布的马鹿(Cervus elaphus)(NC_007704)、梅花鹿(Cervus nippon)(NC_006993)的线粒体DNA全长序列及麋鹿(Elaphurusdavidianus)COI基因的片段序列信息(KF509972，KF5099733)等多个不同物种的相关序列总结设计，能够针对不同鹿科动物进行扩增，并都具有良好的扩增效果，扩增片段长度在600bp左右，可支持DNA条形码研究的应用。所述特异性引物对可用于辅助进行鹿科动物相关材料(如鹿角、中药饮片、化石材料等)的物种鉴定。

从而，另一方面，本发明还提供了所述引物在鉴定鹿科动物中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述引物在制备鹿科动物鉴定DNA条形码或检测试剂盒中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述引物和/或所述引物的目标序列在构建鹿科动物物种分子系统树中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种DNA片段(探针)，其是以鹿科动物的COI基因为模板，用本发明所述的引物进行PCR扩增得到的。优选地，所述DNA片段包括标记或未标记的SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8中的一种或多种。各具体序列参见后文及序列表。在本发明的一具体实施方案中，所述DNA片段，其是以鹿科动物的COI基因为模板，用本发明所述的特异性引物对进行PCR扩增得到的分子标记COI。所述的DNA片段可条码化，得到对应的图像化条形码。

另一方面，本发明还提供了一种鹿科动物鉴定试剂盒，其包括本发明的特异性引物和/或所述的DNA片段(探针)或图像化条形码，也可进一步包括所建立的分子系统树(可以是以参照说明书的方式呈现)。

另一方面，本发明还提供了一种鹿科动物物种分子系统树，其是以本发明的特异性引物和/或所述引物的目标序列为依据构建的。在本发明的一具体实施方案中，所建立的分子系统树如图2所示。

另一方面，本发明还提供了一种检测待测样品中鹿科动物成分的方法，该方法包括：

从待测样品中提取总DNA；

以所提取的总DNA为模板，利用权利要求1或2所述的引物进行PCR扩增；

对上述扩增结果进行分析判断。

根据本发明的具体实施方案，本发明的检测待测样品中鹿科动物成分的方法，其中，所述待测样品来自需要鉴别是否含有鹿科动物成分和/或需鉴定鹿科动物物种的药材(如鹿角、血液或组织)、中药制剂(中药饮片)，或者化石材料。

根据本发明的具体实施方案，本发明的检测待测样品中鹿科动物成分的方法，其中，所述扩增条件为：94℃预变性6min；94℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

根据本发明的具体实施方案，本发明的检测待测样品中鹿科动物成分的方法，其中，所述对上述扩增结果进行分析判断的过程包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物。

根据本发明的具体实施方案，本发明的检测待测样品中鹿科动物成分的方法还包括：

将待测混合物样品的扩增结果与所述的DNA片段(探针)、或者所述的图像化条形码进行比较，分析判断所测混合物中是否存在鹿科动物成分和/或鉴定鹿科动物物种。

根据本发明的具体实施方案，本发明的检测待测样品中鹿科动物成分的方法当用于鉴定鹿科动物物种时，优选地，可结合所述的分子系统树进行鉴定。

本发明的技术，在以下领域具有特别重要的意义：

(1)获得麋鹿的特异性DNA标记

麋鹿(Elaphurus davidianus)作为我国特有的真鹿亚科动物之一，由于其特殊的形态特征在目前的分类系统中被分作与鹿属(Cervus)并列的单种单属动物，而在后期对麋鹿与其它鹿属动物的蛋白质及核酸的分子标记中均有研究表明在进化关系上麋鹿属与鹿属的关系较近，建议将麋鹿属并入鹿属(Emerson&Tate，1993；刘向华，2003)。麋鹿作为中国的特有种，由于人类的猎捕和环境变迁，麋鹿于1900年中国境内地理灭绝，后经海外输出、重引进等项目，至今中国境内重新繁衍到2000余只的数量，麋鹿基因保存及种群繁衍上必有其自身的特点。本发明的技术，可获得麋鹿的特异性DNA标记，进一步开展麋鹿历史进化及亲缘关系方面的研究，研究其进化规律，势必更好的推动麋鹿保护事业的发展。

(2)对中国真鹿亚科动物系统进化提供分子水平证据

世界范围内真鹿亚科共有4个属，各属间和属内特别是鹿属内的系统进化关系存在疑议(刘向华等，2003)。中国的鹿属动物包括五个种，即水鹿(Cervus unicolor)、坡鹿(C.edli)、白唇鹿(C.albirostris)、梅花鹿(C.nippon)和马鹿(C.elaphus)。由于鹿属动物能以现代的种代表其系统进化各个阶段种的进化过程(费罗辽夫，1957)，因而在进化学研究中是进化形式和进化过程研究的良好材料。而中国是鹿属动物的进化舞台,各种及各亚种的发展进化舞台遍布于整个中国(大泰司纪之，1992)，因此对中国的鹿属动物的系统进化研究有着重要的理论意义。由于中国的鹿属动物所处的特殊地位,引起了众多学者的极大兴趣。本发明通过对中国真鹿亚科内鹿科动物线粒体细胞色素C氧化酶I亚基(mt COI)这一特定基因的特定区段为研究对象，从分子生物学角度，为中国真鹿亚科动物的系统进化研究提供分子水平的证据。

(3)对骨质文物材质鉴定及远古时期麋鹿野生种群的地理分布提供证据

已出土的野生麋鹿化石表明，麋鹿起源于距今200多万年前，距今约1万年前到距今约3000年时最为昌盛，中国境内无论是麋鹿化石点的数目或某个化石点的标本数量都极为丰富，特别是麋鹿骨及麋鹿角均为古人所青睐，现已发现西周中期就有麋鹿骨戈等文物的出现。但是众多鹿角及鹿骨被做成箭簇等冷兵器或佩带饰物等制品因形态的改变，无法鉴定文物材质的具体种类，采用本发明的成果可以在文物破坏最小的限度内，采取微量级样品，鉴定文物的材质种类。这些文物的分布为远古时期麋鹿野生种群的地理分布提供了最详实的证据。

(4)对刑事案件的物证做司法鉴定，为野生动物保护刑事案件提供科学依据

麋鹿为国家一级保护野生动物，国家野生动物保护法禁止买卖交易或食用，通过采用本发明的麋鹿DNA分子标记成果，与刑事案件的物证做分子比对，以鉴定该物证材料来源。

(5)对中药材进行分子鉴定，为药材流通、市场管理提供有效手段

鹿茸、鹿角、鹿鞭、鹿尾、鹿胎、鹿筋、鹿骨等为我国常用市售中药材。但不同鹿的药效不同，麋鹿滋阴，梅花鹿壮阳；即使同等药效不同鹿种间的药力也不尽相同，因资源有限，市场上出现以次充好，使用其他动物充当鹿茸、鹿角药材出售的现象；同时，市场上同物异名，或异物同名的现象带来药材市场所售药材的混乱；部分鹿场为提高鹿茸产量，对不同鹿科动物种间进行杂交，带来物种品系的混乱。可通过鹿科动物DNA分子标记成果，对鹿类动物中药材进行分子鉴定，为药材流通、市场管理提供有效手段。

总而言之，本发明设计了鹿科动物COI基因片段特异性引物；本发明设计的引物序列较长，对鹿科动物特异性较好，产物片段长度合适，并有很好的扩增效率(可详见图1B扩增电泳结果)，很好的解决了同类研究中扩增困难、容易得到错误序列信息的问题。

附图说明

图1A与图1B为采用通用引物及本发明的特性性引物PCR扩增产物电泳检测结果。其中：泳道1-25为麋鹿(Elaphurus davidianus)，泳道26-40为梅花鹿(Cervus nippon)，泳道41-47为黇鹿(Dama dama)，泳道48-51为马鹿(Cervus elaphus)，泳道52为阴性对照，Maker为DL5000marker(TAKARA BIO Inc.，Japan)，片段大小依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100。

图2为利用本发明的引物基于最大似然法(Maximum Likelihood Method)构建的鹿科动物分子系统树示意图。

图3为利用本发明的引物扩增并筛选得到的识别麋鹿的图像化DNA条形码。

图4为利用本发明的引物扩增并筛选得到的识别梅花鹿的图像化DNA条形码。

图5为利用本发明的引物扩增并筛选得到的识别马鹿的图像化DNA条形码。

图6为利用本发明的引物扩增并筛选得到的识别黇鹿的图像化DNA条形码。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。

实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件；

实施例中所用到的各种化学试剂均可商购获得，所用引物委托合成。

实施例1用于鉴定鹿科动物的特异性引物对

基因组DNA提取按照Sambrook&Russel(2001)的方法或按天根血液基因组提取试剂盒(DP318，天根生化科技(北京)有限公司)的说明书进行。

用移液器移取所得DNA溶液1μl，经由微量紫外分光光度计

ND-1000(NanoDrop Technologies,Inc.，USA)进行DNA浓度测定，并通过A_260/280的吸收率比值判断DNA纯度。

PCR反应体系(50μl)成分及含量见表1。

表1 PCR反应体系

PCR反应在Bio-rad My Cycler PCR仪上完成(Bio-Rad Laboratories,Inc.，USA)，反应程序为：先以94℃预变性6min，然后按94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸60s的参数完成30个循环，最后以72℃终延伸10min。

反应产物与10μl Loading buffer混合，于1.5％琼脂糖凝胶中，以7V/cm恒压电源电泳30min。电泳结束后染色1～2min，置于电泳检测仪中进行观测，切取目标片断置于离心管中，按天根琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209，天根生化科技<北京>有限公司)说明进行操作，所得回收产物取5μl进行电泳检测，并在微量紫外分光光度计

ND-1000(NanoDrop Technologies,Inc.，USA)进行DNA浓度测定，通过记录A_260/280计算DNA浓度。

在本实例中利用COI通用引物(Folmer et al.，1994)(表2)对COI基因区进行的DNA扩增结果显示通用引物LCO1490-HCO2198对鹿科动物扩增效果不理想，在麋鹿(Elaphurus davidianus)和黇鹿(Dama dama)的PCR产物电泳结果中尤其明显，但应用在梅花鹿(Cervus nippon)时，扩增效果相对较好(图1A)。

表2 COI通用引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		LCO1490(SEQ ID No.3)	GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HCO2198(SEQ ID No.4)	TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

本发明中，根据Genbank已公布的马鹿(Cervus elaphus)(NC_007704)、梅花鹿(Cervus nippon)(NC_006993)的线粒体DNA全长序列及麋鹿(Elaphurus davidianus)COI基因的片段序列信息(KF509972，KF5099733)，重新设计了用于进行鹿科动物物种鉴定及DNA条形码研究的特异性引物对(表3，SEQ ID No.1与SEQ ID No.2)，经过PCR扩增检验，证明新引物有很好的扩增效率和特异性(图1B)，在供试的马鹿、梅花鹿、麋鹿及黇鹿样品中均有很好的扩增效果，扩增片段长度在600bp左右，可支持DNA条形码研究的应用。相对于COI基因片段通用引物，本发明设计的鹿科动物COI基因片段特异性引物，对鹿科动物特异性较好，产物片段长度合适，并有很好的扩增效率(详见扩增电泳示例图)，很好的解决了同类研究中扩增困难、容易得到错误序列信息的问题。

表3本发明的鹿科动物COI专一性引物

序列编号	序列(5’-3’)
		SEQ ID No.1	TATTTGGTGCCTGAGCAGGCATAGTCGGAACAGCC
SEQ ID No.2	GGTGACCAAAGAATCAGAACAAGTGTTGATA

本发明的特异性引物对，是基于Genbank已公布的马鹿(Cervus elaphus)(NC_007704)、梅花鹿(Cervus nippon)(NC_006993)的线粒体DNA全长序列及麋鹿(Elaphurusdavidianus)COI基因的片段序列信息(KF509972，KF5099733)等多个不同物种的相关序列总结设计，能够针对不同鹿科动物进行扩增，并都具有良好的扩增效果。所述特异性引物对可用于辅助进行鹿科动物相关材料(如鹿角、中药饮片、化石材料等)的物种鉴定。

经纯化后的DNA送测序公司(上海美吉)测序鉴定，进行双向测序，经比对校正后获得目标COI序列信息。与Genbank中已知的麋鹿及其他鹿科动物序列进行比对，确认目标片段的正确性。

实施例2利用特异性引物对的目标序列构建分子系统树

从Genbank上查询得到世界范围内鹿科(Cervidae)及近源的麝科(Moschidae)和鼷鹿科(Tragulidae)物种的COI基因相关序列(部分物种COI序列没有研究记录，由基因库中线粒体基因组全长序列分析得到COI全长序列)，共计48个分类群(种或亚种)52条序列(表4)。与已获得的51条麋鹿苑真鹿亚科物种的COI序列信息一起合并整理序列信息，并利用软件Clustal W和Bioedit进行序列比对，将对齐的序列输出为fasta(.fas)和nexus(.nex)格式文件，并利用软件Modeltest 3.7测试估算最优核酸替代模型。将麝科和鼷鹿科物种作为外类群，通过软件MEGA7(Kumar et al.，2016)以Modeltest 3.7计算所得最优核酸替代模型构建最大似然树(Maximum Likelihood Method)。系统树检验采用自展法(Bootstrap Method)，经1000次Bootstrap检验，计算得到系统树各分支的自展支持率。所得分子系统树(图2)显示，根据本研究所提供的特异性引物对获得的DNA片段序列可很好的区别不同物种，并可指示物种间的亲缘关系，同一物种在分子系统树聚为一支，而不同物种间遗传距离较大，亲缘关系区别明显，可显著区分。

表4 Genbank上鹿科动物与近源类群的COI相关基因序列信息

注：标注“*”的类群为外类群。文献出处一栏标注“-”的为本案发明人研究确认。

根据分子系统树及序列比对的结果，筛选可得到可靠的具有代表性的鹿科动物及近缘物种的DNA条形码样本数据。本实施例中，获取得到的麋鹿、梅花鹿、黇鹿及马鹿的参考序列如下：

(1)麋鹿Elaphurus davidianus

DNA序列(SEQ ID No.5)

TGAGCAGGCATAGTCGGAACAGCCTTAAGCCTACTGATTCGTGCTGAATTAGGTCAACCCGGTACTCTGCTTGGAGATGACCAAATTTATAATGTTATCGTAACCGCACACGCATTCGTAATAATTTTCTTTATAGTTATACCAATTATAATTGGAGGATTTGGTAATTGACTAGTTCCCCTAATAATTGGTGCCCCAGATATAGCATTCCCTCGAATAAACAATATAAGCTTTTGACTCCTCCCTCCCTCTTTCTTACTACTTTTAGCATCATCTATAGTTGAAGCTGGCGCAGGGACAGGCTGAACTGTGTATCCCCCTCTAGCTGGCAACCTAGCTCACGCAGGAGCTTCAGTAGACTTGACTATTTTTTCTTTACATCTGGCAGGTGTCTCTTCAATTCTGGGGGCCATTAACTTTATTACAACAATTATTAATATAAAACCCCCTGCTATATCACAATATCAAACCCCTCTATTTGTGTGATCCGTACTAGTCACTGCTGTACTCCTACTTCTCTCACTCCCTGTACTAGCAGCCGGAATTACAATACTATTAACAGACCGAAACTTAAATACGACCTTTTTTGACCCAGCAGGAGGCGGAG

图像化条形码(Illustrative Barcode)参见图3所示。

(2)梅花鹿Cervus nippon

DNA序列(SEQ ID No.6)

TGAGCAGGCATAGTCGGAACAGCCTTAAGCCTACTGATTCGTGCCGAACTGGGCCAACCTGGTACTCTGCTTGGAGATGATCAAATTTATAATGTTATCGTAACCGCACATGCATTCGTAATAATTTTCTTTATAGTTATACCAATTATAATCGGAGGATTTGGTAATTGACTAGTTCCCCTAATAATTGGTGCCCCAGACATAGCATTCCCTCGAATAAACAATATAAGCTTTTGACTCCTCCCTCCTTCTTTCTTACTACTTTTAGCATCATCTATAGTTGAAGCTGGCGCAGGAACAGGCTGAACTGTATATCCCCCTCTAGCTGGCAACTTAGCTCACGCAGGGGCTTCAGTAGACCTGACCATTTTTTCTTTACACTTGGCAGGTGTCTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACAACAATTATCAATATAAAACCCCCTGCCATATCACAATATCAAACCCCTCTATTCGTGTGATCCGTATTAGTCACTGCTGTACTACTACTTCTCTCACTCCCTGTACTAGCAGCCGGAATCACAATACTATTAACAGACCGAAACCTAAATACAACCTTTTTTGACCCAGCAGGAGGCGGAG

图像化条形码(Illustrative Barcode)参见图4所示。

(3)马鹿Cervus canadensis

DNA序列(SEQ ID No.7)

TGAGCAGGCATAGTCGGAACAGCCTTAAGCCTACTGATTCGTGCCGAACTGGGCCAACCTGGTACTCTGCTTGGAGACGACCAAATTTATAATGTTATCGTAACCGCACATGCATTCGTAATAATTTTCTTTATAGTTATACCAATTATAATTGGAGGATTTGGTAATTGACTAGTTCCCCTAATAATTGGTGCCCCAGACATAGCATTCCCTCGAATAAACAATATAAGCTTTTGACTCCTCCCTCCTTCTTTCTTACTACTTTTAGCATCATCTATAGTTGAAGCTGGCGCAGGAACAGGCTGAACTGTATACCCCCCTCTAGCTGGCAACTTAGCTCACGCAGGGGCTTCAGTAGACCTAACTATTTTTTCTTTACACTTGGCAGGTGTCTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACAACAATTATTAATATAAAACCCCCTGCCATATCACAATATCAAACCCCTCTATTTGTGTGATCCGTATTAGTCACTGCTGTACTACTACTTCTCTCACTCCCTGTACTAGCAGCCGGAATTACAATACTATTAACAGACCGAAACTTAAATACAACCTTTTTTGACCCAGCAGGAGGCGGAG

图像化条形码(Illustrative Barcode)参见图5所示。

(4)黇鹿Dama dama

DNA序列(SEQ ID No.8)

TGAGCAGGCATAGTCGGAACAGCCTTAAGCCTATTGATTCGTGCTGAACTGGGCCAACCTGGTACCCTACTTGGAGATGACCAAATTTATAATGTTATTGTAACCGCACATGCATTCGTAATAATTTTCTTTATAGTTATACCAATTATAATCGGAGGATTTGGTAACTGACTAGTTCCCTTAATAATTGGTGCCCCAGATATAGCATTCCCTCGAATAAACAATATGAGCTTTTGACTCCTTCCTCCCTCTTTCTTACTACTTCTAGCATCATCTATAGTTGAAGCTGGCGCAGGAACAGGCTGAACTGTGTACCCCCCTCTAGCTGGTAACTTAGCTCACGCAGGAGCCTCAGTGGACCTAACTATCTTTTCTCTACACCTGGCAGGTGTCTCTTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACAACAATTATCAATATAAAACCCCCTGCTATGTCACAATACCAAACTCCCCTATTTGTGTGATCCGTACTAGTCACTGCTGTATTACTACTTCTCTCACTCCCAGTACTAGCAGCTGGAATTACAATATTATTAACAGACCGAAATTTAAATACAACCTTTTTTGATCCAGCAGGAGGCGGAG

图像化条形码(Illustrative Barcode)参见图6所示。

上述参考序列可用于辅助进行鹿科动物相关材料(如鹿角、中药饮片、化石材料等)的物种鉴定。

实施例3-6利用本发明的特异性引物对和参考序列进行物种鉴定

利用实施例1中所述的特异性引物对(SEQ ID No.1与SEQ ID No.2)对麋鹿、梅花鹿、黇鹿及马鹿四个鹿科动物物种的不同材质样本(鹿角、血液或组织)进行检测。检测过程中基因组DNA提取方法、PCR扩增体系和目标片段纯化及测序方法参见实施例1。所用参考序列为上述实施例2所述获取的参考序列：

(1)麋鹿Elaphurus davidianus

DNA序列(SEQ ID No.5)

图像化条形码(Illustrative Barcode)参见图3所示。

(2)梅花鹿Cervus nippon

DNA序列(SEQ ID No.6)

图像化条形码(Illustrative Barcode)参见图4所示。

(3)马鹿Cervus canadensis

DNA序列(SEQ ID No.7)

图像化条形码(Illustrative Barcode)参见图5所示。

(4)黇鹿Dama dama

DNA序列(SEQ ID No.8)

图像化条形码(Illustrative Barcode)参见图6所示。

结果显示，本发明的特异性引物在不同实验材料中具有良好的扩增效率，所得序列可用于鹿科动物的物种鉴定，具有很好的识别效率。

序列表

<110> 北京麋鹿生态实验中心

<120> 一种用于鹿科动物鉴定的引物及其应用

<130> GAI17CN2263

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

tatttggtgc ctgagcaggc atagtcggaa cagcc 35

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

ggtgaccaaa gaatcagaac aagtgttgat a 31

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

taaactttca gggtgaccaa aaaatca 27

<210> 5

<211> 607

<212> DNA

<213> 麋鹿（Elaphurus davidianus）

<400> 5

tgagcaggca tagtcggaac agccttaagc ctactgattc gtgctgaatt aggtcaaccc 60

ggtactctgc ttggagatga ccaaatttat aatgttatcg taaccgcaca cgcattcgta 120

ataattttct ttatagttat accaattata attggaggat ttggtaattg actagttccc 180

ctaataattg gtgccccaga tatagcattc cctcgaataa acaatataag cttttgactc 240

ctccctccct ctttcttact acttttagca tcatctatag ttgaagctgg cgcagggaca 300

ggctgaactg tgtatccccc tctagctggc aacctagctc acgcaggagc ttcagtagac 360

ttgactattt tttctttaca tctggcaggt gtctcttcaa ttctgggggc cattaacttt 420

attacaacaa ttattaatat aaaaccccct gctatatcac aatatcaaac ccctctattt 480

gtgtgatccg tactagtcac tgctgtactc ctacttctct cactccctgt actagcagcc 540

ggaattacaa tactattaac agaccgaaac ttaaatacga ccttttttga cccagcagga 600

ggcggag 607

<210> 6

<211> 607

<212> DNA

<213> 梅花鹿（Cervus nippon）

<400> 6

tgagcaggca tagtcggaac agccttaagc ctactgattc gtgccgaact gggccaacct 60

ggtactctgc ttggagatga tcaaatttat aatgttatcg taaccgcaca tgcattcgta 120

ataattttct ttatagttat accaattata atcggaggat ttggtaattg actagttccc 180

ctaataattg gtgccccaga catagcattc cctcgaataa acaatataag cttttgactc 240

ctccctcctt ctttcttact acttttagca tcatctatag ttgaagctgg cgcaggaaca 300

ggctgaactg tatatccccc tctagctggc aacttagctc acgcaggggc ttcagtagac 360

ctgaccattt tttctttaca cttggcaggt gtctcctcaa ttctaggggc cattaacttt 420

attacaacaa ttatcaatat aaaaccccct gccatatcac aatatcaaac ccctctattc 480

gtgtgatccg tattagtcac tgctgtacta ctacttctct cactccctgt actagcagcc 540

ggaatcacaa tactattaac agaccgaaac ctaaatacaa ccttttttga cccagcagga 600

ggcggag 607

<210> 7

<211> 607

<212> DNA

<213> 马鹿（Cervus canadensis）

<400> 7

tgagcaggca tagtcggaac agccttaagc ctactgattc gtgccgaact gggccaacct 60

ggtactctgc ttggagacga ccaaatttat aatgttatcg taaccgcaca tgcattcgta 120

ataattttct ttatagttat accaattata attggaggat ttggtaattg actagttccc 180

ctaataattg gtgccccaga catagcattc cctcgaataa acaatataag cttttgactc 240

ctccctcctt ctttcttact acttttagca tcatctatag ttgaagctgg cgcaggaaca 300

ggctgaactg tatacccccc tctagctggc aacttagctc acgcaggggc ttcagtagac 360

ctaactattt tttctttaca cttggcaggt gtctcctcaa ttctaggggc cattaacttt 420

attacaacaa ttattaatat aaaaccccct gccatatcac aatatcaaac ccctctattt 480

gtgtgatccg tattagtcac tgctgtacta ctacttctct cactccctgt actagcagcc 540

ggaattacaa tactattaac agaccgaaac ttaaatacaa ccttttttga cccagcagga 600

ggcggag 607

<210> 8

<211> 607

<212> DNA

<213> 黇鹿（Dama dama）

<400> 8

tgagcaggca tagtcggaac agccttaagc ctattgattc gtgctgaact gggccaacct 60

ggtaccctac ttggagatga ccaaatttat aatgttattg taaccgcaca tgcattcgta 120

ataattttct ttatagttat accaattata atcggaggat ttggtaactg actagttccc 180

ttaataattg gtgccccaga tatagcattc cctcgaataa acaatatgag cttttgactc 240

cttcctccct ctttcttact acttctagca tcatctatag ttgaagctgg cgcaggaaca 300

ggctgaactg tgtacccccc tctagctggt aacttagctc acgcaggagc ctcagtggac 360

ctaactatct tttctctaca cctggcaggt gtctcttcaa ttctaggggc cattaacttt 420

attacaacaa ttatcaatat aaaaccccct gctatgtcac aataccaaac tcccctattt 480

gtgtgatccg tactagtcac tgctgtatta ctacttctct cactcccagt actagcagct 540

ggaattacaa tattattaac agaccgaaat ttaaatacaa ccttttttga tccagcagga 600

ggcggag 607

Claims

1.一种引物，其包括第一引物与第二引物，其中，第一引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；第二引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述引物在鉴定鹿科动物中的应用。

3.权利要求1所述引物在制备鹿科动物鉴定DNA条形码或检测试剂盒中的应用。

4.权利要求1所述引物和/或所述引物的目标序列在构建鹿科动物物种分子系统树中的应用。

5.一种DNA片段，其是以鹿科动物的COI基因为模板，用权利要求1或2所述的引物进行PCR扩增得到的。

6.根据权利要求5所述的DNA片段，其中，所述DNA片段包括标记或未标记的SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8中的一种或多种。

7.一种鹿科动物物种分子系统树，其是以权利要求1所述引物和/或所述引物的目标序列为依据构建的。

8.根据权利要求7所述的鹿科动物物种分子系统树，该分子系统树如图2所示。

9.一种检测待测样品中鹿科动物成分的方法，该方法包括：

从待测样品中提取总DNA；

以所提取的总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

对上述扩增结果进行分析判断。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述待测样品来自需要鉴别是否含有鹿科动物成分和/或需鉴定鹿科动物物种的药材、中药制剂，或者化石材料。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述鹿科动物物种的药材包括鹿角、血液、组织或中药饮片。

12.根据权利要求10所述的方法，该方法还包括：

将待测混合物样品的扩增结果与权利要求5或6所述的DNA序列、或者与基于权利要求5或6所述DNA序列的条形码进行比较，分析判断所测混合物中是否存在鹿科动物成分和/或鉴定鹿科动物物种；

当用于鉴定鹿科动物物种时，结合权利要求7或8所述的分子系统树进行鉴定。