CN113308556A - 快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量pcr试剂盒及制法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于物种鉴定技术领域，特别涉及一种快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒及制法。引物及探针序列：上游引物P1：5’‑GGTGCTGGCCTCCAACAG‑3’；下游引物P2：5’‑GGTGGGCTCAGGTGATAGAGACT‑3’；探针P3：5’‑CATTCACCCACTAAACCCCCTAGAAGTCCC‑3’。本发明特异性引物设计合理，以Cytb基因为靶基因,建立一种基于TaqMan探针的实时荧光PCR技术特异鉴定梅花鹿物种的方法,为食品、中药材及保健品中梅花鹿源性成分的鉴别提供参考，具有很好的特异性，且更为直观、快速、灵敏、准确。

Description

快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒及制法
技术领域
本发明属于物种鉴定技术领域，特别涉及一种快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒及制法。
背景技术
我国是世界上鹿科资源最丰富的国家之一,根据对鹿科动物进化的研究,鹿科动物的獐、麂、梅花鹿、马鹿、麋鹿、水鹿和白唇鹿的原产地均在中国，鹿也是我国传统的一种珍贵的药用动物,据《本草纲目》记载,鹿茸、鹿胎、鹿血、鹿肾、鹿筋、鹿心、鹿骨、鹿鞭等均是滋补营养食品亦可入药。鹿的种类虽然较多,但具有药用价值的主要指梅花鹿,我国历代本草著作及现代药典都将梅花鹿(Cervus nippon)的产品视为正品,其他鹿种的产品则多作为代用品、习用品或伪品。这其中又以梅花鹿最为珍贵,价格最高,如驯鹿、马鹿的鹿茸价格只有梅花鹿鹿茸的一半,因此导致目前市场上一些以驯鹿、马鹿等低价产品充当高价的梅花鹿产品,甚至用非鹿源的产品冒充梅花鹿产品,价格与药效的区别很大。鹿的种类很多,但有药用价值的主要是梅花鹿。目前我国仅有部分地区有少量野生梅花鹿,梅花鹿已被列为国家一级保护动物,而药用鹿茸、鹿血、鹿心现主要取自人工饲养的鹿。
目前鹿的品种鉴别主要依靠传统方法,主要包括直观性状鉴定和理化鉴定,很难准确判定鹿产品的真伪。2007年颁布的国家标准GB/T 21106-2007《动物源性饲料中鹿源性成分定性检测方法PCR方法》,是用普通PCR方法对鹿源性成分进行检测,但不能将梅花鹿与马鹿等其他鹿类区别开来,所用的PCR方法需要凝胶电泳过程,根据条带大小判断是否含有鹿类成分,该方法灵敏度低,操作较实时荧光PCR方法复杂,容易存在交叉污染。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供基于梅花鹿Cytb基因序列开发的梅花鹿源性成分荧光定量PCR鉴定方法形成的检测试剂盒，可以快速、准确鉴定梅花鹿源性产品，促进梅花鹿源性成分产品的鉴定工作，防止非鹿源的产品冒充梅花鹿产品,造成市场秩序混乱，真假难辨。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒，其特征在于：包括引物与探针的序列是：
上游引物P1：5’-GGTGCTGGCCTCCAACAG-3’；
下游引物P2：5’-GGTGGGCTCAGGTGATAGAGACT-3’；
探针P3：5’-CATTCACCCACTAAACCCCCTAGAAGTCCC-3’。
所述探针P3的5’端标记fam基团，3’端标记temra基团。
所述试剂盒还包括由其他试剂所组成的反应体系如下表1：
表1快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的反应体系
Figure BDA0003151440880000021
所述试剂盒的扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火延伸40s，40个循环。
一种快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的应用，其特征在于：利用所述试剂盒对食品、中药材及保健品中梅花鹿源性成分进行定量PCR特异性检测。
所述梅花鹿源性成分定量PCR特异性检测方法为：
采用梅花鹿物种实时荧光PCR特异性检测体系进行实时荧光PCR扩增梅花鹿的Cytb基因，以Taq DNA聚合酶进行PCR反应，当DNA链延伸到梅花鹿物种特异性检测探针位置时，以Taq DNA聚合酶的5’端外切酶活性切断梅花鹿物种特异性检测探针的淬灭基团，使梅花鹿物种特异性检测探针发出荧光信号，经信号收集处理，获得特异性扩增曲线。
一种快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的制法，其特征在于：具体包括以下步骤：
第一步 引物与探针的设计：
(1)根据NCBI基因数据库已注释的梅花鹿Cytb基因序列,用DNAMAN软件比对分析梅花鹿和马鹿、驯鹿、赤鹿、白臀鹿、驼鹿等亲缘性近的物种的序列,选择梅花鹿序列中特异位点较多的片段作为靶序列,应用Primer Express 3.0软件设计一对特异性引物P1、P2和一条特异性的探针P3，双标记探针的5’端标记报告基因羧基荧光素FAM,3’端标记淬灭基团羧基四甲基罗丹明TAMRA；
(2)引物与探针序列
上游引物P1:5’-GGTGCTGGCCTCCAACAG-3’
下游引物P2:5’-GGTGGGCTCAGGTGATAGAGACT-3’
探针P3:5’fam-CATTCACCCACTAAACCCCCTAGAAGTCCC-temra 3’
第二步 扩增反应条件：分别对荧光PCR的引物、探针浓度、dNTPS浓度、及PCR的退火温度、时间、循环参数等进行优化，筛选出PCR扩增的最佳反应体系如表1；
扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火/延伸40s，40个循环；
第三步 特异性检测：将实验室自行采集保存，以及其他研究院所惠赠的梅花鹿、马鹿、牛和羊源性15份组织样品由实验室新建立的定量PCR方法检测；结果样品1、3、5、7、9、11号样品梅花鹿源性成分检测结果为阳性，2、4、6、8、10、12、13、14、15样品梅花鹿源性成分检测结果为阴性，实验室定量PCR检测结果与提供给定值一致，说明本方法特异性良好；
第四步 灵敏度检测：将含有浓度7.8×107pg/μL的梅花鹿DNA质粒进行连续10倍梯度稀释成8个梯度进行实时荧光PCR扩增，并设置重复；以Ct值<37为下限判定该方法的灵敏性；根据检测结果确定方法的灵敏度，检测灵敏度在DNA水平上可达到10pg/μL；
第五步 重复性和稳定性检测：以10倍梯度稀释已知拷贝数的质粒为模板,在Light Cycle荧光定量PCR仪上检测,得到动力学曲线,并计算出相应的标准曲线；根据检测结果绘制扩增标准曲线,斜率为-3.2111，相关系数为0.9985。试验结果说明检测试剂盒具有良好的重复性和稳定性；
第六步 临床样品检测：将通过多种方式收集的梅花鹿、马鹿、牛和羊源性组织样品15份、鹿血45份、鹿茸鹿角等中药材样品12份样品采用新检测试剂盒进行定量PCR检测，同时采用高丽君，何程远等《基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定》(吉林大学学报)2018，44中的PCR方法作为对照，结果完全一致。
本发明特异性引物设计合理，以Cytb基因为靶基因,建立一种基于TaqMan探针的实时荧光PCR技术特异鉴定梅花鹿物种的方法,为食品、中药材及保健品中梅花鹿源性成分的鉴别提供参考，具有很好的特异性，且更为直观、快速、灵敏、准确。
附图说明
图1为指定样品实时荧光PCR特异性检测扩增图，图中：编号1、3、5、7、9、11的样品为梅花鹿组织样品的阳性检测结果。
图2为质粒荧光PCR检测方法灵敏度试验的结果，图中：1、7.8×107pg/μL扩增结果；2、7.8×106pg/μL扩增结果；3、7.8×105pg/μL扩增结果；4、7.8×104pg/μL扩增结果；5、7.8×103pg/μL扩增结果；6、7.8×102pg/μL扩增结果；7、7.8×10pg/μL扩增结果；8、7.8pg/μL浓度扩增结果。
图3为质粒荧光PCR检测方法的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。
实施例1
快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒，包括引物与探针的序列是：
上游引物P1：5’-GGTGCTGGCCTCCAACAG-3’；
下游引物P2：5’-GGTGGGCTCAGGTGATAGAGACT-3’；
探针P3：5’-CATTCACCCACTAAACCCCCTAGAAGTCCC-3’。
所述探针P3的5’端标记fam基团，3’端标记temra基团。
所述试剂盒还包括由其他试剂所组成的反应体系如下表1：
表1快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的反应体系
Figure BDA0003151440880000041
所述试剂盒的扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火延伸40s，40个循环。
实施例2
一种快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的应用，利用所述试剂盒对食品、中药材及保健品中梅花鹿源性成分进行定量PCR特异性检测，所述梅花鹿源性成分定量PCR特异性检测方法为：
采用梅花鹿物种实时荧光PCR特异性检测体系进行实时荧光PCR扩增梅花鹿的Cytb基因，以Taq DNA聚合酶进行PCR反应，当DNA链延伸到梅花鹿物种特异性检测探针位置时，以Taq DNA聚合酶的5’端外切酶活性切断梅花鹿物种特异性检测探针的淬灭基团，使梅花鹿物种特异性检测探针发出荧光信号，经信号收集处理，获得特异性扩增曲线。
实施例3
一种快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的制法，具体包括以下步骤：
第一步 引物与探针的设计：
(1)根据NCBI基因数据库已注释的梅花鹿Cytb基因序列,用DNAMAN软件比对分析梅花鹿和马鹿、驯鹿、赤鹿、白臀鹿、驼鹿等亲缘性近的物种的序列,选择梅花鹿序列中特异位点较多的片段作为靶序列,应用Primer Express 3.0软件设计一对特异性引物P1、P2和一条特异性的探针P3，双标记探针的5’端标记报告基因羧基荧光素FAM,3’端标记淬灭基团羧基四甲基罗丹明TAMRA；
(2)引物与探针序列
上游引物P1:5’-GGTGCTGGCCTCCAACAG-3’
下游引物P2:5’-GGTGGGCTCAGGTGATAGAGACT-3’
探针P3:5’fam-CATTCACCCACTAAACCCCCTAGAAGTCCC-temra 3’
第二步 扩增反应条件：分别对荧光PCR的引物、探针浓度、dNTPS浓度、及PCR的退火温度、时间、循环参数等进行优化，筛选出PCR扩增的最佳反应体系如表1；
扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火/延伸40s，40个循环；
第三步 特异性检测：将实验室自行采集保存，以及其他研究院所惠赠的梅花鹿、马鹿、牛和羊源性15份组织样品由实验室新建立的定量PCR方法检测；结果样品1、3、5、7、9、11号样品梅花鹿源性成分检测结果为阳性，2、4、6、8、10、12、13、14、15样品梅花鹿源性成分检测结果为阴性，实验室定量PCR检测结果与提供给定值一致，说明本方法特异性良好；
第四步 灵敏度检测：将含有浓度7.8×107pg/μL的梅花鹿DNA质粒进行连续10倍梯度稀释成8个梯度进行实时荧光PCR扩增，并设置重复；以Ct值<37为下限判定该方法的灵敏性；根据检测结果确定方法的灵敏度，检测灵敏度在DNA水平上可达到10pg/μL；
第五步 重复性和稳定性检测：以10倍梯度稀释已知拷贝数的质粒为模板,在Light Cycle荧光定量PCR仪上检测,得到动力学曲线,并计算出相应的标准曲线；根据检测结果绘制扩增标准曲线,斜率为-3.2111，相关系数为0.9985。试验结果说明检测试剂盒具有良好的重复性和稳定性；
第六步 临床样品检测：将通过多种方式收集的梅花鹿、马鹿、牛和羊源性组织样品15份、鹿血45份、鹿茸鹿角等中药材样品12份样品采用新检测试剂盒进行定量PCR检测，同时采用高丽君，何程远等《基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定》(吉林大学学报)2018，44中的PCR方法作为对照，结果完全一致。
以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 传伟, 胡
有福, 王
卉秋, 刘
钊, 刘
<120> 快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒及制法
<130> 20210622
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 4
ggtgctggcc tccaacag 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 5
ggtgggctca ggtgatagag act 23
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 6
cattcaccca ctaaaccccc tagaagtccc 30

Claims (7)

1.快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒，其特征在于：包括引物与探针的序列是：
上游引物P1：5’-GGTGCTGGCCTCCAACAG-3’；
下游引物P2：5’-GGTGGGCTCAGGTGATAGAGACT-3’；
探针P3：5’-CATTCACCCACTAAACCCCCTAGAAGTCCC-3’。
2.根据权利要求1所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒，其特征在于：所述探针P3的5’端标记fam基团，3’端标记temra基团。
3.根据权利要求1所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括由其他试剂所组成的反应体系如下表1：
表1快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的反应体系
Figure FDA0003151440870000011
4.根据权利要求1至3任一所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火延伸40s，40个循环。
5.一种根据权利要求1至3任一所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的应用，其特征在于：利用所述试剂盒对食品、中药材及保健品中梅花鹿源性成分进行定量PCR特异性检测。
6.根据权利要求5所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的应用，其特征在于：所述梅花鹿源性成分定量PCR特异性检测方法为：
采用梅花鹿物种实时荧光PCR特异性检测体系进行实时荧光PCR扩增梅花鹿的Cytb基因，以Taq DNA聚合酶进行PCR反应，当DNA链延伸到梅花鹿物种特异性检测探针位置时，以Taq DNA聚合酶的5’端外切酶活性切断梅花鹿物种特异性检测探针的淬灭基团，使梅花鹿物种特异性检测探针发出荧光信号，经信号收集处理，获得特异性扩增曲线。
7.一种根据权利要求1至3任一所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的制法，其特征在于：具体包括以下步骤：
第一步 引物与探针的设计：
(1)根据NCBI基因数据库已注释的梅花鹿Cytb基因序列,用DNAMAN软件比对分析梅花鹿和马鹿、驯鹿、赤鹿、白臀鹿、驼鹿等亲缘性近的物种的序列,选择梅花鹿序列中特异位点较多的片段作为靶序列,应用Primer Express 3.0软件设计一对特异性引物P1、P2和一条特异性的探针P3，双标记探针的5’端标记报告基因羧基荧光素FAM,3’端标记淬灭基团羧基四甲基罗丹明TAMRA；
(2)引物与探针序列
上游引物P1:5’-GGTGCTGGCCTCCAACAG-3’
下游引物P2:5’-GGTGGGCTCAGGTGATAGAGACT-3’
探针P3:5’fam-CATTCACCCACTAAACCCCCTAGAAGTCCC-temra 3’
第二步 扩增反应条件：分别对荧光PCR的引物、探针浓度、dNTPS浓度、及PCR的退火温度、时间、循环参数等进行优化，筛选出PCR扩增的最佳反应体系如表1；
扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火/延伸40s，40个循环；
第三步 特异性检测：将实验室自行采集保存，以及其他研究院所惠赠的梅花鹿、马鹿、牛和羊源性15份组织样品由实验室新建立的定量PCR方法检测；结果样品1、3、5、7、9、11号样品梅花鹿源性成分检测结果为阳性，2、4、6、8、10、12、13、14、15样品梅花鹿源性成分检测结果为阴性，实验室定量PCR检测结果与提供给定值一致，说明本方法特异性良好；
第四步 灵敏度检测：将含有浓度7.8×107pg/μL的梅花鹿DNA质粒进行连续10倍梯度稀释成8个梯度进行实时荧光PCR扩增，并设置重复；以Ct值<37为下限判定该方法的灵敏性；根据检测结果确定方法的灵敏度，检测灵敏度在DNA水平上可达到10pg/μL；
第五步 重复性和稳定性检测：以10倍梯度稀释已知拷贝数的质粒为模板,在LightCycle荧光定量PCR仪上检测,得到动力学曲线,并计算出相应的标准曲线；根据检测结果绘制扩增标准曲线,斜率为-3.2111，相关系数为0.9985。试验结果说明检测试剂盒具有良好的重复性和稳定性；
第六步 临床样品检测：将通过多种方式收集的梅花鹿、马鹿、牛和羊源性组织样品15份、鹿血45份、鹿茸鹿角等中药材样品12份样品采用新检测试剂盒进行定量PCR检测，同时采用高丽君，何程远等《基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定》(吉林大学学报)2018，44中的PCR方法作为对照，结果完全一致。
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LI BO 等: "Identification of sika deer and red deer using partial cytochrome b and 12s ribosomal RNA genes", 《JOURNAL OF FORESTRY RESEARCH》 *
涂剑锋等: "鹿类线粒体DNA的研究与应用进展", 《特产研究》 *
董世武等: "基于PCR技术的鹿源性产品成分分子检测研究进展", 《特产研究》 *
辛翠娜等: "Cytb分子标记技术在物种鉴定中的应用", 《野生动物》 *
高明等: "基于实时荧光PCR技术鉴别梅花鹿", 《食品安全质量检测学报》 *

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112126692A (zh) * 2020-11-02 2020-12-25 中国农业科学院特产研究所 用于鉴别梅花鹿屋久岛亚种的分子标记、鉴别方法及应用

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