CN103525908A - 一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法 - Google Patents

一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法，以血旺为材料，提取DNA，使用TaqMan探针和特异性引物，进行荧光定量PCR反应；应用ABI7500SoftwareSDS1.4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果。本发明是一种可以同时检测血旺中鸭血、猪血和鸡血成分的多重TaqMan探针实时荧光PCR法，能够避免非特异性扩增，可以同时鉴别多种动物源性成分，大大提高检测效率和结果的准确性，检测下限为0.15ng，灵敏度达1%，具有良好的特异性，可同时实现对血旺中鸭血、猪血和鸡血DNA成分的检测和定量，为食品中动物源性成分鉴定探索了新的途径，具有很好的实用性。

Description

一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，涉及的是食品中动物源性成分的快速检测，具体涉及血旺中鸭、猪、鸡三种动物血液成分多重TaqMan探针实时荧光PCR快速检测方法。
背景技术
近年来，食品的质量安全问题尤其是掺假问题已经越来越受到社会和监管部门的关注。不明成分的食品或虚假食品标签不仅会导致制造商之间不正当的商业竞争，还有可能危害到消费者的身体健康，不明成分的食品对于敏感人群来说更是潜在的过敏原。在中国、日本和欧洲的一些国家，动物的血液已经作为营养添加剂广泛用于血肠、布丁和沙拉等食品中。血旺又称血豆腐，是在动物血液中加盐待凝固后煮制或不煮制形成的块状物。猪、鸭、鸡等畜禽血液是制作血旺的主要原料。我国的传统血旺因其具有很高的营养价值深受消费者喜爱，南京的鸭血粉丝汤作为南京特产闻名遐迩，然而，在经济利益的驱使下，一些不法分子为牟取暴利而掺杂使假，接连被媒体曝光的假鸭血、毒血旺等事件让消费者对此类产品望而生畏。目前市场上销售的血旺均是零散销售，大多是小作坊加工制造，并且没有食品标签，其动物源成分不明，因此，对于鉴别血旺中较常出现鸭血、猪血和鸡血，建立科学、准确快速的检测方法十分必要。
日常生活中人们通常依靠感官和经验鉴别血旺种类，但是随着加工方法的改进，这种方法已经不能满足鉴别需要，尤其是那些掺有两种或三种不同动物血液的血旺。随着现代分子生物学的发展，逐步形成了分别以蛋白质检测与核酸检测为基础的方法体系。基于蛋白质的检测技术，如高效液相色谱法和酶联免疫分析法，在鉴别加工过的食品时受蛋白质降解的影响，其灵敏度较低，消耗时间长。近几年来，DNA因其高稳定性和在不同组织中的同一性被选作比蛋白质更可靠的分析靶点，根据不同物种基因序列的特异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现特异性基因片段的扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中动物源性成分的PCR方法已基本取代以蛋白检测为基础的鉴别技术。尤其是近5年出现的实时荧光PCR技术，以其高特异性、高灵敏性、无污染和可定量等优点，越来越多的应用于食品中的肉类鉴别。实时荧光PCR是利用PCR反应体系中荧光信号的变化对产物生成进行实时监测的技术，它不仅省去了凝胶电泳的繁琐操作，减少了假阳性的发生率，还可以避免实验过程中溴化乙锭对人体的潜在危害。在目标基因选择方面，线粒体DNA拷贝数多，但是因其在不同组织中含量不同而难以进行定量分析，而动物细胞核基因组DNA序列具有高度的物种特异性，能够避免非特异性扩增，更加适合用作多重PCR分析；此外，在方法的选择上，单一PCR的重复性较差且不能实现多个物种的同时鉴定，多重PCR方法则可以同时鉴别多种动物源性成分，大大提高检测效率和结果的准确性。目前国际上以细胞核基因DNA序列为目标基因，用于鉴别血旺中动物血液成分的多重荧光定量PCR检测方法尚未见报道。因此，建立用于鉴别血旺中动物血液成分的快速检测方法将对食品安全的监管具有重要的实践意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法，使其具有准确稳定、操作方便、高效率等特点，满足使用需求。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法，以血旺为材料，提取DNA，使用TaqMan探针和特异性引物，进行荧光定量PCR反应；应用ABI7500 Software SDS1.4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果；其中，TaqMan探针和特异性引物具体如下：
正向引物1：5’-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3’，
反向引物1：5’-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3’，
TaqMan探针1：FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1
正向引物2：5’-CGAGAGGCTGCCGTAAAGG-3’，
反向引物2：5’-TGCAAGGAACACGGCTAAGTG-3’，
TaqMan探针2：CY5-ACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA-BHQ1；
正向引物3：5’-CAGCTGGCCTGCCGG-3’，
反向引物3：5’-CCCAGTGGAATGTGGTATTCA-3’，
TaqMan探针3：HEX-CTGCCAAGCTCTGCCACTCCTCTG-BHQ1。
所述荧光定量PCR反应，50μL的反应体系组成为：Premix Ex Taq酶（2×）25μL，6个特异性引物（10μM）各1μL，3个TaqMan探针（10μM）各2μL，Rox Reference Dye Ⅱ 染液（50×）1μL，DNA模板5μL， 剩余为ddH2O。
所述荧光定量PCR反应，条件为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。
该方法的DNA模板检测下限为0.15ng，浓度为0.03ng/μL。
该方法的灵敏度达1%。
有益效果：与现有技术相比，本发明是国际上首次以细胞核基因为目标基因建立的一种可以同时检测血旺中鸭血、猪血和鸡血成分的多重TaqMan探针实时荧光PCR法，能够避免非特异性扩增；采用多重PCR方法，可以同时鉴别多种动物源性成分，大大提高检测效率和结果的准确性。该检测方法不仅具有良好的特异性，还可以同时实现对血旺中鸭血、猪血和鸡血DNA成分的检测和的定量，为食品中动物源性成分鉴定探索了新的途径，具有准确稳定、操作方便、高效率等特点，具有很好的实用性，能产生较好的经济效益和社会效应。
附图说明
图1是多重TaqMan探针实时荧光PCR特异性分析扩增曲线，图中，1、2、3分别代表鸭血旺，猪血旺和鸡血旺中提取的DNA；
图2是多重TaqMan探针实时荧光PCR鸭扩增标准曲线；
图3是多重TaqMan探针实时荧光PCR猪扩增标准曲线；
图4是多重TaqMan探针实时荧光PCR鸡扩增标准曲线；
图5是多重TaqMan探针实时荧光PCR灵敏度分析鸭血液DNA扩增曲线，图中，1、2、3、4所对应样品鸭血液含量分别是20%、10%、5%、1%；
图6是多重TaqMan探针实时荧光PCR灵敏度分析猪血液DNA扩增曲线，图中，1、2、3、4所对应样品猪血液含量分别是20%、10%、5%、1%。
图7是多重TaqMan探针实时荧光PCR灵敏度分析鸡血液DNA扩增曲线，图中，1、2、3、4所对应样品鸡血液含量分别是20%、10%、5%、1%。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例，所用样品：鸭血、猪血、鸡血采集于农贸市场；屠宰场、驴肉、牛肉、兔肉、鹅肉、鱼、山羊肉、绵羊肉、玉米均购于江苏南京地区超市。
所用仪器为：荧光定量PCR仪（美国ABI公司，ABI7500）；核酸蛋白测定仪（美国热电公司，Nanodrop 1000 Thermal）；MB-102恒温震荡金属浴（Bioer公司）；高速冷冻离心机（美国Sigma公司，3-18K）。
血液、细胞和动物组织的基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；Premix Ex Taq购自宝生物工程(大连)有限公司；引物和探针合成由上海辉睿生物科技有限公司完成；DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
实施例1
1）样品制备与DNA提取
血旺的制备：采集的新鲜血液加2%食盐，待其凝固成块状物，然后用沸水煮熟。
DNA的提取：按照TIANGEN（天根）试剂盒的说明书进行操作。50mg样品（血旺、驴肉、猪肉、兔肉、鹅肉、鱼、山羊肉、绵羊肉、玉米）的总DNA均溶解于100μL TE 缓冲液中，利用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度和纯度。
2）引物和探针设计
根据GenBank中已发表的鸭（登录号：HQ008784.1），猪（登录号为DQ452569.1）和鸡（登录号为AY685072.1）的基因组序列，应用Primer Premier 5.0软件设计出特异性引物和探针，再将引物和探针序列在NCBI网站中进行Blast分析比较和评估，保证引物与探针的特异性。分别使用荧光基团FAM，CY5和HEX作为探针的发光基团。各引物和探针序列，扩增片段大小见表1。
表1荧光定量PCR引物与探针序列
Figure BDA0000365952051
3）多重TaqMan探针实时荧光PCR 扩增体系和反应条件
在50μL的荧光定量PCR反应体系中进行动物源性成分的检测，反应体系包含：Premix Ex Taq 酶（2×）25μL，鸭、猪、鸡ForwardPrimer（10μM）各1μL，鸭、猪、鸡Reverse Primer（10μM）各1μL，鸭、猪、鸡探针（10μM）各2μL，Rox Reference Dye Ⅱ染液（50×）1μL，DNA模板5μL，灭菌蒸馏水（ddH2O）7μL。
多重PCR反应条件为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。应用ABI 7500 Software SDS1.4对实验结果进行分析处理。以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果。
4）多重TaqMan探针实时荧光PCR特异性试验
分别以从鸭血旺、猪血旺、鸡血旺、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鱼肉、驴肉、兔肉、鹅肉、玉米中提取的DNA（50-100ng/μL）为模板按照上述优化的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR，并以不添加任何DNA模板为阴性对照，检测引物和探针特异性。
结果显示，在优化的反应体系中，三对引物和三条探针之间并无交叉反应，从鸭、猪、鸡血旺中提取的DNA经过TaqMan探针实时荧光PCR扩增在36个循环内有扩增，而其他8种DNA样本及阴性对照组在40个循环内没有出现实时扩增曲线，可判断为阴性结果（见图1、表2）。可见，针对目标物种的引物和探针特异性良好。
表2 引物和探针特异性实验
物种 荧光定量PCR检测Ct值
鸭 23.01±0.01
猪 23.43±0.07
鸡 23.84±0.03
山羊 N
绵羊 N
鱼 N
驴 N
兔 N
牛 N
鹅 N
玉米 N
阴性对照 N
表中，N表示在36个循环内未检出荧光信号。
实施例2  多重TaqMan探针实时荧光PCR实际检测下限分析
将鸭、猪、鸡血旺中提取的DNA模板原液（浓度均为90ng/μL）按照1:1:1混合后进行梯度稀释，即三种动物DNA浓度分别成为30ng/μL、3ng/μL、0.3ng/μL、0.03ng/μL和0.003ng/μL5个浓度梯度，用优化的反应体系考察其检测下限。为检测该体系的线性，对三个物种构建了标准曲线，并计算出其扩增效率，扩增效率计算公式为（E）=10-1/斜率-1，该实验重复三次，每次分别设三个平行，以Ct值小于36为阳性判别标准。
结果表明（表3），当荧光定量PCR体系中鸭、猪、鸡模板量为0.15ng（0.03ng/μL*5μL）时，在36个循环内有扩增，该荧光定量PCR检测体系的实际检测下限为0.15ng。鸭、猪、鸡标准曲线见图2、图3和图4，其扩增效率分别为91.75%，97.46%和104.38%，均在可接受区间80~105%内。
表3 多重TaqMan探针实时荧光PCR检测方法检测下限分析结果
DNA浓度（ng/μL） 鸭DNA Ct值 猪DNA Ct值 鸡DNA Ct值
30 25.06±0.04 25.06±0.12 25.88±0.08
3 28.36±0.07 28.18±0.16 29.06±0.22
0.3 32.15±0.11 31.81±0.18 31.98±0.10
0.03 35.59±0.15 35.13±0.23 35.64±0.36
0.003 N N N
0 N N N
表中，N表示在36个循环内未检出荧光信号。
实施例3  多重TaqMan探针实时荧光PCR灵敏度分析
用新鲜血液分别制成鸭血、猪血和鸡血含量为20%、10%、5%、1%、0.1%和0%的混合血旺样品（该含量为其中一种血的重量含量，剩余两种血液的重量比为1:1），提取各组DNA，依照优化好的反应体系对该方法的灵敏度进行分析，实验分三次进行，每次分设三个平行。
实验所得Ct值见表4，结果表明该体系可检测出血旺中1%的鸭血，猪血或鸡血，图5、图6、图7显示实时荧光PCR扩增良好，即可确定该法灵敏度可达1%，能满足实际检测需要。
表4 多重TaqMan探针实时荧光PCR灵敏度分析结果
目标物种血液含量（w/w） 鸭DNA Ct值 猪DNA Ct值 鸡DNA Ct值
20% 23.94±0.06 28.24±0.06 22.37±0.16
10% 26.43±0.04 31.79±0.09 23.58±0.06
5% 28.42±0.12 33.01±0.11 26.15±0.19
1% 35.63±0.30 35.51±0.06 33.55±0.64
0.1% N N N
0% N N N
表中，N表示在36个循环内未检出荧光信号。
实施例4
在实验室分别制作18个含不同比例(W/W)的鸭、猪、鸡三种动物血液的血旺样品（见表5），然后提取每个样品DNA，应用本实验所建立的多重TaqMan探针实时荧光PCR检测方法进行动物源性成分鉴别。结果显示（见表6）运用本方法所得检测结果与样品实际成分相符，说明本方法的目标片段在个体之间并没有发生影响其特异性的突变，证明了本方法的准确性和可靠性。
表5 1-18号血旺样品的组成
C1,C2,C3表示来自三只不同鸡的鸡血；D1,D2,D3表示来自三只不同鸭的鸭血；P1,P2,P3表示来自三只不同猪的猪血；
表6 1-18号样品检测结果
Figure BDA0000365952053
N表示在36个循环内未检出荧光信号。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  南京吉泰生物科技有限公司
 
<120>  一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法
 
<130>  100
 
<160>  9    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  正向引物1
 
<400>  1
ggagcacctc tatcagagaa agaca                                           25
 
 
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  反向引物1
 
<400>  2
gtgtgtagag ctcaagatca atccc                                           25
 
 
<210>  3
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  TaqMan探针1
 
<400>  3
tgggaacaag catgaatgta agtggatggt                                      30
 
 
<210>  4
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  正向引物2
 
<400>  4
cgagaggctg ccgtaaagg                                                  19
 
 
<210>  5
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  反向引物2
 
<400>  5
tgcaaggaac acggctaagt g                                               21
 
 
<210>  6
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  TaqMan探针2
 
<400>  6
acagtaggtc tgacgtgact ccccga                                          26
 
 
<210>  7
<211>  15
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  正向引物3
 
<400>  7
cagctggcct gccgg                                                      15
 
 
<210>  8
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  反向引物3
 
<400>  8
cccagtggaa tgtggtattc a                                               21
 
 
<210>  9
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  TaqMan探针3
 
<400>  9
ctgccaagct ctgccactcc tctg                                            24

Claims (5)

1.一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法，其特征在于：以血旺为材料，提取DNA，使用TaqMan探针和特异性引物，进行荧光定量PCR反应；应用ABI 7500 Software SDS1.4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果；其中，TaqMan探针和特异性引物具体如下：
正向引物1：5’-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3’，
反向引物1：5’-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3’，
TaqMan探针1：FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1；
正向引物2：5’-CGAGAGGCTGCCGTAAAGG-3’，
反向引物2：5’-TGCAAGGAACACGGCTAAGTG-3’，
TaqMan探针2：CY5-ACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA-BHQ1；
正向引物3：5’-CAGCTGGCCTGCCGG-3’，
反向引物3：5’-CCCAGTGGAATGTGGTATTCA-3’，
TaqMan探针3：HEX-CTGCCAAGCTCTGCCACTCCTCTG-BHQ1。
2.根据权利要求1所述的快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应，50μL的反应体系组成为：Premix Ex Taq 酶25μL，6个特异性引物各1μL，3个TaqMan探针各2μL，Rox Reference Dye Ⅱ 染液1μL，DNA模板5μL， 剩余为ddH2O。
3.根据权利要求1所述的快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应，条件为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。
4.根据权利要求1所述的快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法，其特征在于：该方法的DNA模板检测下限为0.15ng，浓度为0.03ng/μL。
5.根据权利要求1所述的快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法，其特征在于：该方法的灵敏度达1%。
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