CN102864243A

CN102864243A - 一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法

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Publication number: CN102864243A
Application number: CN2012103905001A
Authority: CN
Inventors: 黄明; 何玮玲; 杨静; 徐幸莲; 周光宏
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-10-15
Filing date: 2012-10-15
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2032-10-15
Also published as: CN102864243B

Abstract

本发明公开了一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法。具体方法为：分别基于动物细胞核基因设计引物和探针；人工合成一段竞争型扩增内标及相应的探针，建立内标荧光定量PCR体系，应用ABI 7500 Software SDS 1.4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果。本发明检测方法具有良好的针对目标物种的特异性的同时通过实时监控PCR反应以避免假阴性检测结果的产生，为食品中动物源性成分鉴定探索了新的途径，具有准确稳定、操作方便等有益效果。

Description

一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，涉及的是食品中动物源性成分的快速检测，具体涉及一种添加扩增内标的食品中猪肉、鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法。

背景技术

肉制品掺假是公众关注的焦点问题之一。目前，肉类掺假主要表现在不法企业使用相对廉价的猪肉、鸡肉等肉类，通过多种形式的深加工，冒充牛肉制品进行销售，以谋取不当利益。掺假行为不仅侵犯了消费者的合法权益，而且极大打击了公众对于我国食品质量安全状况的信心。因此，对于掺假牛肉制品中较常出现的猪肉和鸡肉，建立科学、准确快速的检测方法已十分必要。

以聚合酶链反应（PCR）为基础的技术已逐步成为了食品中肉类种属鉴定的核心方法。许多学者根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。近年来，实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度，并使得肉类含量的定量溯源成为可能。在目标基因选择方面，动物细胞核基因组DNA序列具有高度的物种特异性，能够保证检测过程中不会出现物种间非特异性扩增而导致的交叉干扰；此外，目前对食品中动物源性的荧光定量PCR检测研究均缺乏阳性扩增内标（IAC）对反应体系进行监控，无法避免检测假阴性结果的产生，导致检测结果不准确。目前国际上以细胞核基因DNA序列为目标基因，并添加有扩增内标的食品中动物源性荧光定量PCR检测方法尚未见报道。因此，建立添加有扩增内标的食品中猪肉和鸡肉的荧光定量PCR快速检测方法将对食品安全的快速监管具有重要的创新性实践意义。

发明内容

本发明从猪和鸡细胞核基因中的物种特异性序列出发，探索并完善了快速检测食品中猪肉和鸡肉的Taqman荧光定量PCR检测方法。

一种添加扩增内标的食品中猪肉和鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，包括以下步骤：（1）应用根据猪的beta actin基因及鸡的transforming growth factor基因设计扩增引物和Taqman探针，分别使用荧光基团FAM、HEX作为探针的发光基团；（2）设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒并设计相应探针；（3）以含有待检DNA模板、含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，阳性扩增内标DNA的Taqman探针，以及设计合成的猪beta actin基因扩增引物和Taqman探针，或鸡transforming growth factor基因扩增引物和Taqman探针的荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR反应；（4）应用ABI 7500Software SDS1.4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果；其中步骤（2）所述的设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的方法为：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上、下游分别连接上目标物种的扩增引物序列，从而形成针对猪检测体系和鸡检测体系长度分别为98bp和94bp的阳性扩增内标DNA序列；将这两段扩增内标DNA序列委托人工基因合成，合成片段分别连接载体pGH，转化感受态细胞DH5α，小量提取并测序验证，得到分别针对猪肉和鸡肉检测体系的含有阳性扩增内标DNA的重组质粒。

本发明根据Genbank中猪的beta actin基因（登录号为DQ452569.1）和鸡的transforming growth factor基因（登录号为AY685072.1）设计了用于荧光定量PCR检测的扩增引物和Taqman探针，分别使用荧光基团FAM、HEX作为探针的发光基团。引物与探针序列见表1。

表1荧光定量PCR引物与探针序列

本发明所述的阳性扩增内标是一种人工合成竞争型扩增内标，在体系中具有特异性探针并与靶基因共用一对引物，能有效指示假阴性出现同时降低了多对引物对荧光定量PCR体系产生干扰的风险；采用与靶基因同源性较低的扩增内标，使其不会与靶基因通过互补链的结合而交联在一起而影响检测灵敏度。

本发明阳性扩增内标构建过程如下：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的真核生物DNA片段，在这段随机DNA序列上下游分别连接上目标物种的扩增引物序列，从而形成分别针对猪检测体系和鸡检测体系长度分别为98bp和94bp的扩增内标DNA序列。将这两段扩增内标DNA序列委托人工基因合成，合成片段连接载体pGH，转化感受态细胞DH5α，小量提取并测序验证，测定于260nm和280nm处的吸光度值，计算质粒浓度，-20℃保存备用，菌液于甘油管中-70℃保存。用于扩增阳性内标的探针序列见表1。

本发明所述荧光定量PCR反应体系优选为：20μL反应体系包含：模板DNA和含有阳性扩增内标DNA的重组质粒各2μL，Premix Ex Taq 10μL，靶基因探针溶液和扩增内标探针溶液各0.4μM，ROX校正溶液0.4μL，猪和鸡扩增体系中引物浓度分别为0.2μM和0.6μM。

所述荧光定量PCR反应条件优选为：95℃30s，40个循环的95℃5s和60℃34s。

本发明所述的一种添加扩增内标的食品中猪肉、鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法在食品质量控制和质量安全检测中的应用。

有益效果

本发明与现有检测技术相比优点在于：本发明是国际上首次以细胞核基因为目标基因并添加有竞争性扩增内标的食品中用于猪肉和鸡肉成分检测的荧光定量PCR法。如体系中无扩增内标，极有可能产生因食品成分、残留的DNA提取试剂等抑制因子或者仪器故障等原因导致检测结果假阴性，影响实际检测准确率。对此，本发明通过人工设计合成竞争型阳性扩增内标，在体系中加入其特异性探针并与靶基因共用一对引物，能有效指示假阴性出现，同时降低了多对引物对荧光定量PCR体系产生干扰的风险；采用与靶基因同源性较低的扩增内标，使其不会与靶基因通过互补链的结合而交联在一起而影响检测灵敏度。

本发明检测方法具有良好的针对目标物种的特异性的同时通过实时监控PCR反应以避免假阴性检测结果的产生，为食品中动物源性成分鉴定探索了新的途径，具有准确稳定、操作方便等有益效果。

附图说明

图1荧光定量PCR灵敏度检测结果。A图为猪灵敏度检测结果图；B图为鸡灵敏度检测结果

图。1-4的DNA浓度分别为：250ng/μL、25ng/μL、2.5ng/μL、0.25ng/μL。

具体实施方式

实验材料、试剂与仪器

生、熟猪肉、生、熟鸡肉、生牛肉、生山羊肉、生绵羊肉、生鱼肉、生驴肉、生兔肉、生鸭肉、生鹅肉、玉米等均购于南京市农贸市场。

荧光定量PCR仪（美国ABI公司，ABI7500）；核酸蛋白测定仪（美国热电公司，Nanodrop1000Thermal）；高速冷冻离心机（美国Sigma公司，3-18K）。

血液、细胞和动物组织的基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；Premix Ex Taq购自宝生物工程(大连)有限公司；引物和探针合成、人工全基因合成由上海辉睿生物科技有限公司完成；DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

实施例1

1.样品制备与DNA提取

熟猪肉与熟鸡肉分别由生鲜猪肉和生鲜鸡肉在100℃沸水中蒸煮20分钟制成。

分别称取50mg生熟猪肉和鸡肉以及其他动植物肉按照试剂盒说明书操作提取基因组DNA，总DNA均溶解于100μL TE缓冲液中。

测定于260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA浓度和纯度。

2.引物和探针设计

根据Genbank中已发表的猪的beta actin基因（登录号为DQ452569.1）和鸡的transforming growth factor基因（登录号为AY685072.1），利用Primer Express 3.0（ABI）软件设计引物和Taqman探针，分别使用荧光基团FAM、HEX作为探针的发光基团。

引物与探针序列见表1。

表1荧光定量PCR引物与探针序列

3.扩增内标构建

扩增内标构建过程如下：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的真核生物DNA片段，在这段随机DNA序列上下游分别连接上目标物种的扩增引物序列，从而形成分别针对猪检测体系长度为98bp的扩增内标DNA序列（SEQ ID NO.5）和针对鸡检测体系长度为94bp的扩增内标DNA序列（SEQ ID NO.6）。将这两段扩增内标DNA序列委托人工基因合成，合成片段插入载体pGH的SmaI酶切位点，转化感受态细胞DH5α，小量提取并测序验证，测定于260nm和280nm处的吸光度值，计算质粒浓度，-20℃保存备用，菌液于甘油管中-70℃保存。扩增内参的探针序列见表1。

4.Taqman探针荧光定量PCR扩增体系和反应条件

在20μL的荧光定量PCR反应体系中进行猪肉和鸡肉成分的检测，优化引物浓度，反应体系包含：Premix Ex Taq 10μL，上、下游引物分别在0.2μM、0.4μM和0.6μM三个梯度浓度进行摸索，靶基因探针溶液和扩增内标探针溶液各0.4μM，ROX校正溶液0.4μL，模板DNA2μL，最终确立猪和鸡扩增体系中引物浓度分别为0.2μM和0.6μM。扩增内标根据具体情况按优化后的浓度添加。反应条件为：95℃30s，40个循环的95℃5s和60℃34s。应用ABI 7500Software SDS1.4对实验结果进行分析处理。以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果。

5.特异性试验

分别以鸡肉、猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鱼肉、驴肉、兔肉、鸭肉、鹅肉、玉米的DNA（100ng/μL）为模板按照上述优化的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR，检测引物和探针特异性。20μL反应体系包含：模板DNA 2μL，Premix Ex Taq 10μL，靶基因探针溶液（10μM）和扩增内标探针溶液（10μM）各0.8μL，ROX校正溶液0.4μL，猪和鸡扩增体系中引物浓度分别为0.2μM（10μM 0.4μL）和0.6μM（10μM 1.2μL）。反应条件为：95℃30s，40个循环的95℃5s和60℃34s。

结果显示，猪肉和鸡肉来源的DNA检测结果为阳性，其他物种在40个循环内均无出现扩增。结果见表2。可见，针对目标物种的引物和探针特异性良好。

表2引物和探针特异性实验

6.灵敏度试验

（1）基因组DNA灵敏度实验

将250ng/μL的目标肉类DNA原液做10倍梯度稀释，每个梯度均取2μL为模板按照上述方法分别对两种目标肉类考察方法的灵敏度。

结果显示（图1），当荧光定量PCR体系中模板量为0.5ng时，存在明显的扩增曲线，此时猪和鸡的模板检测Ct值分别为35.76±0.17和34.27±0.16。则该荧光定量PCR检测体系的检测下限为0.5ng。

（2）扩增内标对检测灵敏度的影响

以上述所得的最低检出限为目标基因模板量评价扩增内标对检测体系灵敏度的影响。将含有扩增内标的质粒原液10倍梯度稀释取2μL作为检测体系中内标的添加量，进行二重荧光定量PCR考察内标的添加量对基因组DNA灵敏度的影响。

结果显示，当用于检测猪肉和鸡肉成分的PCR体系中分别含有6×10⁴copies和7.5×10⁵copies的扩增内标质粒时，对于检测体系最低检出限Ct值影响小于0.2，此时两种扩增内标的Ct值分别为33.40±0.40和33.47±0.10。

7．重复性试验

分别取猪肉和鸡肉来源DNA各5份，加入优化好的内标添加量，按照上述进行荧光定量PCR，独立重复3次，考察方法的稳定性，结果见表3。结果显示，每个样品的3次独立重复实验Ct值的标准差均小于0.5。说明检测结果重复性好，检测稳定性好。

表3重复性试验结果

8．生肉和熟肉样品检测结果比较

分别将生肉来源和熟肉来源的DNA模板稀释到浓度为170ng/μL，按照上述条件进行荧光定量PCR（5个平行），比较生肉来源和熟肉来源DNA的检测结果。结果显示，生猪肉和熟猪肉DNA的检测Ct值分别为26.40±0.19和26.15±0.08，生鸡肉和熟鸡肉DNA的检测Ct值分别为27.58±0.36和26.77±0.29。可见，对于猪肉和鸡肉，生肉和熟肉来源的DNA检测结果均无显著差异，该检测体系不仅适用于生肉检测，同时还适用于熟肉制品的检测。

9．市售样本的实际检测

使用优化的荧光定量PCR方法对市售的38份牛肉制品进行鉴定，验证方法的实用价值。样本的分类与检测结果见表4。由表中可见，用鸡肉和猪肉掺假牛肉制品现象较为严重。对于牛肉干、牛肉粒等干制品，检出多为猪肉；而对于火腿肠、肉丸等由肉糜制成的产品多掺有猪肉和鸡肉。

表4.市售牛肉样品鉴定结果

Claims

1.一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）应用根据猪的beta actin基因或鸡的transforming growth factor基因设计扩增引物和Taqman探针，分别使用荧光基团FAM、HEX作为探针的发光基团；（2）设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒并设计相应探针；（3）以含有待检DNA模板，含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，阳性扩增内标DNA的Taqman探针，以及设计合成的猪beta actin基因扩增引物和Taqman探针，或鸡transforming growth factor基因扩增引物和Taqman探针的荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR反应；（4）应用ABI 7500SoftwareSDS1.4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果；其中步骤（2）所述的设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的方法为：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上、下游分别连接上目标物种的扩增引物序列，从而形成针对猪检测体系和鸡检测体系长度分别为98bp和94bp的阳性扩增内标DNA序列；将这两段扩增内标DNA序列委托人工基因合成，合成片段分别连接载体pGH，转化感受态细胞DH5α，小量提取并测序验证，得到分别针对猪肉和鸡肉检测体系的含有阳性扩增内标DNA的重组质粒。

2.根据权利要求1所述的一种添加有扩增内标的用于检测食品中猪肉或鸡肉成分的Taqman探针荧光定量PCR法，其特征在于：

猪beta actin基因扩增上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2，

探针为5’-FAM-ACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA-BHQ 1-3’；

鸡transforming growth factor基因扩增上游引物为SEQ ID NO.3，下游引物为SEQ ID NO.4，

探针为5’-HEX-CTGCCAAGCTCTGCCACTCCTCTG-BHQ 1-3’；

针对猪检测体系的阳性扩增内标DNA序列：SEQ ID NO.5；

针对鸡检测体系的阳性扩增内标DNA序列：SEQ ID NO.6；

阳性扩增内标DNA的Taqman探针为:5’-CY5-ATGACCAAAGCCTCCGGGCGTAG-BHQ3-3’。

3.根据权利要求1所述的一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，其特征是，所述荧光定量PCR反应体系为：20μL反应体系包含：模板DNA和含有阳性扩增内标DNA的重组质粒各2μL，Premix Ex Taq 10μL，靶基因探针溶液和扩增内标探针溶液各0.4μM，ROX校正溶液0.4μL，猪和鸡扩增体系中引物浓度分别为0.2μM和0.6μM。

4.根据权利要求1所述的一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃30s，40个循环的95℃5s和60℃34s。

5.权利要求1所述的一种添加扩增内标的食品中猪肉、鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法在食品质量控制和质量安全检测中的应用。