CN101397587A - 基于基因置换技术的活菌内标的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种生物技术领域的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法。包括：(1)上下游在基因置换过程中与目标基因发生双交换DNA的同源重组序列、扩增内标序列和卡那霉素抗性基因序列的选择和相应酶切位点的设计；(2)含上下游同源序列、内标序列和卡那霉素抗性基因的同源重组质粒pKSV7－UIKD的制备；(3)同源重组质粒的电转化感受态单核细胞增生李斯特菌及相应电转化后出现了供体性状的受体细胞转化子的筛选；(4)发生基因置换的单核细胞增生李斯特活菌内标的筛选；(5)通过在待检测样品中添加活菌内标等来验证所制备的扩增内标。本发明避免了由这些抑制成分所导致的假阴性现象的发生，从而大大提高了微生物荧光定量PCR检测的准确率。

Description

基于基因置换技术的活菌内标的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，具体地说是一种可广泛运用于荧光定量的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法。

背景技术

荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction的缩写)，是指：荧光定量聚合酶链式反应。荧光定量PCR技术是在普通PCR技术基础上发展起来的一种核酸定量技术，它是在普通的PCR系统中加人一种与目标片段序列互补的双标记荧光探针，该探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，当探针完整时，由于淬灭基团的作用，报告基团不能产生荧光；在PCR扩增中由于Taq酶的5’-3’外切酶的活性将探针酶切降解，使得荧光报告基团分离，淬灭基团对其淬灭作用解除，报告基团即可发出荧光信号，即每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，经特定的荧光分析仪测定相应的荧光强度，能够对PCR扩增的每一循环进行观察，然后与所建立的标准曲线进行比较，即可推算出目标片段的起始量。荧光定量PCR技术与以前的以终点法进行定量的普通PCR技术相比具有很大的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的灵敏性、重复性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行染胶、照胶等操作。目前它作为一个极有效的实验技术，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。但是荧光定量PCR方法在不同的实验室或检测部门所检测的目的基因和操作流程有一定的差异，没有形成统一标准，得到的检测结果也不尽相同。近年来的研究表明，增菌培养过程中抑制目标菌生长的成分、目标菌的收集效率和DNA提取过程目标菌的损失及残留的PCR抑制成分都会影响荧光定量PCR的最终检测结果，导致假阴性现象的发生。尽管荧光定量PCR方法在不断的改进和完善，却不能有效地阻止试验过程中假阴性结果的发生。为了解决荧光定量PCR方法中普遍存在的假阴性问题，近几年在荧光定量PCR扩增体系中引入了扩增内标。其主要原理是：在荧光定量PCR中使用与目的基因相似的扩增内标，它的两端引物结合序列与目的基因完全一致，但具有不同的探针结合序列，使之不能与目的基因的探针结合，只能与内标探针结合。于是，在含内标的荧光定量PCR体系中有两种DNA模板——目的基因片段和扩增内标；一对引物，该对引物既能与目标基因片段结合，也与扩增内标结合；两条探针——目标基因探针和扩增内标探针，分别结合目标基因片段和扩增内标。在扩增内标与目标片断的共同扩增中如果存在抑制现象，扩增内标的PCR扩增也将被抑制，从而达到指示PCR反应假阴性的目的。

制备IAC(扩增内标)的方法有很多，根据不同的实验目的和要求采用不同的制备方法。一般采用分子克隆技术，将一段人工构建的序列插入到质粒中。这段人工序列是利用克隆技术将目标序列的PCR产物通过插入、删除或者替换等手段处理后制备的。由于目前的扩增内标均是构建在质粒上然后直接添加到PCR反应体系中，无法象普通细菌一样添加到增菌培养液中与目标菌一起经历增菌培养、菌体收集、DNA提取及PCR扩增全过程，因此仅仅只能指示PCR扩增过程中的抑制成分，而无法监测增菌培养过程中影响目标菌生长的抑制因子、目标菌的收集效率和DNA提取过程中的目标菌损失率，这些都将在很大程度上影响最终的PCR检测结果，从而大大限制了它的广泛应用和相应技术标准化的进程。

经对现有技术的文献检索中发现，基因置换技术的出现和完善使得外源基因片段整合到细菌染色体上，如：Thomason L，Court DL.Recombineering：geneticengineering in bacteria using homologous recombination.Curr Protoc MolBiol.2007 Chapter 1：Unit1.16(Thomason L，Court DL，同源重组技术在细菌基因工程中的应用。分子生物学试验手册，2007第一章：第1.16节)。这使得内标序列不仅可以构建在质粒上还可以通过基因置换技术插入到细菌染色体中，成为带有内标序列的活菌内标，该活菌内标可以和目标菌一起共同经历增菌培养、菌体收集、DNA提取和PCR扩增的全过程。到目前为止还没有关于活菌内标运用于微生物PCR检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种基于基因置换技术的活菌内标的制备方法。本发明利用基因置换的方法，将一段内标序列通过与单核细胞增生李斯特菌CMCC 54002 hly基因双交换整合到单核细胞增生李斯特菌染色体上，制备单核细胞增生李斯特活菌内标，通过将活菌内标添加到待检样品中与野生单核细胞增生李斯特菌共同经历增菌培养、菌体收集、DNA提取和PCR扩增的全过程，实现单核细胞增生李斯特菌检测过程中假阴性现象的全程监控。本发明将所设计的活菌内标具有与目标菌相似的生长速度、DNA提取效率及PCR扩增效率，该活菌内标添加到待检样品中，有助于全程指示检测过程中的假阴性现象，提高检测结果的准确率，为满足临床和检疫执法过程中所急需的对致病微生物调查和检测提供有效可靠的技术手段。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明包括步骤如下：

(1)上下游同源重组序列、扩增内标序列和卡那霉素抗性基因序列的选择和相应酶切位点的设计；其中：同源重组序列，是指：在基因置换过程中与目标基因发生双交换的DNA序列。所述的目标基因，是指：单核细胞增生李斯特菌hly基因。

(2)含上下游同源序列、内标序列和卡那霉素抗性基因的同源重组质粒pKSV7-UIKD的制备；

(3)同源重组质粒的电转化感受态单核细胞增生李斯特菌及相应电转化后出现了供体性状的受体细胞转化子的筛选；

(4)发生基因置换的单核细胞增生李斯特活菌内标的筛选；

(5)基于基因置换技术的活菌内标制备方法的验证，通过在待检测样品中添加活菌内标与目标菌共同经历增菌培养、菌体收集、DNA提取和PCR扩增来验证所制备的扩增内标制备方法。

所述的同源重组质粒，是指：包含上下游同源序列、内标序列和卡那霉素抗性基因序列的温敏型质粒，当温度高于37℃时该质粒不能在宿主菌中复制，从而介导基因置换现象的发生。

所述的基因置换，是指：应用DNA同源重组原理，在上下游同源重组序列之间插入抗性基因做筛选标记，将质粒转入微生物中，通过同源序列的双交换，将抗性基因和目的基因置换到染色体上，并通过突变株的抗性进行筛选，从而得到整合有外源片段的突变菌株。

所述的扩增内标序列是人工设计的，具有与目标扩增序列相同的长度和GC含量，在确保与目标片断扩增效率一致性的同时与其它致病微生物基因组序列非同源。

所述的感受态单核细胞增生李斯特菌，是指：单核细胞增生李斯特菌细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，从而能够容纳许多包含外源DNA的载体分子通过的生理状态。

所述的电转化，是指：利用瞬间高压在感受态细胞上打孔，从而便于外源片段从孔洞中进入到细胞内的技术。

所述的活菌内标，是指：通过基因置换技术人工设计制备的含有扩增内标序列的突变菌株，具有与目标菌相似的生长速度、菌体收集效率、DNA提取效率及PCR扩增效率。其用途是全程显示致病微生物定量PCR检测中的假阴性现象，提高荧光定量PCR检测结果的准确率。

所述的假阴性，是指荧光定量PCR反应受到了增菌培养、菌体收集和DNA提取中的菌体损失及存在的抑制剂的影响而没有发生反应，或者是由于操作人员的操作失误导致结果呈现阴性。

所述的步骤4中的筛选，是指：在41℃和氯霉素存在的条件下连续传代含同源重组质粒的单核细胞增生李斯特菌转化子，涂氯霉素抗性平板挑选发生单交换的菌株；在30℃和不含抗生素的条件下连续传代挑选的单交换菌株，涂无抗平板，再将无抗平板上的菌落转接到卡那霉素抗性平板和氯霉素抗性平板，挑选卡那霉素抗性平板上长，氯霉素抗性平板上不长的疑似发生基因置换的菌落并进行PCR验证。

所述的步骤5中的评价，是指：分别采集牛奶、鸡肉和熏肉样品(无菌取样)，每份样品10g放入灭菌匀浆杯中加88ml改良单核细胞增生李斯特菌增菌培养液(UVM)充分匀浆，分别接入单核细胞增生李斯特菌CMCC54002菌液(～10³CFU/ml)1ml和相同浓度活菌内标菌株菌液(~10³CFU/ml)1ml；然后与纯培养的含活菌内标的单核细胞增生李斯特菌阳性对照一起在37℃的摇床(150r/min)中增菌培养，并且分别增菌0h、3h和6h后抽提菌体DNA作为荧光定量PCR模板，进行荧光定量PCR检测，同时，以无菌水代替DNA模板作空白对照。

本发明的活菌内标是添加到待测样品的增菌培养液中，该活菌内标与目标菌共同经历增菌培养、菌体收集、DNA提取和PCR扩增的全过程，并通过荧光定量PCR扩增过程中不同荧光染料标记的TaqMan探针进行结果分析，实现对目标菌检测过程中假阴性现象的全程监控。该方法能够指示目标菌从最初增菌培养、菌体收集、DNA提取到最终PCR扩增的整个检测过程中存在的抑制成分，避免了由这些抑制成分所导致的假阴性现象的发生，从而大大提高了微生物荧光定量PCR检测的准确率。

本发明涉及单核细胞增生李斯特菌，利用基因置换的方法，将一段内标序列通过与单核细胞增生李斯特菌CMCC 54002 hly基因双交换整合到单核细胞增生李斯特菌染色体上，制备单核细胞增生李斯特活菌内标(Listeriamonocytogenes-IAC)，通过将活菌内标添加到待检样品中与野生单核细胞增生李斯特菌共同经历增菌培养、菌体收集、DNA提取和PCR扩增的全过程，实现单核细胞增生李斯特菌检测过程中假阴性现象的全程监控。该活菌内标(Listeriamonocytogenes-IAC)于2008年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 208075。

附图说明

图1活菌内标制备步骤图例；

图中：步骤1：亚克隆质粒pSK-UID的制备；步骤2：亚克隆质粒pSK-UIKD的制备；步骤3：同源重组质粒pKSV7-UIKD的制备；步骤4：同源重组质粒与目标基因的双交换；步骤5：基因置换菌株(活菌内标)的筛选。

图2同源重组质粒pKSV7-UIKD酶切验证结果示意图；

图中：电泳泳道1：质粒pKSV7-UIKD；电泳泳道2：BamHI单酶切；电泳泳道3：BamH I、Kpn I双酶切；电泳泳道4：BamH I、Sal I双酶切；M：DNA分子量标准。

图3基因置换菌株筛选结果示意图；

图中：箭头所示在无抗生素平板及卡那霉素抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的菌株即为疑是基因置换菌株。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但保护范围不限于下述的实施例。

实施例

一、同源重组片段和相应酶切位点的设计

1.上游同源序列(UHF)的选择和酶切位点的设计

针对单核细胞增生李斯特菌的hly基因及其上游片段序列特征，设计上游同源序列扩增引物及相应酶切位点(Kpn I、Sal I)：

上游同源序列扩增引物(Hlyku-s/Hlyku-a)

Hlyku-s：5’-CTTGGTACCCGATGTACCGTATTCCTG-3’

Hlyku-a：5’-ATTGTCGACGGGTTTCACTCTCCTTCT-3’

(a)上游同源序列的序列特征：

*长度：551碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线形

(b)分子类型：DNA

(c)最初来源：单核细胞增生李斯特菌

(d)序列描述：SEQ ID NO.1

CGATGTACCGTATTCCTGCTTCTAGTTGTTGGTACAATGACATCGTTTGTGTTTGAGCTAGTGGTTTGGTTAATGTCCATGTTATGTCTCCGTTATAGCTCATCGTATCATGTGTACCTGGTATAGAGAGCGCTGCTAGGTTTGTTGTGTCAGGTAGAGCGGACATCCATTGTTTTGTAGTTACAGAGTTCTTTATTGGCTTATTCCAGTTATTAAGCGAATATGCTTTTCCGCCTAATGGGAAAGTAAAAAAGTATAAAATAAAACAGAGTAATAAAACTAATGTGCGTTGCAAATAATTCTTATACAAAATGGCCCCCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTGACTTTTATGTTGAGGCATTAACATTTGTTAACGACGATAAAGGGACAGCAGGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCC

2.下游同源序列(UDF)的选择和酶切位点的设计

针对单核细胞增生李斯特菌的hly基因及其下游片段序列特征，设计下游同源序列扩增引物及相应酶切位点(EcoR I、Pst I)：

下游同源序列扩增引物(Hlykd-s/Hlykd-a)

Hlykd-s：5’-CTTGAATTCAATAAAACCGCTTAACAC-3’

Hlykd-a：5’-TAACTGCAGTCAAGTAACCACCAGAAC-3’

(a)下游同源序列的序列特征：

*长度：565碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线形

(b)分子类型：DNA

(c)最初来源：单核细胞增生李斯特菌

(d)序列描述：SEQ ID NO.2

AATAAAACCGCTTAACACACACGAAAAAATAAGCTTGTTTTGCACTCTTCGTAAATTATTTTGTGAAGAATGTAGAAACAGGCTTATTTTTTAATTTTTTTAGAAGAATTAACAAATGTAAAAGAATATCTGACTGTTTATCCATATAATATAAGCATATCCCAAAGTTTAAGCCACCTATAGTTTCTACTGCAAAACGTATAATTTAGTTCCCACATATACTAAAAAACGTGTCCTTAACTCTCTCTGTCAGATTAGTTGTAGGTGGCTTAAACTTAGTTTTACGAATTAAAAAGGAGCGGTGAAATGAAAAGTAAACTTATTTGTATCATCATGGTAATAGCTTTTCAGGCTCATTTCACTATGACGGTAAAAGCAGATTCTGTCGGGGAAGAAAAACTTCAAAATAATACACAAGCCAAAAAGACCCCTGCTGATTTAAAAGCTTTGCCAGATTCCTGCGAAGCAAAAGATTTTTATAAAAATTTTAAAATTCTTGATATGACAAAAGATAAGCTAGGCGTTACGCATTATACGCTCGCGCTAAGTTCTGGTGGTTACTTGA

3.内标序列(synthetic sequence)的选择和酶切位点的设计

针对单核细胞增生李斯特菌的hly基因特征设计相应内标序列及酶切位点(Sal I、EcoR I)：

(a)扩增内标序列的序列特征：

*长度：144碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线形

(b)分子类型：DNA

(c)最初来源：人工合成

(d)序列描述：SEQ ID NO.3

CGACAAGACCATCACCAATATTCACAGCAGAAGCCACAGCATGGCACCACCAGCATCTATAGGAGCACTCGCCGCCCACATCATCGAAAAGAAACACGCGGATGTAAACTGGACCACGGTGACCTGCGAGCGAATTACTATTTG

4.卡那霉素抗性基因序列(Kan-R)的选择和酶切位点的设计

根据质粒pPIC9K上卡那霉素抗性基因序列特征设计扩增引物及相应酶切位点(EcoR I、EcoR I)：

卡那霉素抗性基因序列扩增引物(Kan-s/Kan-a)

Kan-s：5’-GGGGAATTCGGGGGGGAAAGCCACGTTG-3’

Kan-a：5’-GGGGAATTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTG-3’

(a)卡那霉素抗性基因序列的序列特征：

*长度：1209碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线形

(b)分子类型：DNA

(c)最初来源：质粒pPIC9K

(d)序列描述：SEQ ID NO.4

GGGGGGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCA

二、同源重组质粒pKSV7-UIKD制备

1.亚克隆质粒pSK-UIKD的制备

根据上游同源序列、下游同源序列、扩增内标序列和卡那霉素抗性基因序列各自酶切位点依次通过酶切酶连反应连接到质粒pSK上，制备亚克隆质粒pSK-UIKD(如图1步骤1、2所示)

2.同源重组质粒pKSV7-UIKD的制备

将亚克隆质粒pSK-UIKD用Kpn I和BamH I双酶切，酶切片段经凝胶电泳回收后与相应的经过Kpn I和BamH I双酶切的质粒pKSV7进行酶连反应，制备同源重组质粒pKSV7-UIKD。(如图1步骤3所示)

3.同源重组质粒pKSV7-UIKD的酶切验证

将同源重组质粒pKSV7-UIKD分别用BamHI单酶切、BamH I和Kpn I双酶切、BamH I和Sal I双酶切，经凝胶电泳分析电泳条带大小与试验设计相符，证明成功制备了同源重组质粒pKSV7-UIKD(如图2所示)。

三、同源重组质粒的电转化及相应转化子的筛选

1.感受态单核细胞增生李斯特菌的制备

取过夜培养的单核细胞增生李斯特菌1ml加入到100ml BHI(含0.5M蔗糖)培养液中培养4.5小时；加入100ul 10mg/ml青霉素G，继续培养2小时；离心并用HEPES(含0.5M蔗糖)洗涤两次；用5mlHEPES重悬菌体，并加入15ul 50mg/ml溶菌酶于37℃温育20分钟；离心并用HEPES洗涤两次，最后用1ml HEPES重悬菌体并分装到离心管保存。

2.同源重组质粒的电转化及转化子的筛选

将同源重组质粒加到单核细胞增生李斯特菌感受态细胞中，轻轻混匀后加入到电转杯中，以1KV、5ms进行电击，完毕后马上加入1ml BHI(含0.5M蔗糖)培养液，冰上放置30分钟；转到离心管中，30℃静置1小时；将菌液涂布到含氯霉素的BHI平板上，30℃培养两天；挑选平板上的菌落进行PCR验证，得到所需的转化子。

四、基因交换菌株的筛选(如图1步骤4、5所示)

1.单交换菌株的筛选

将阳性转化子转接到含氯霉素的BHI培养液中，接种量为1：1000，41℃温和振荡培养并连续传代6次；将第6代细菌培养物涂布到含氯霉素的BHI平板上，41℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落进行PCR验证，得到所需的单交换菌株。

2.双交换菌株的筛选

将单交换菌株接种到不含抗生素的BHI培养液中，30℃培养并连续传代4次，将第4次细菌培养物涂布到无抗BHI平板上，37℃过夜培养，挑选单个菌落分别点种到含卡那霉素的BHI平板和含氯霉素的BHI平板上，30℃培养过夜，在卡那霉素平板上生长而在氯霉素平板上不能生长的菌落即为可能的基因置换菌株(如图3所示)，经过进一步的PCR验证得到所需的基因交换菌株。

五、基于基因置换技术的活菌内标制备方法的验证

1.荧光定量PCR引物及探针

荧光定量PCR引物(hlyF/hlyR)

hlyF：5’-CATGGCACCACCAGCATC-3’

hlyR：5’-CATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’

单核细胞增生李斯特菌检测探针

5’-FAM-CCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCA-ECLIPCE-3’

活菌内标检测探针

5’-HEX-ATAGGAGCACTCGCCGCCCACATC-ECLIPCE-3’

2.荧光定量PCR反应条件的建立

确定的反应体系如下：

PCR循环参数为：45个循环，每个循环的程序包括95℃变性5s，退火延伸温度65℃，时间为20s，循环结束后降温至4℃，结束所有操作程序。

3.基于基因置换技术的活菌内标制备方法的验证

(1)取含10³CFU数量级的内标菌液1ml接种到98ml UVM改良李斯特菌增菌液中，然后将含10³CFU数量级的单核细胞增生李斯特菌CMCC54002菌液1ml接入其中，在37℃的摇床中增菌培养，分别增菌0h、3h和6h，以此作为阳性对照；

(2)分别采集牛奶、鸡肉和熏肉作为人工污染样品，将其放入灭菌的匀浆杯中，加88ml UVM改良李斯特菌增菌液，充分匀浆。取含10³CFU数量级的内标菌液和单核细胞增生李斯特菌菌液各1ml接种到该匀浆中，在37℃的摇床中增菌培养，分别增菌0h、3h和6h；

(3)将增菌液转入100ml离心管，3,000rpm离心5min，沉淀培养物中的食品残渣，取上清8,000rpm离心10min收集菌体；

(4)无菌水重悬菌体，抽提菌体DNA作为荧光定量PCR模板，进行荧光定量PCR检测，同时，以无菌水代替DNA模板作空白对照，根据野生菌和内标菌的扩增结果来对内标菌指示假阴性的能力进行验证(结果如表1—表4)。

表1 人工污染试验阳性对照结果

表2 人工污染牛奶样品检测结果

表3 人工污染鸡肉样品检测结果

表4 人工污染腌肉样品检测结果

根据荧光定量PCR检测后所得结果表明(见表1—表4)：阳性对照和牛奶样品中野生菌和活菌内标不经过增菌培养即可检出，鸡肉样品经增菌3h后野生菌和活菌内标方可检出，而腌肉样品要经增菌6h后野生菌和活菌内标才可检出。这说明本研究制备的活菌内标能很好指示出不同样品在整个检测过程中的出现的假阴性现象，而这些假阴性现象的产生不仅仅是由于PCR的无效扩增，还包括增菌过程中抑制细菌生长的成分、菌体收集及DNA提取过程中的菌体损失等，这些都是传统扩增内标无法参与的过程。

因此，本实施例可广泛运用于荧光定量PCR活菌内标的设计，所设计的活菌内标与待检样品中的微生物共同经历增菌培养、菌体收集、DNA提取和PCR扩增的全过程，实现对微生物检测过程中假阴性现象的全程监控。该方法有助于检测时显示假阴性现象的存在，提高检测结果的准确性，为满足临床和检疫执法过程中所急需的对致病微生物调查和检测提供有效可靠的技术手段。

Claims (9)

1、一种基于基因置换技术的活菌内标的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

(1)上下游在基因置换过程中与单核细胞增生李斯特菌hly目标基因发生双交换DNA的同源重组序列、扩增内标序列和卡那霉素抗性基因序列的选择和相应酶切位点的设计；

(2)含上下游同源序列、内标序列和卡那霉素抗性基因的同源重组质粒pKSV7-UIKD的制备；

(3)同源重组质粒的电转化感受态单核细胞增生李斯特菌及相应电转化后出现了供体性状的受体细胞转化子的筛选；

(4)发生基因置换的单核细胞增生李斯特活菌内标的筛选；

(5)通过在待检测样品中添加活菌内标与目标菌共同经历增菌培养、菌体收集、DNA提取和PCR扩增来验证所制备的扩增内标。

2、根据权利要求1所述的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法，其特征是，所述的基因置换，是指：应用DNA同源重组原理，在上下游同源重组序列之间插入抗性基因做筛选标记，将质粒转入微生物中，通过同源序列的双交换，将抗性基因和目的基因置换到染色体上，并通过突变株的抗性进行筛选，从而得到整合有外源片段的突变菌株。

3、根据权利要求1所述的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法，其特征是，所述的同源重组质粒，是指：包含上下游同源序列、内标序列和卡那霉素抗性基因序列的温敏型质粒，当温度高于37℃时该质粒不能在宿主菌中复制，从而介导基因置换现象的发生。

4、根据权利要求1所述的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法，其特征是，所述的扩增内标序列是人工设计的，具有与目标扩增序列相同的长度和GC含量，在确保与目标片断扩增效率一致性的同时与其它致病微生物基因组序列非同源。

5、根据权利要求1所述的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法，其特征是，所述的感受态单核细胞增生李斯特菌，是指：单核细胞增生李斯特菌细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，从而能够容纳许多包含外源DNA的载体分子通过的生理状态。

6、根据权利要求1所述的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法，其特征是，所述的电转化，是指：利用瞬间高压在感受态细胞上打孔，从而便于外源片段从孔洞中进入到细胞内的技术。

7、根据权利要求1所述的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法，其特征是，所述的活菌内标，是指：通过基因置换技术人工设计制备的含有扩增内标序列的突变菌株，具有与目标菌相似的生长速度、菌体收集效率、DNA提取效率及PCR扩增效率。

8、根据权利要求1所述的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法，其特征是，所述的步骤4中的筛选，是指：在41℃和氯霉素存在的条件下连续传代含同源重组质粒的单核细胞增生李斯特菌转化子，涂氯霉素抗性平板挑选发生单交换的菌株；在30℃和不含抗生素的条件下连续传代挑选的单交换菌株，涂无抗平板，再将无抗平板上的菌落转接到卡那霉素抗性平板和氯霉素抗性平板，挑选卡那霉素抗性平板上长，氯霉素抗性平板上不长的疑似发生基因置换的菌落并进行PCR验证。

9、根据权利要求1所述的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法，其特征是，所述的步骤5中的评价，是指：分别采集牛奶、鸡肉和熏肉无菌取样样品，每份样品10g放入灭菌匀浆杯中加88ml改良单核细胞增生李斯特菌增菌培养液充分匀浆，分别接入单核细胞增生李斯特菌CMCC54002 10³CFU/ml菌液1ml和相同浓度活菌内标菌株10³CFU/ml菌液1ml；然后与纯培养的含活菌内标的单核细胞增生李斯特菌阳性对照一起在37℃、150r/min的摇床中增菌培养，并且分别增菌0h、3h和6h后抽提菌体DNA作为荧光定量PCR模板，进行荧光定量PCR检测，同时，以无菌水代替DNA模板作空白对照。

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