CN102102127B - 一种适用于转人α-乳清蛋白基因牛的快速简便检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于转基因成分的检测技术领域，涉及一种转人α-乳清蛋白基因牛的转基因成分的快速检测方法。本发明与环介导等温扩增反应有关。步骤是：(1)引物设计：根据人α-乳清蛋白基因序列设计特异引物，该引物的序列如SEQ ID NO：1-4所示。(2)建立环介导等温扩增反应方法，即以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人α-乳清蛋白基因进行恒温扩增，得特异扩增片段。(3)对环介导恒温扩增产物进行分析：采用琼脂糖凝胶电泳和荧光染料染色对扩增产物进行分析，根据凝胶成像观察是否出现梯形条带，判定是否含有转基因成分；或在日光下肉眼观察将环介导等温扩增产物的结果。本发明简便，快速，特异性强，且成本较低，适合基层应用。
Description
技术领域
本发明属于转基因成分的检测技术领域，具体涉及一种转人α-乳清蛋白基因牛的转基因成分的快速简便的检测方法。
背景技术
转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提，在安全评价中转基因成分的检测是一项重要内容，建立转基因生物快速、简便、准确的检测方法为安全评价和管理奠定基础。
中国农业大学的李宁教授已经成功培育出了一批转人α-乳清蛋白转基因奶牛，数量达到了产业化规模。这标志着我国转基因奶牛新品种培育和动物生物反应器技术达到了国际先进水平，鉴于转人α-乳清蛋白基因奶牛生产技术的成熟以及其产品市场化的趋势，建立一种快速、简便的检测人α-乳清蛋白的方法，有很重要的必要性和紧迫性。
目前对于转基因成分的检测可从外源基因的核酸和蛋白质两个水平进行，核酸水平的检测应用更为广泛。核酸水平的检测，主要针对转入的外源基因的核苷酸序列并根据外源基因与内源基因的同源性设计检测方法，主要采用的方法是PCR扩增，即依据转入外源基因的启动子、目的基因、终止子及表达(重组)载体信息，设计特异性引物，进行聚合酶链式反应，依据产物的有无或多少判断是否为转基因产品。可以根据检测目的不同，将检测转基因生物及其产品的PCR技术分为两类：定性PCR和定量PCR。定性PCR主要是在PCR扩增之后，通过电泳初步鉴定结果为阳性或者阴性，PCR反应具有高灵敏度、高特异性、高效性的特点，是转基因产品初筛阶段的主要检测方法。定性PCR在常规PCR基础上根据研究需要还发展了多重PCR、巢式PCR、热不对称交错PCR和电化学发光PCR等。定量PCR可以对检测样品中转入基因的表达量和拷贝数进行量化检测。在进行转基因生物及其产品检测中根据不同需要和检测目的来选择进行定性或定量检测。
在进行外源基因核酸水平检测中通常需要进行PCR扩增和电泳检测两个环节，必须拥有PCR仪和电泳仪等设备，要求在实验室内完成检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于转人α-乳清蛋白基因牛的快速简便检测方法，利用环介导等温扩增法原理建立外源基因的快速检测方法，能准确快速检测出转基因牛中人α-乳清蛋白基因。本发明不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供借鉴。
实现本发明的技术方案如下：
(1)引物设计及合成：根据人α-乳清蛋白的基因序列(Gene Bank accession：NC_000012)设计特异性引物，所述引物的DNA序列如下所示：
FIP：5’-TTGAACCGAGGAGGCGGAGGCCAGACTGGAGTGCAATGG-3’(序列表SEQ ID NO：1)；
BIP：5’-GTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTTAGCCAGGCATGGTGGT-3’(序列表SEQ ID NO：2)；
F3：5’-GGTGGAGTTTCGCTCTTGTT-3’(序列表SEQ ID NO：3)；
B3：5’-ACATGGTGAAACCCTGTCTC-3’(序列表SEQ ID NO：4)。
(2)环介导等温扩增反应
以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人α-乳清蛋白DNA进行恒温扩增。反应体系为：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg2+2mM，8U Bst DNA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补ddH2O至25μl，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200μlEP管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst DNA聚合酶，于60℃下反应60min，然后置于80℃下5min终止反应；
(3)环介导恒温扩增产物分析
1)琼脂糖凝胶电泳：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(40％甘油，0.2％溴酚蓝，59.8％0.25MTris-Hcl)，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，得到凝胶成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则判定为含有人α-乳清蛋白基因(即含有转基因成分)，若没有阶梯型条带则判定为不含人α-乳清蛋白基因。
2)荧光染料染色：将SYBR Green I荧光染料稀释100倍(体积)后作为工作液，取5μl的环介导等温扩增产物，再加0.5μlSYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定为含有人α-乳清蛋白基因，若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物为棕色则判定为不含人α-乳清蛋白基因。
本发明所设计的两对特异引物成功建立了对人α-乳清蛋白快速、灵敏、特异而又简单实用的检测方法。与其它传统PCR方法相比该发明有以下优点：
1.本发明经济实用：反应是在恒温的条件下进行，所以不需要昂贵的PCR仪，只需要一台可以提供恒温的设备，例如水浴锅即可。
2.本发明的灵敏度高：采用本方法可以检测下限至10个拷贝的人α-乳清蛋白目的基因，比普通的PCR的灵敏度高100倍。
3.本发明的特异性强：本发明采用4条引物，可识别6个特异性区域，增加了与目的基因结合的特异性。
4.本发明的检出率高：对14头转人α-乳清蛋白的转基因牛进行检测，均检测出转基因成分，检出率为100％。
5.本发明检测简单：直接肉眼观察反应产物经SYBR Green I染色后的颜色变化来定性判断靶序列扩增与否。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1-4是本发明设计的扩增人α-乳清蛋白基因特异片段的引物序列。
序列表SEQ ID NO：5是本发明扩增的人α-乳清蛋白基因的特异片段。片段全长为184bp。
序列表SEQ ID NO：6是报道的人α-乳清蛋白基因序列。序列全长为2363bp。
图1：是本发明扩增的人α-乳清蛋白基因的特异片段(该序列与SEQ ID NO：5的序列是同一条序列)，片段全长为184bp，序列下划线部分为引物所处位置，序列中方框所示位置为限制性内切酶AIuI所识别的酶切位点。
图2：PCR扩增人α-乳清蛋白基因电泳图，图中：M：DL2000DNA marker；1-5：模板为人基因组DNA；6：模板为牛基因组DNA。
图3：LAMP扩增人α-乳清蛋白基因电泳图，图中：M：DL2000DNA marker；1-5：模板为总DNA；6：模板为牛基因组DNA。
图4：LAMP扩增人α-乳清蛋白基因可视化结果，图中1-5：模板为人总DNA；6：模板为牛基因组DNA；7：水。
图5：LAMP扩增产物酶切验证电泳图，图中：M：DL2000DNA marker；1：LAMP扩增产物；2：酶切后的LAMP扩增产物。
图6：PCR扩增人α-乳清蛋白基因电泳图，图中：M：DL2000DNA marker；1：模板为人基因组DNA。
图7：LAMP扩增人α-乳清蛋白检出限试验，图中：M：DL2000DNA marker；1-7：pMD18T-hLA质粒拷贝数依次106，105，104，103，102，10、5拷贝；8：牛的基因组DNA。
图8：LAMP扩增人α-乳清蛋白检出限试验可视化结果，图中：1-7：pMD18T-hLA质粒拷贝数依次106，105，104，103，102，10、5拷贝；8：牛的基因组DNA。
图9：PCR扩增人α-乳清蛋白检出限试验，图中：M：DL2000DNA marker；1-7：pMD18T-hLA质粒拷贝数依次106，105，104，103，102，10、5拷贝；8：牛的基因组DNA。
图10：LAMP检测转人α-乳清蛋白的转基因牛，图中：M：DL2000DNA marker；1-14：转人α-乳清蛋白基因的转基因牛；15：阳性对照，pMD18T-hLA质粒；16：阴性对照，牛基因组DNA。
图11：PCR检测转人α-乳清蛋白的转基因牛，图中：M：DL2000DNA marker；1-14：转人α-乳清蛋白基因的转基因牛；15：阳性对照，pMD18T-hLA质粒；16：阴性对照，牛基因细DNA。
具体实施方式
实施例1：对人α-乳清蛋白基因目的片段进行扩增
1、DNA的提取与纯化：按照常规方法采集人血样和牛血样，采用报道的酚-氯仿抽提法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译.分子克隆实验指南[M].科学出版社.北京：2005版方法)分别抽提人和牛基因组DNA，得到人或牛的基因组DNA。
2.常规PCR扩增
用常规的PCR扩增方法(萨姆布鲁克，黄培堂译.分子克隆实验指南[M].科学出版社.北京：2005)以两条外引物即编号为F3(序列表SEQ ID NO：3)、B3(序列表SEQ ID NO：4)的引物扩增人基因组DNA中α-乳清蛋白基因目的片段(其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：5或图1所示，序列全长为184bp)。同时以牛基因组DNA作为阴性对照。
1)反应体系：上游引物F3 0.2μM，下游引物B3 0.2μM，1μl PCR buffer，1.5mM Mgcl2，75μM dNTPs，0.5U DNA聚合酶，人基因组DNA 1μL，用双蒸水补齐至10μL。
2)反应程序：95℃，5min；34个循环：95℃1min，59℃1min，72℃20s；72℃，5min。
3)结果判定：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(配方：40％(v/v)甘油，60％(v/v)0.25MTris-Hcl，0.2％(w/v)溴酚蓝)，混匀，然后在2％的琼脂糖凝胶中电泳30min后，通过凝胶成像系统成像，可见长度为184bp的扩增片段，结果如图2所示。
3、LAMP扩增
以引物FIP(序列表SEQ ID NO：1)、引物BIP(序列表SEQ ID NO：2)的核苷酸序列为内引物，以引物F3(序列表SEQ ID NO：3)；、引物B3(序列表SEQ ID NO：4)所示的引物为外引物对人基因组DNA进行恒温扩增，同时以牛基因组DNA作为阴性对照。
1)反应体系：试剂组成如下：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg2+2mM，8U Bst DNA聚合酶，1μl模板，加外引物F3、B3各0.2μM，内引物FIP、BIP各1.6μM，补双蒸水至总体积25μl。
2)反应程序：将上述反应体系中除酶以外的所有试剂混匀置于200μl EP管中，于95℃反应5min，立即冰浴1-2min，再加入8U Bst DNA聚合酶，于60℃下反应60min，然后置80℃下5min终止反应。
3)结果分析与判定
①琼脂糖凝胶电泳：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(配方：40％(v/v)甘油，60％(V/V)0.25MTris-Hcl，0.2％(w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，在凝胶系统下成像，观察是否有阶梯型条带出现，若有阶梯型条带则判定为含有人α-乳清蛋白基因，若没有阶梯型条带则判定不含人α-乳清蛋白基因。
②荧光染料染色：SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5μl的环介导等温扩增产物，再加0.5μlSYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定含有人α-乳清蛋白基因，若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物为棕色则判定为不含人α-乳清蛋白基因。
③结果判定：在上述分析方法①中，在凝胶成相系统的紫外灯下，模板为人基因组DNA，即含有人的α-乳清蛋白基因时，可以观察到阶梯型条带，而模板为牛基因组DNA时，即不含人的α-乳清蛋白基因，则观察不到阶梯型条带，其结果如图3所示。在上述分析方法②中，当模板为人的基因组DNA，即含有人的α-乳清蛋白基因时，扩增产物变为黄绿色，当模板为牛基因组DNA时，扩增产物为棕色，其结果如图4所示。
4)LAMP扩增产物特异性检验：对LAMP扩增产物进行酶切验证。
LAMP扩增产物在电泳检测不是呈现一条带，而是呈现出由多条带组成的阶梯型条带，这是因为这种方法在扩增过程中形成以目的片段，连接在一起的长短不一的开环产物所造成。
本发明中α-乳清蛋白基因目的片段(其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：5或图1所示)大小为184bp，在113bp处存在限制性内切酶AluI所识别的酶切位点，因此可使用AluI对LAMP扩增产物进行酶切，验证LAMP扩增得到的阶梯型条带是否由α-乳清蛋白基因目的片段所组成，若阶梯型条带能被AluI识别而酶切，则酶切后电泳检测阶梯型条带不存在，则判定为阶梯型条带是由α-乳清蛋白基因目的片段所组成的，亦即LAMP扩增所得到的产物是α-乳清蛋白基因目的片段。
①酶切反应体系：取3μlLAMP扩增产物，加入0.8μl限制性内切酶AluI(购自Fermentas公司)和1μlbuffer，双蒸水补至10μl。
②反应程序：于37℃恒温培养箱中酶切6小时。
③结果判定：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(配方：40％(v/v)甘油，60％(v/v)0.25MTris-Hcl，0.2％(w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，在凝胶系统下成像，观察到酶切以后的LAMP扩增产物不再有阶梯型条带，结果如图5所示。结果说明本发明中LAMP扩增所得到的产物是α-乳清蛋白基因目的片段。
实施例2：人α-乳清蛋白LAMP检测方法检出限的试验
用含人α-乳清蛋白基因的质粒pMD18T-hLA作模板，验证检测人α-乳清蛋白LAMP方法的检出限，并与PCR方法的检出限作对比。具体步骤如下：
1、质粒pMD18T-hLA的构建
1)人α-乳清蛋白基因目的片段PCR产物的回收纯化
用PCR方法以两条外引物即引物F3(序列表SEQ ID NO：3)、引物B3(序列表SEQ ID NO：4)扩增人基因组DNA中α-乳清蛋白基因目的片段(其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：5或图8所示，序列全长为184bp)。反应体系：上游引物F30.2μM，下游引物B30.2μM，1μl PCR buffer，1.5mM Mgcl2，75μM dNTPs，0.5UDNA聚合酶，人基因组DNA 1μL，用双蒸水补齐至10μL。反应程序：95℃，5min；34个循环：95℃1min，59℃1min，72℃20s；72℃，5min。
取50μL PCR产物在2％琼脂糖凝胶中电泳30min，凝胶成相系统上成像。结果可以看到184bp大小的片段，结果如图6所示(其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：5或图1所示)。将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自北京原平皓生物技术有限公司)回收DNA。
2)目的片段PCR产物与pMD18-T载体连接：将回收产物与pMD18-T载体(购自武汉大风生物科技有限公司)连接，连接体系为：0.5μL pMD-18T载体，3.5μL solttion I，3μL回收产物，将上述试剂混匀后4℃连接过夜。
3)连接产物的转化、pMD18T-hLA质粒的鉴定及提取：取5μL连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃循环水中热击90s，快速冰浴1-2min使细胞冷却，加入500μL LB液体培养基，37℃摇床上培育45min，在4000rpm离心5min，弃去500μL上清液，将余下液体吹打均匀，吸取100μL涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平皿上，37℃培养12h。用经高压灭菌(121℃，高压蒸汽灭菌30min)的10μL移液器头挑取菌落置于800μL氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养4h，然后通过菌液PCR挑选阳性菌液，然后送上海生工生物工程技术有限公司测序，测序结果经比对确认以后，用质粒小提试剂盒(购自TIANGEN公司，按照试剂盒的说明书介绍的方法操作)提取质粒pMD18T-hLA。
4)计算质粒拷贝数
计算质粒拷贝数，其公式为：
(6.23×1023拷贝/mol)×(浓度g/ml)÷[碱基数×(660道尔顿/碱基)]＝拷贝数/ml
经计算质粒pMD18T-hLA拷贝数为：5.0×1013拷贝数/ml质粒
用双蒸水将质粒pMD18T-hLA进行倍比稀释，使其终浓度为25×107拷贝/μl，25×106拷贝/μl，25×105拷贝/μl，25×104拷贝/μl，25×103拷贝/μl，25×102拷贝/μl，25×101拷贝/μl。
2、LAMP方法检测灵敏度试验：
利用本实施例中所计算出的已知含有人α-乳清蛋白基因检测目的片段(184bp)拷贝数的质粒pMD18T-hLA为模板，采用LAMP方法和PCR方法进行检测灵敏度试验。
1)LAMP方法扩增不同拷贝数的质粒pMD18T-hLA
以引物F1P(序列表SEQ ID NO：1)、引物B1P(序列表SEQ ID NO：2)为内引物，以引物F3(序列表SEQ ID NO：3)、B3序列表SEQ ID NO：4)为外引物对本实施例中步骤1得到的质粒pMD18T-hLA进行LAMP扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为：106个，105个，104个，103个，102个，10，5个。
①反应体系：试剂如下：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg2+2mM，8U Bst DNA聚合酶，1μl模板，加外引物F3、B3各0.2μM，内引物FIP、BIP各1.6μM，补双蒸水至总体积25μl。
②反应程序：将上述反应体系除酶以外的所有试剂混匀置于200μl EP管中，95℃反应5min，立即冰浴1-2min，再加入8U Bst DNA聚合酶，于60℃下反应60min，然后置80℃下5min终止反应。
2)PCR方法扩增不同拷贝数的质粒pMD18T-hLA
同时以两条外引物F3(序列表SEQ ID NO：3)、B3(序列表SEQ ID NO：4)进行PCR扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为：106个，105个，104个，103个，102个，10，5个.
①反应体系：上游引物F30.2μM，下游引物B30.2μM，1μl PCR buffer，1.5mM Mgcl2，75μM dNTPs，0.5UDNA聚合酶，人基因组DNA 1μL，用双蒸水补齐至10μL。
②反应程序：95℃，5min；34个循环：95℃1min，59℃1min，72℃20s；72℃，5min。
2)结果分析：
经琼脂糖凝胶电泳后得到结果：当pMD18T-hLA质粒为10个拷贝时，LAMP方法能扩增出阶梯型条带，而当pMD18T-hLA质粒为5个拷贝时，LAMP方法未能扩增出阶梯型条带，因此判定LAMP对pMD18T-hLA质粒的扩增下限为10个拷贝，结果如图7所示。LAMP扩增产物中，取5μl加入0.5μlSYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果，结果：质粒拷贝数依次为：106个，105个，104个，103个，102个，10个时，扩增产物变为黄绿色，而质粒拷贝数为5时，扩增产物则为棕黄色。结果如图8所示。
经琼脂糖凝胶电泳后得到结果：当pMD18T-hLA质粒为103个拷贝时，PCR方法能扩增出特异性条带，当pMD18T-hLA质粒为102个拷贝时，PCR方法未能扩增出特异性条带，因此判定PCR方法对pMD18T-hLA质粒的扩增下限为103个拷贝，结果如图9所示。
因此，本实施例中，LAMP方法灵敏度高，采用本方法可以检测下限至10个拷贝的人α-乳清蛋白目的基因，比普通的PCR的灵敏度高100倍。
实施例3：对转人α-乳清蛋白的转基因牛进行LAMP检测
对14头转人α-乳清蛋白的转基因牛进行LAMP检测，同时用PCR的方法作为对照。试验中所用转基因牛的基因组DNA以及人的基因组DNA样品，均稀释到20ng/μl。
1)LAMP扩增过程：以FIP(序列表SEQ ID NO：1)、BIP(序列表SEQ ID NO：2)为内引物，F3(序列表SEQID NO：3)、B3(序列表SEQ ID NO：4)为外引物对人α-乳清蛋白DNA进行恒温扩增，反应体系为：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg2+2mM，8U Bst NDA聚合酶大片段，1μl模板，外引物各0.2μM，内引物各1.6μM，补ddH2O至25μl，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200μl EP管中，95℃反应5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，60℃反应60min，80℃反应5min后终止反应；
2)PCR扩增过程：用两条外引物F3、B3扩增人α-乳清蛋白基因组DNA中目的片段(184bp)，反应体系为：上游引物F3 0.2μM，下游引物B3 0.2μM，1μl PCR buffer，1.5mM Mgcl2，75μM dNTPs，0.5U DNA聚合酶，人基因组DNA 1μL，用双蒸水补齐至10μL。将上述试剂混匀后置于PCR仪中，反应参数设置为：95℃，5min；34个循环：95℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 20s；72℃，5min。
3)结果分析：
①琼脂糖凝胶电泳：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(40％(v/v)甘油，60％(v/v)0.25MTris-Hcl，0.2％(w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，得到凝胶成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则含有人α-乳清蛋白基因，若没有阶梯型条带则不含人α-乳清蛋白基因。
②荧光染料染色：将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5μl的环介导等温扩增产物，再加0.5μlSYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定为含有人α-乳清蛋白基因，若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物为棕色则判定为不含人α-乳清蛋白基因。
③结果判定：本实施例的LAMP检测方法以及作为对照的PCR方法均检测出了阳性转基因牛的α-乳清蛋白基因成分，结果分别如图10、图11所示。
Claims (1)
1.一种转人α-乳清蛋白基因牛的快速、简便检测方法，其步骤包括：
(1)引物设计及合成：根据人α-乳清蛋白的基因序列设计特异性引物，所述引物的DNA序列如下所示：
FIP：5’-TTGAACCGAGGAGGCGGAGGCCAGACTGGAGTGCAATGG-3’；
BIP：5’-GTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTTAGCCAGGCATGGTGGT-3’；
F3：5’-GGTGGAGTTTCGCTCTTGTT-3’；
B3：5’-ACATGGTGAAACCCTGTCTC-3’；
(2)环介导等温扩增反应：
以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人α-乳清蛋白基因进行恒温扩增，其反应体系为：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg2+2mM，8U Bst DNA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补双蒸水至25μl，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200μlEP管中，于95℃反应5min，反应后立即冰浴1-2min，加入8U Bst DNA聚合酶，于60℃反应60min，80℃下反应5min后终止反应；
(3)环介导恒温扩增产物分析：
1)琼脂糖凝胶电泳：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液，该缓冲液为40％甘油，0.2％溴酚蓝和59.8％0.25M Tris-HCl，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，得到凝胶成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则判定为含有人α-乳清蛋白基因，即含有转基因成分，若没有阶梯型条带则判定为不含人α-乳清蛋白基因；
2)将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5μl的环介导等温扩增产物，再加0.5μlSYBRGreen I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。
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