CN110628956A

CN110628956A - ASFV株和CD2v基因缺失株鉴别的双重荧光PCR引物及试剂盒

Info

Publication number: CN110628956A
Application number: CN201911087162.2A
Authority: CN
Inventors: 张志�; 李翠翠; 孙静; 张善鹏; 宫枫举; 官丽娟; 孙学强
Original assignee: Qingdao Lijian Diagnostic Technology Development Center
Current assignee: Qingdao Lijian Diagnostic Technology Development Center
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2019-12-31

Abstract

本发明涉及ASFV株和CD2v基因缺失株鉴别的双重荧光PCR引物及试剂盒，属于生物技术领域，所述的引物序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明还公开了包括所述引物的试剂盒：所述试剂盒由以下成分组成：荧光PCR反应液，包含所述引物的混合液，阳性对照和阴性对照；本发明的6条引物均置于一个管中，混在一起后使用，相互之间不干扰，不会影响后续的PCR扩增和荧光信号值的采集，且能够将非洲猪瘟野毒株和缺失毒株鉴别开。

Description

ASFV株和CD2v基因缺失株鉴别的双重荧光PCR引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的鉴别检测试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，其基因组为单股DNA病毒，大小为150-190kb，至少可以编码150多种蛋白质。ASFV可以感染各阶段的家猪和野猪，死亡率高达100％。ASFV可以通过直接接触和间接接触传播，污染了ASFV的猪肉、腌制的火腿、泔水、饲料、运输工具、人员等均都可以成为传染源。自1921年首次发现非洲猪瘟疫情以来，非洲猪瘟病毒通过飞机、轮船等多种途径，已经从非洲扩散到欧洲、亚洲等地。我国2018年也暴发了非洲猪瘟疫情，并由此造成了难以计数的经济损失。

我国生猪养殖数量占全球养猪总量的一半以上，“猪粮安天下”，生猪的养殖和供给关系人们的生活，也是国家密切关注的热点。如何防治好非洲猪瘟成为动物疫病防控的首要任务。根据疫病的防控规律和经验，急性传染病最有效、最经济的措施是进行基因缺失免疫，然后建立相应的鉴别检测方法进行免疫效果评价，但直到目前为止，非洲猪瘟还没有研制成功有效的疫苗。目前对非洲猪瘟最有效的防控措施主要是检测、扑杀、清除、消毒和常规的生物安全防控等，其中，非洲猪瘟病毒检测是防控非洲猪瘟的关键。目前最常用和最有效的检测方法是针对p72基因等建立的荧光PCR检测方法，可以在1-2小时内检出猪血液、组织样品、环境样品、饲料等中是否含有非洲猪瘟病毒，为采取后续防控措施提供技术支持。

在不断提升检测技术的同时，我国科学家也在加紧非洲猪瘟疫苗的研发工作，并取得了令人振奋的进展。根据国外学者O’Donnell等发现ASFV缺失MGF360和505基因会使ASFV毒力变弱的现象，我国学者步志高等(专利CN 110093324A)利用基因工程技术，获得了CD2V与MGF360-505R联合缺失的非洲猪瘟病毒双基因缺失株。将该双基因缺失株人工接种猪后，该缺失株的毒力明显减弱，不但不能引起猪发病和死亡，而且对我国非洲猪瘟病毒流行强毒的攻击可产生100％的免疫保护，因此有可能成为我国防控非洲猪瘟的疫苗。该基因缺失株制成的疫苗如果能够上市，将会产生巨大的经济效益。但与此同时，该基因缺失株也存在与野毒株难以鉴别的问题。除了致病性不同以外，该基因缺失株的其他特性与野毒株非常类似，同样可以在猪体内生长和增殖一段时间，同样利用现有的荧光PCR方法无法鉴别。因此，迫切需要解决非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失毒株有效鉴别的问题，以便针对性地采取相应的生物防控措施。

发明内容

本发明根据非洲猪瘟野毒株和缺失毒株无法鉴别的问题，研发了可以鉴别非洲猪瘟野毒株和非洲猪瘟病毒基因缺失株的鉴别方法，并在此基础上优化条件和试剂进一步研制成功了检测试剂盒。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一组ASFV株和基因缺失株鉴别的双重荧光PCR检测引物，所述的引物序列如下：

SEQ ID NO.1：5’-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-3’；

SEQ ID NO.2：5’-HEX-CACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCA-BHQ1-3’；

SEQ ID NO.3：5’-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3’；

SEQ ID NO.4：5’-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3’；

SEQ ID NO.5：5’-GAAGAAGAACAATGTCAGCATGAT-3’；

SEQ ID NO.6：5’-AACGACTGTAAGGCTTAGGAAGTAATG-3’；

其中，SEQ ID NO.1的5’端和3’端分别用FAM和MGB标记，与SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4组成检测p72基因的一套引物；

SEQ ID NO.2的5’端和3’端分别用HEX和BHQ1标记，与SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成检测CD2v基因的一套引物。

进一步，SEQ ID NO.1～6引物的工作浓度均为0.4μm。

本发明还提供一种包括上述引物组的试剂盒：所述试剂盒由以下成分组成：荧光PCR反应液，包含上述引物的混合液，阳性对照和阴性对照；

所述的荧光PCR反应液由Premix Ex Taq^TM酶和2×荧光PCR反应缓冲液混合而成，其中酶混合液中添加有Tli RNaseH；

所述引物混合液中引物SEQ ID NO.1～6的浓度均为1.3mM。

所述的阳性对照由含有p72基因和CD2v基因的阳性对照pASFV-PC-p72和pASFV-PC-CD2v的菌液混合而成，用引物SEQ ID NO.1～6检测后，Ct值均为24；

所述的阴性对照为不添加阳性对照菌液的TE缓冲液，用特异性检测p72基因和CD2v的荧光探针和引物检测后，未出现Ct值和特异性扩增。

本发明采用基因工程手段，利用中国流行的非洲猪瘟野毒株含有CV2v基因而基因缺失病毒株不含有CD2v基因、同时两种病毒都含有p72基因这一背景的前提下，分别针对这2个基因设计和标记2个不同的探针，一个探针位于p72基因，用FAM标记，只要该探针能够扩增出特异性产物，则说明该病毒含有p72基因，表明该病毒为含有p72基因的非洲猪瘟病毒；另一个探针位于CV2v基因，用HEX标记，只要该探针能够扩增出特异性产物，则说明该病毒含有CD2v基因，表明该病毒为含有CD2v的非洲猪瘟野毒株，扩增不出则表示该非洲猪瘟病毒为非洲猪瘟病毒基因缺失株。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明2套针对非洲猪瘟病毒CD2v和p72基因的荧光探针引物和对应的特异性引物，这6条引物均置于一个管中，混在一起后使用，相互之间不干扰，不会影响后续的PCR扩增和荧光信号值的采集。这套引物能够将非洲猪瘟野毒株和缺失毒株鉴别开。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明，但其内容不构成对本发明的限制。

实施例1

1.非洲猪瘟病毒p72基因和CD2v基因的特异性引物和探针的设计和合成根据GenBank上公布的非洲猪瘟病毒全基因组序列(MK333180)，用Primer Primer5.0软件设计分别可以检测p72基因和CD2v基因的特异性引物和探针，序列如下：

SEQ ID NO.1：5’-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-3’；

SEQ ID NO.2：5’-HEX-CACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCA-BHQ1-3’；

SEQ ID NO.3：5’-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3’；

SEQ ID NO.4：5’-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3’；

SEQ ID NO.5：5’-GAAGAAGAACAATGTCAGCATGAT-3’；

SEQ ID NO.6：5’-AACGACTGTAAGGCTTAGGAAGTAATG-3’；

SEQ ID NO.2的5’端和3’端分别用HEX和BHQ1标记，与SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成检测CD2v基因的一套引物；

SEQ ID NO.1～6引物的工作浓度均为0.4μm。

2.阳性对照和阴性对照的制备

2.1阳性对照特异性引物的设计和PCR扩增

根据GenBank上公布的非洲猪瘟病毒全基因组序列(MK333180)，在上述p72基因和CD2v基因的特异性引物和探针的两侧位置分别设计一对引物，用于扩增相应的p72基因和CD2v基因片段作为阳性对照用。引物分别为：p72-F：5’-GCATCAGGAGGAGCT-3’和p72-R：5’-GACTTAGGTACTGTAACGCAGCAC-3’；扩增CD2v的引物为：CD2v-F：5’-TGCTACTCCCCCAAATATCACATA-3’和CD2v-R：5’-ATAAGCGAAATATTTTGGGTAGAT-3’。扩增模板为非洲猪瘟病毒阳性DNA，由国家非洲猪瘟参考实验室提供。扩增体系为：95℃3min，(95℃30s,56℃60s,72℃75s)×35个循环，72℃10min。扩增结束后进行琼脂糖电泳，可以看到p72基因出现一条大小为1937bp的特异性条带，CD2v基因出现一条大小为726bp的特异性条带。

2.2阳性对照特异性片段的克隆

参照商品化的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的使用说明书，分别进行PCR产物的回收，并继进行连接反应，连接反应体系如下：pGEM-T easy Vector0.3uL、T4DNA Ligase0.5μl、2×Reaction Buffer 2.8μl、目的PCR纯化产物2μl放入EP管中，完成加样后，轻轻混匀各组分，并于16℃条件下反应1h，结束后置于冰上，进行转化实验。将连接产物转化DH5α感受态细胞，用涂菌棒将转化的菌液均匀铺开，正面向上放置于37℃恒温培养箱中培养16～18h。在挑选单个菌落用LB液体培养基进行振荡培养，37℃摇床中震荡培养12～16h。取2ml过夜培养的菌液加入离心管中，用常规DNA质粒提取方法提取质粒，再用EcoR I进行酶切鉴定，p72阳性者除了2.9kb大小的载体片段以外，还应有一条1937bp大小的目的片段，CD2v阳性者除了2.9kb大小的载体片段以外，还应有一条726bp大小的目的片段。同时用上述p72基因的引物对p72-F和p72-R以及CD2v基因的引物对CD2v-F和CD2v-R进行PCR鉴定，p72阳性者应有一条1937bp大小的特异性片段，CD2v阳性者应有一条726bp大小的特异性片段PCR。然后将，p72基因和CD2v基因的阳性对照分别命名为：pASFV-PC-p72和pASFV-PC-CD2v，阳性质粒和对应的菌液保存于-80℃。

2.3阳性对照最佳浓度的确定

分别以p72基因和CD2v基因的阳性对照pASFV-PC-p72和pASFV-PC-CD2v菌液作为模板，用TE缓冲液(含10mM的Triscl和1mM的EDTA，PH 8.0)以10倍倍比连续稀释，从原液一直稀释至10-10作为模板，再用引物SEQ ID NO.1～6进行荧光PCR扩增，计算Ct值为24的稀释倍数作为最佳浓度，然后将菌液按照此倍数进行稀释，每管0.5ml，分装后作为阳性对照使用。

2.4阴性对照的制备

阴性对照为不添加阳性对照菌液的TE缓冲液，每管0.5ml，分装后使用。

3非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的鉴别检测试剂盒的组装

非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的鉴别检测试剂盒的成分如下：

3.1荧光PCR反应液

由Premix Ex Taq^TM酶和2×荧光PCR反应缓冲液混合而成，其中酶混合液中添加有Tli RNaseH；Tli RNaseH为一种耐热性RNaseH，以DNA为模板进行PCR反应时可以很好的消除抑制PCR反应的阻碍物。

3.2引物混合液

由特异性检测p72基因和CD2v的荧光探针和引物混合而成，其中，引物SEQ IDNO.1～6的浓度均为1.3mM。

3.3阳性对照

由含有p72基因和CD2v基因的阳性对照pASFV-PC-p72和pASFV-PC-CD2v的菌液混合而成，用特异性检测p72基因和CD2v的荧光探针和引物检测后，Ct值均为24。

3.4阴性对照

阴性对照为不添加阳性对照菌液的TE缓冲液，用特异性检测p72基因和CD2v的荧光探针和引物检测后，未出现Ct值和特异性扩增。

3.5说明书

说明书1份，包括非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的鉴别检测试剂盒的成分、使用、结果判定和注意事项等内容。

实施例2养猪场免疫非洲猪瘟疫苗后猪血清中非洲猪瘟病毒的检测

1.1样品的来源

某地养猪场现存栏母猪2000头，已经免疫某种正处于中试阶段的非洲猪瘟疫苗1个月，仍有部分猪出现零星死亡，现采集部分血清进行非洲猪瘟病毒的检测。

1.2样品的处理

采用DNA提取试剂盒或自动核酸提取仪提取采集血清样品中的DNA，低温保存待检。

1.3扩增试剂准备

根据检测样品数量计算配液量，每个PCR反应含有12.5μl荧光PCR反应液和7.5μl引物混合液，吹打混匀后分装到PCR反应管中，每管20μl。依次取5μl阴性对照、5μl待检DNA和5μl阳性对照(充分混匀)分别加到不同的PCR反应管中，加样结束后应盖紧PCR反应管，每个PCR反应管内液体的体积为25μl，每个样品重复一次。

1.4PCR反应加样后将PCR反应管瞬时离心，然后置于荧光PCR仪内，进行如下反应：

1)95℃预变性20秒；2)95℃变性10秒，58℃延伸20秒，共45个循环；设置58℃收集FAM与HEX荧光信号。

2.1判定结果的有效性

FAM信号和HEX信号通道下，阳性对照同时应出现特异性扩增曲线且Ct值＜35，且阴性对照无特异性扩增曲线或无Ct值，则试验成立；否则试验不成立。

2.2结果判定的原则

2.2.1非洲猪瘟野毒株样品的扩增结果在FAM和HEX(VIC)信号通道下均有典型的扩增曲线且Ct值＜40时可判定为非洲猪瘟病毒野毒株核酸阳性。

2.2.2非洲猪瘟疫苗株当样品的扩增结果在HEX(VIC)信号通道下无特异性扩增曲线或无Ct值，而仅在FAM信号通道下有典型的扩增曲线且Ct值＜40时，可判定为非洲猪瘟病毒疫苗株核酸阳性。

2.2.3非洲猪瘟病毒核酸阴性样品的扩增结果在FAM信号和HEX(VIC)信号通道下均无Ct值或背景信号之下时，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。

2.4检测结果

12份血清样品中，共检测出7份p72基因的阳性样品，检测出2份CD2v基因的7份阳性样品，详见下表1，表明该猪场既有非洲猪瘟野毒感染，同时也存在CD2v基因缺失株。

表1血清样品检测结果

序列表

<110> 青岛立见诊断技术发展中心

<120> ASFV株和CD2v基因缺失株鉴别的双重荧光PCR引物及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatcgataag attgat 16

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caccacttcc atacatgaac catctccca 29

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atagagatac agctcttcca g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtatgtaaga gctgcagaac 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagaagaac aatgtcagca tgat 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aacgactgta aggcttagga agtaatg 27

Claims

1.一组ASFV株和基因缺失株鉴别的双重荧光PCR检测引物，其特征在于所述的引物序列如下：

SEQ ID NO.1：5’-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-3’；

SEQ ID NO.2：

5’-HEX-CACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCA-BHQ1-3’；

SEQ ID NO.3：5’-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3’；

SEQ ID NO.4：5’-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3’；

SEQ ID NO.5：5’-GAAGAAGAACAATGTCAGCATGAT-3’；

SEQ ID NO.6：5’-AACGACTGTAAGGCTTAGGAAGTAATG-3’；

其中，SEQ ID NO.1的5’端和3’端分别用FAM和MGB标记，与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成检测p72基因的一套引物；

2.根据权利要求1所述的一组ASFV株和基因缺失株鉴别的双重荧光PCR检测引物，SEQID NO.1～6引物的工作浓度均为0.4μm。

3.一种包括权利要求1所述引物组的试剂盒：所述试剂盒由以下成分组成：荧光PCR反应液、包含权利要求1所述引物的混合液、阳性对照和阴性对照；

所述引物混合液中引物SEQ ID NO.1～6的浓度均为1.3mM；

所述的阳性对照为含有p72基因和CD2v基因的pASFV-PC-p72和pASFV-PC-CD2v菌液混合而成，用引物SEQ ID NO.1～6检测后，Ct值均为24；

阴性对照阴性对照为不添加阳性对照菌液的TE缓冲液，用引物SEQ IDNO.1～6检测后，未出现Ct值和特异性扩增。