CN107604101B - 一种鸽新型腺病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸽新型腺病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，属于动物传染病学领域。本发明包括特异性引物和探针序列的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和优化，样本DNA提取及结果检测判定。本发明建立的检测鸽新型腺病毒的实时荧光定量PCR的引物和探针的方法，在检测鸽新型腺病毒上灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测31.2个拷贝，可用于检测临床样本中鸽新型腺病毒的感染检测。

Description

一种鸽新型腺病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种鸽新型腺病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，属于动物传染病学领域。

背景技术

根据国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy ofViruses，ICTV）分类，腺病毒科（Adenoviridae）下设5个属，分别为富AT腺病毒属（Atadenovirus）、禽腺病毒属（Aviadenovirus）、鱼腺病毒属（Ichtadenovirus）、哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）和唾液酸酶病毒属（Siadenovirus）。其中富AT腺病毒属有5个种，分别为牛腺病毒D型（Bovine adenovirus D）、绵羊腺病毒D型（Ovine adenovirus D）、袋鼠腺病毒A型（Possum adenovirus A）、蛇腺病毒A型（Snake adenovirus A）和鸭腺病毒A型（Duck adenovirus A）（也称鸭腺病毒1型，Duck adenovirus 1）。

腺病毒病毒颗粒为无囊膜的核衣壳呈二十面体对称结构，其基因组为线性双链DNA。腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白，分别为六邻体蛋白（Hexon）、纤维蛋白 (Fiber)和五邻体蛋白（Penton）。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。

鸽群感染腺病毒（鸽腺病毒PiAd）最早由Coussement等人于1984年在比利时报道。1995年De Herdt等人发现，鸽群可感染1型和2型腺病毒。2014年Marek 等人（Completegenome sequences of pigeon adenovirus 1 and duck adenovirus 2 extend thenumber of species within the genus Aviadenovirus. Virology. 2014, 462-463:107-114.）利用高通量测序技术测定了鸽腺病毒1型（PiAd-1）全基因序列，基因组全长为45480bp，和火鸡腺病毒的基因组结构特征类似。遗传进化分析发现，PiAd-1处于禽腺病毒属（Aviadenovirus）遗传进化分支。2017年，Teske等人（Identification of a novelaviadenovirus, designated pigeon adenovirus 2 in domestic pigeons (Columbalivia). Virus Res. 2017, 227:15-22.）报道了不同的鸽腺病毒1型（PiAd-1）和腺病毒2型（PiAd-2）的新型鸽腺病毒（PiAd-2 variant A和PiAd-2 variant B）（由于GenBank数据库中没有PiAd-2基因序列，作者为了论述严谨，将其命名为PiAd-2 variant A和PiAd-2variant B）。基于Hexon基因的遗传进化分析发现，新型鸽腺病毒（PiAd-2 variant A和PiAd-2 variant B）均处于禽腺病毒属（Aviadenovirus）遗传进化分支。2017年3月，本研究团队在对1例送检的病死鸽中，利用禽腺病毒的Hexon基因检测到阳性感染（命名为FJ2017株），并利用PCR技术获得其完整的Hexon基因序列（上传GenBank得到其登录号为MF576429）。其核苷酸序列和PiAd-1（GenBank号FN824512）同源性为35.2%、和PiAd-2variant A（GenBank号KX121164）同源性为34.1%、和PiAd-2 variant B（GenBank号KX164406）（说明，PiAd-2 variant B仅测定682bp的Hexon基因片段序列）同源性为83.9%。上述结果表明，我们获得鸽腺病毒为不同于经典鸽腺病毒（PiAd-1）的鸽新型腺病毒（N-PiAd）。

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标molecular Beacon。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。当前国内外尚未见实时荧光定量PCR检测鸽新型腺病毒的引物、探针及其方法相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是填补现有尚未见实时荧光定量PCR检测鸽新型腺病毒的引物和探针的方法相关研究报道空白，提供一种鸽新型腺病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测31.2个拷贝/μL，可用于对临床样本中鸽新型腺病毒的分子流行病学调查，为明确鸽新型腺病毒的分子流行病学特点提供检测方法和手段。

为实现上述目的，提供以下方法：

一种鸽新型腺病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含一对引物和探针，所述引物和探针设计如下：

根据鉴定的鸽新型腺病毒（FJ2017株，GenBank登录号为MF576429）六邻体蛋白蛋白（Hexon基因）编码的基因序列片段，设计特异性的针对鸽新型腺病毒的引物和探针，其序列如下：

上游引物N-PiAd -F：5’- GTACCTCAATGAGACTCC -3’，

下游引物N-PiAd -R：5’- GACCTGCATTTGGATTAG -3’；

所述探针序列N-PiAd -P为： 5’- CGGCTACCAATAACCAAGTCGC -3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

最佳反应体系为：Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)混合液12.5 μL、上/下游引物（N-PiAd-F和N-PiAd-R）（10 μmol/L） 各0.5 μL、探针（N-PiAd-P）（5 μmol/L）1 μL、模板2 μL、灭菌双蒸水补足至25 μL。最佳反应条件为：95℃ 1 min预变性；95℃ 10 s、62℃ 20s，共40个循环。

有益效果

本发明采用鸽新型腺病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针进行鸽新型腺病毒检测，具有以下优点和效果：

1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需2h，且一次可以同时进行96个样品检测。对临床收集的45份鸽源病料进行检测后发现，检测到3份鸽新型腺病毒感染阳性，阳性率为6.67%（3/45）。

2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中鸽新型腺病毒的Ct值，直接对其感染鸽新型腺病毒进行准确定量。

3、灵敏度高：最低可检测31.2个拷贝/μL。

4、特异性强：和鸽群中的常见传染病（如鸽瘟病毒、鸽圆环病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒）均无反应信号，仅对鸽新型腺病毒检测出现荧光信号。

5、重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行鸽新型腺病毒检测的组内变异系数为0.43-1.43%，组间变异系数0.54-2.24%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

附图说明

图1实时荧光定量检测鸽新型腺病毒的PCR方法的扩增曲线。1：3.12×10⁶ 拷贝/μL；2：3.12×10⁵ 拷贝/μL；3：3.12×10⁴ 拷贝/μL；4：3.12×10³ 拷贝/μL；5：3.12×10² 拷贝/μL；6：3.12×10¹ 拷贝/μL。

图2实时荧光定量检测鸽新型腺病毒的PCR方法的标准曲线。

图3实时荧光定量检测鸽新型腺病毒的PCR方法的特异性。1：鸽新型腺病毒；2：试验对照（鸽瘟病毒、鸽圆环病毒、鸽源禽1型副粘病毒、鸽源禽甲肝病毒和空白对照，由于均没有扩增，没有阳性荧光信号，无法区分。）。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、相关试验病原

试验用病原鸽新型腺病毒、鸽圆环病毒、鸽瘟病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

鸽新型腺病毒的鉴定

2.1 样品处理

2017年福建某地临床送检的病死鸽病料，小心采集其肝脏和脾脏组织，加入灭菌PBS（体积比为1∶5）研磨处理后，反复冻融3次，4 000 r/min离心20 min，吸取上清备用。

2.2 核酸DNA的提取

吸取200μL 1.2获得的上清加入1.5 mL离心管中，加入200 μL蛋白酶K和200 μLBB5缓冲液（使用前需加入5.6 μg Carrier RNA），震荡混匀后，置于56 ℃水浴30 min后参考北京全式金生物技术有限公司EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒说明书进行操作获得病料的核酸DNA，并按照试剂盒的方法同时提取试验对照毒株核酸，均放置-20℃保存备用。

2.3 Hexon 基因的PCR扩增

利用禽腺病毒的通用引物（序列为H-F1：5’-GAYRGYHGGRTNBTGGAYATGGG-3’和H-R1：5’- TACTTATCNACRGCYTGRTTCCA -3’，大小约为800bp）进行PCR扩增，结果可见有约800bp的特异性条带扩增，命名为FJ2017株。随后基于禽腺病毒的Hexon特征，分别设计引物（序列见表1）分两段（Hex-1和Hex-2）扩增，获得FJ2017株完整的Hexon基因序列。

表1 本研究使用的引物

使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液 25 μL、上下游引物（Hexon-F2/Hexon-R2和Hexon-F3/Hexon-R3）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸模板DNA 1 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5 min后进入循环，94℃变性50 s 、55℃退火35s、72 ℃延伸120 s，35个循环结束后，72℃终延伸10 min。

PCR反应结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将鸽新型腺病毒的Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。分别采用PCR扩增时的引物（Hexon-F2/Hexon-R2和Hexon-F3/Hexon-R3）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

2.4 Hexon基因的序列特征

利用SeqMan软件对克隆测定的序列进行BLAST分析，将符合预期的核苷酸序列进行拼接，获得鸽腺病毒FJ2017株的Hexon基因全长。结果可见，其Hexon基因全长为2832bp，编码943个氨基酸。从核苷酸同源性可见，其核苷酸序列和PiAd-1（GenBank号FN824512）同源性为35.2%、和PiAd-2 variant A（GenBank号KX121164）同源性为34.1%、和PiAd-2variant B（GenBank号KX164406）（说明，PiAd-2 variant B仅测定682bp的Hexon基因片段序列）同源性为83.9%。上述结果表明，获得鸽腺病毒为不同于经典鸽腺病毒（PiAd-1）的鸽新型腺病毒（N-PiAd）。将获得鸽新型腺病毒（PiAd-N）FJ2017株Hexon基因上传GenBank，获得其登录号为MF576429。

、鸽新型腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

3.1 引物和探针

根据鉴定的鸽新型腺病毒（FJ2017株，GenBank登录号为MF576429）六邻体蛋白蛋白（Hexon基因）编码的基因序列片段，设计特异性的针对鸽新型腺病毒的引物和探针，其序列如下：

上游引物N-PiAd -F：5’- GTACCTCAATGAGACTCC -3’，

下游引物N-PiAd -R：5’- GACCTGCATTTGGATTAG -3’；

所述探针序列N-PiAd -P为： 5’- CGGCTACCAATAACCAAGTCGC -3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

经NCBI数据库进行引物的Primer-BLAST分析。Primer-BLAST分析表明，本发明设计的相关引物特异性强、无交叉干扰，符合试验设计预期。

上述引物均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3.2 阳性标准品的构建

根据鉴定的鸽新型腺病毒（FJ2017株，GenBank登录号为MF576429）六邻体蛋白蛋白（Hexon基因）序列特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：N-PiAd-F3：5′- GAGTTCGGTACAGCATCAAC -3′和N-PiAd-R3：5′-ATTGTCCCTGAAACCGATGTAA -3′，用于扩增约623bp的Hexon基因片段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

以提取的鸽新型腺病毒（FJ2017株）核酸DNA为模板进行PCR扩增，使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液 25 μL、上下游引物（N-PiAd-F3和N-PiAd-R3）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸DNA1 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5 min后进入循环，94℃变性50 s 、55℃退火30s、72 ℃延伸50 s，35个循环结束后，72℃终延伸10 min。

PCR反应结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将鸽新型腺病毒的Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（N-PiAd-F3和N-PiAd-R3）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T-N-PiAd2），连续10倍稀释后，计算出对应的拷贝数，分装后置于-20 ℃保存备用。

3.3 TaqMan实时荧光定量PCR反应条件优化和标准曲线的建立

按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书配制25 μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度（52、54、56、58、60、62和64 ℃）、引物浓度（1.25、2.5、5.0、10和20 μmol/L）及探针浓度（1.25、2.5、5.0、10和20 μmol/L）下，对反应条件进行优化。分别以标准品（T-N-PiAd2）含量为3.12×10⁶、3.12×10⁵、3.12×10⁴、3.12×10³、3.12×10²和3.12×10¹拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）。

优化出最佳反应体系为：Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)混合液12.5 μL、上/下游引物（N-PiAd-F和N-PiAd-R）（10 μmol/L） 各0.5 μL、探针（N-PiAd-P）（5 μmol/L）1 μL、模板2 μL、灭菌双蒸水补足至25 μL。最佳反应条件为：95℃ 1 min预变性；95℃ 10 s、62℃20s，共40个循环。

从扩增动力学曲线（图1）可以看出，本研究建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为31.2拷贝/μL。以每个浓度标准品模板中拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸽新型腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线（见图2）的线性方程为y=－3.5277x+38.254，相关系数为0.999，扩增效率为99%，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。

3.4 特异性检测

用优化后的TaqMan实时荧光定量PCR条件分别对鸽源其他常见病原（如鸽圆环病毒、鸽瘟病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒）进行检测。

结果可见，对鸽源其他常见病原（如鸽圆环病毒、鸽瘟病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒）均无反应信号，仅对鸽新型腺病毒检测出现荧光信号。

3.5 重复性试验

用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为3.12×10⁶、3.12×10⁵、3.12×10⁴、3.12×10³、3.12×10²和3.12×10¹拷贝/μL的标准品进行检测，每种质粒含量重复4次，计算组内（intra-group）变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于－20 ℃保存，每隔7d取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测4次，计算组间（inter-group）变异系数。

结果可见（见表1），建立的TaqMan实时荧光定量PCR 方法检测标准阳性样品的结果可见（见表1），建立的TaqMan实时荧光定量PCR 方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.43-1.43%，组间变异系数0.54-2.24%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

表1实时荧光定量PCR变异系数

4临床应用

使用建立的鸽新型腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法对临床收集的45份鸽源病料进行检测后发现，检测到3份鸽新型腺病毒感染阳性，阳性率为6.67%（3/45）。

将相关阳性样品实时荧光定量PCR反应结束后的产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用实时荧光定量PCR扩增时的引物对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鸽新型腺病毒Hexon基因片段。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鸽新型腺病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

<130> 11

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtacctcaat gagactcc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacctgcatt tggattag 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggctaccaa taaccaagtc gc 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gayrgyhggr tnbtggayat ggg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

tacttatcna crgcytgrtt cca 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgaaacatgg ctgcgctcac t 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

tacttatcna crgcytgrtt cca 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atccggcatg aacgtggtag taga 24

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cttagactgc gttgcctgt 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gagttcggta cagcatcaac 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

attgtccctg aaaccgatgt aa 22

Claims (1)

1.一种鸽新型腺病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含一对引物和探针，序列如下：

上游引物N-PiAd -F：5’- GTACCTCAATGAGACTCC -3’，

下游引物N-PiAd -R：5’- GACCTGCATTTGGATTAG -3’；

所述探针序列N-PiAd -P为： 5’- CGGCTACCAATAACCAAGTCGC -3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

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