CN107586889B - 鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物 - Google Patents

Abstract

本发明提供鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，序列如SEQ ID NO.1‑2所示，具有很高的特异性和灵敏度。建立的方法能够对鸽群中鸽腺病毒感染进行检测，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察其溶解曲线峰值（Tm值）即可直接对结果进行判断。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

Description

鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物

技术领域

本发明提供鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，属于动物传染病学领域。

背景技术

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。当前，实时荧光定量的在非特异性荧光标记中，荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，分别为：不饱和染料（主要是SYBR GreenⅠ）和饱和染料（主要是EvaGreen）有两种常用的荧光染料。前期研究发现，EvaGreen对实时荧光定量PCR的抑制性远小于 SYBR Green I ，故EvaGreen 既可用于多重 PCR ，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（HRM），该分析正被越来越多的用于实时荧光定量PCR后的基因分型和异源双链分析。此外，EvaGree稳定性极强，且因其对细胞膜透性较低，而较SYBR GreenⅠ更加安全。

腺病毒病毒颗粒为无囊膜的核衣壳呈二十面体对称结构，其基因组为线性双链DNA。腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白，分别为六邻体蛋白（Hexon）、纤维蛋白 (Fiber)和五邻体蛋白（Penton）。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。鸽群感染腺病毒（鸽腺病毒PiAd）最早由Coussement等人于1984年在比利时报道。1995年De Herdt等人发现，鸽群可感染1型和2型腺病毒。2014年Marek 等人（Complete genome sequences of pigeon adenovirus 1and duck adenovirus 2 extend the number of species within the genusAviadenovirus. Virology. 2014, 462-463:107-114.）利用高通量测序技术测定了鸽腺病毒1型（PiAd-1）全基因序列，基因组全长为45480bp，和火鸡腺病毒的基因组结构特征类似。遗传进化分析发现，PiAd-1处于禽腺病毒属（Aviadenovirus）遗传进化分支。2017年，Teske等人（Identification of a novel aviadenovirus, designated pigeonadenovirus 2 in domestic pigeons (Columba livia). Virus Res. 2017, 227:15-22.）报道了不同的鸽腺病毒1型（PiAd-1）和腺病毒2型（PiAd-2）的鸽腺病毒（PiAd-2variant A和PiAd-2 variant B）（由于GenBank数据库中没有PiAd-2基因序列，作者为了论述严谨，将其命名为PiAd-2 variant A和PiAd-2 variant B）。基于Hexon基因的遗传进化分析发现，鸽腺病毒（PiAd-2 variant A和PiAd-2 variant B）均处于禽腺病毒属（Aviadenovirus）遗传进化分支。2017年3月，本研究团队在对1例送检的病死鸽中，利用禽腺病毒的Hexon基因检测到阳性感染（命名为FJ2017株），并利用PCR技术获得其完整的Hexon基因序列（上传GenBank得到其登录号为MF576429）。其核苷酸序列和PiAd-1（GenBank号FN824512）同源性为35.2%、和PiAd-2 variant A（GenBank号KX121164）同源性为34.1%、和PiAd-2 variant B（GenBank号KX164406）（说明，PiAd-2 variant B仅测定682bp的Hexon基因片段序列）同源性为83.9%。上述结果表明，我们获得鸽腺病毒为不同于经典鸽腺病毒（PiAd-1）的鸽腺病毒（novel pigeon adenovirus，N-PiAd）。因此，建立能够对鸽群鸽腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法，十分有利于在鸽群中开展鸽腺病毒的分子流行病学调查研究。但是，当前国内外尚未见基于饱和荧光染料Eva Green对鸽腺病毒进行检测实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域研究空白。

发明内容

本发明提供鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物, 建立能够同时对鸽群中鸽腺病毒检测的EvaGreen实时荧光定量PCR方法，简化操作程序、节约成本。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

鸽腺病毒双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，包括如下：

上游引物N-PiAd-SYF1：5’- GGTGCTTTCTAGCGTATACTATGA -3’，

下游引物N-PiAd-SYR1：5’- GTTGGTCGAAGTAATTGCTTGTCC -3’，

目的片段大小为148 bp。

用于检测鸽腺病毒的EvaGreen实时荧光定量PCR方法的试剂盒，包括以上所述的引物。

EvaGreen实时荧光定量PCR反应体系为：

实时荧光定量PCR反应体系（20 μL）为：Eva Green Mix混合液10.0 μL、上/下游引物（N-PiAd-SYF1和N-PiAd-SYR1）（10 μmol/L） 各0.3 μL、模板2 μL、用灭菌双蒸水补足至20 μL。最佳反应条件为：95℃ 1 min预变性；95℃ 10 s、58℃ 10s、72℃ 15s，共40个循环。循环结束后，做出溶解曲线。

结果判断：

实时EvaGreen荧光定量PCR反应结束后，观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果：若在Tm=（82.46±0.21）℃出现单一的特异性峰判为鸽腺病毒阳性。

本发明提供检测鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，具有以下优点和效果：

1、检测：建立的方法能够对鸽群中鸽腺病毒感染进行检测，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察其Tm值即可直接对结果进行判断。

2、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需90 min，且一次可以同时进行96个样品检测。

3、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，可根据检测待检样品中鸽腺病毒的Ct值，可直接对其感染鸽腺病毒进行准确定量。

4、灵敏度高：鸽腺病毒最低可检测71.5个拷贝。

5、特异性强：和鸽群中的常见传染病如鸽瘟病毒、鸽圆环病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒均无反应信号，仅对鸽腺病毒检测出现荧光信号。

对79份临床送检鸽源病料进行鸽腺病毒感染的EvaGreen实时荧光定量PCR检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的DNA，按照建立双重实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在Tm=（82.46±0.21）℃出现单一的特异性峰的样品有4份，即存在鸽腺病毒感染阳性样品4份，阳性率为5.06%。

附图说明

图1 实时荧光定量引物的特异性试验。1：鸽瘟病毒；2：鸽圆环病毒；3：鸽源禽1型副粘病毒；4：鸽源禽甲肝病毒；5：空白对照；6：鸽腺病毒；M：DL2000分子量标准。

图2 鸽腺病毒实时荧光定量PCR方法的扩增动力学曲线。

图3 鸽腺病毒实时荧光定量PCR方法的标准曲线。

图4鸽腺病毒实时荧光定量PCR方法的特异性。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1相关试验毒株

试验用病原鸽腺病毒、鸽瘟病毒、鸽圆环病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

引物和设计

根据GenBank中检索到的鸽腺病毒特异性Hexon基因编码区序列特征，设计特异性的针对鸽腺病毒的引物，其序列如下：

用于检测鸽腺病毒：

上游引物N-PiAd-SYF1：5’- GGTGCTTTCTAGCGTATACTATGA -3’，

下游引物N-PiAd-SYR1：5’- GTTGGTCGAAGTAATTGCTTGTCC -3’，

目的片段大小为148 bp。

上述引物均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

引物的特异性分析

利用上述引物（N-PiAd-SYF1/N-PiAd-SYR1）对鸽腺病毒、鸽瘟病毒、鸽圆环病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒提取的核酸DNA进行常规PCR扩增，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（浓度均为10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为： 94 ℃预变性4 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸 10min。反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。

结果可见（见图1），仅N-PiAd-SYF1/N-PiAd-SYR1对鸽腺病毒出现特异性目的条带，但上述条带经常规琼脂糖凝胶电泳无法科学有效区分；对其他病原（鸽瘟病毒、鸽圆环病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒）均未见特异性条带扩增。上述结果表明设计的实时荧光定量PCR试验的相关引物，特异性强。

鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立

4.1 核酸DNA的提取

用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Viral DNA/RNA Kit按照说明书方法进行操作提取（FJ2017株，GenBank登录号为MF576429）的核酸DNA，并按照试剂盒的方法同时提取试验对照毒株的核酸DNA，均放置-20℃保存备用。

4. 2 PCR扩增

根据鉴定的鸽腺病毒（FJ2017株，GenBank登录号为MF576429）六邻体蛋白蛋白（Hexon基因）序列特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：N-PiAd-F2：5′-GACCTTCCTTCAAACCCTAT-3′和N-PiAd-R2：5′-TTCATGCCGGATCGTTCAGA-3′，用于扩增约607bp的Hexon基因片段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

以提取的鸽腺病毒（FJ2017株）核酸DNA为模板进行PCR扩增，使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液25 μL、上下游引物（N-PiAd-F2和N-PiAd-R2）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸DNA 1 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5min后进入循环，94℃变性50 s 、55℃退火30s、72 ℃延伸45 s，35个循环结束后，72℃终延伸10 min。

PCR反应结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将鸽TTV基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（N-PiAd-F2和N-PiAd-R2）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T-N-PiAd2），分装后置于-20 ℃保存备用。

4. 3 实时荧光定量PCR反应条件优化和标准曲线的建立

以鸽腺病毒阳性标准品（T-N-PiAd2）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为7.15×10⁶、7.15×10⁵、7.15×10⁴、7.15×10³、7.15×10²和7.15×10¹拷贝/μL），在不同退火温度（54、56、58、60、62和64 ℃）、引物浓度（1.25、2.5、5.0、10和20 μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线，扩增结束后生成对应的溶解曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。

优化出最佳反应体系（20 μL）为：Eva Green Mix混合液10.0 μL、上/下游引物（N-PiAd-SYF1和N-PiAd-SYR1）（10 μmol/L） 各0.3 μL、模板2 μL、用灭菌双蒸水补足至20 μL。最佳反应条件为：95℃ 1 min预变性；95℃ 10 s、58℃ 10s、72℃ 15s，共40个循环。循环结束后，做出溶解曲线。

从扩增动力学曲线（图2）可以看出，本研究建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为71.5拷贝/μL。以每个浓度标准品模板中拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸽腺病毒实时荧光定量PCR标准曲线（见图3）的线性方程为y=－3.7186x+41.159，相关系数为0.998，扩增效率为99%，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。

4. 4 特异性试验

取鸽腺病毒、鸽圆环病毒、鸽瘟病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒提取的核酸DNA，分别用优化后的鸽腺病毒实时荧光定量PCR方法进行检测，观察溶解曲线峰值（Tm值）。

从图4可以看出，在Tm=（82.46±0.21）℃出现单一的特异性峰判为鸽腺病毒阳性。对其他病原（如鸽圆环病毒、鸽瘟病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒）均未见特异性溶解曲线峰值，表明建立的鸽腺病毒实时荧光定量PCR方法特异性强。

4. 5 重复性试验

用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为7.15×10⁶、7.15×10⁵、7.15×10⁴、7.15×10³、7.15×10²和7.15×10¹拷贝/μL的标准品进行检测，每种质粒含量重复4次，计算组内（intra-group）变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20 ℃保存，每隔7 d取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测4次，计算组间（inter-group）变异系数。

结果可见（见表1），建立的实时荧光定量PCR 方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.49-1.74%，组间变异系数0.61-2.33%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

表1实时荧光定量PCR变异系数

4.6 临床应用

对79份临床送检鸽源病料进行鸽腺病毒感染的EvaGreen实时荧光定量PCR检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的DNA，按照建立双重实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在Tm=（82.46±0.21）℃出现单一的特异性峰的样品有4份，即存在鸽腺病毒感染阳性样品4份，阳性率为5.06%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtgctttct agcgtatact atga 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttggtcgaa gtaattgctt gtcc 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaccttcctt caaaccctat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcatgccgg atcgttcaga 20

Claims (2)

1.鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于：所述引物序列如下：

上游引物N-PiAd-SYF1：5’- GGTGCTTTCTAGCGTATACTATGA -3’，

下游引物N-PiAd-SYR1：5’- GTTGGTCGAAGTAATTGCTTGTCC -3’，

目的片段大小为148 bp。

2.包含权利要求1所述引物的鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测试剂盒。

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