CN107604102B

CN107604102B - 鸽TTV和鸽新型腺病毒双重Real time PCR检测试剂盒

Info

Publication number: CN107604102B
Application number: CN201711069739.8A
Authority: CN
Inventors: 万春和; 黄瑜; 陈翠腾; 程龙飞; 傅光华; 施少华; 陈红梅; 傅秋玲; 刘荣昌
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2037-11-03
Also published as: CN107604102A

Abstract

本发明提供一种鸽TTV和鸽新型腺病毒双重Real time PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括以下2对引物和2条探针，具体序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明通过所述试剂盒建立能够同时对鸽群中鸽TTV和鸽新型腺病毒鉴别诊断的检测方法，操作程序简化、节约成本。

Description

鸽TTV和鸽新型腺病毒双重Real time PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于动物病毒学检测领域，具体涉及一种鸽TTV和鸽新型腺病毒双重Realtime PCR检测试剂盒。

背景技术

输血传播病毒，又称Torque teno virus (TTV)，根据国际病毒分类委员会（ICTV）最新分类，将其归类于指环病毒科(Anelloviridae)，α细环病毒属(Alphatorquevirus)。TTV是一类无囊膜、单链环状DNA病毒，研究发现不同种属的TTV病毒基因组长短不一。人源TTV的基因组为3.2kb～3.9kb，猪和犬类的基因组为2.8kb左右，而猫科TTV的基因组约为2.1kb。对TTV的分析发现，TTV基因组有编码区和非编码区组成。一般认为，TTV包含有2个大的开放阅读框（ORFs）：ORF1和ORF2，分别编码复制相关蛋白（Rep）和抗原相关蛋白（Cap）。鸽感染TTV最早于2013年在国内报道（Zhang Z, Zhuang L, Dai W, Mao H, Dai D.Completegenome sequence of a novel pigeon torque teno virus in China. Genome Announc,2013, 1(6). pii: e01076-13.）。目前，由于鸽TTV无法分离培养，关于鸽TTV致病力、致病机理等相关研究还未见涉及。

腺病毒病毒颗粒为无囊膜的核衣壳呈二十面体对称结构，其基因组为线性双链DNA。腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白，分别为六邻体蛋白（Hexon）、纤维蛋白 (Fiber)和五邻体蛋白（Penton）。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。

鸽群感染腺病毒（鸽腺病毒PiAd）最早由Coussement等人于1984年在比利时报道。1995年De Herdt等人发现，鸽群可感染1型和2型腺病毒。2014年Marek 等人（Completegenome sequences of pigeon adenovirus 1 and duck adenovirus 2 extend thenumber of species within the genus Aviadenovirus. Virology. 2014, 462-463:107-114.）利用高通量测序技术测定了鸽腺病毒1型（PiAd-1）全基因序列，基因组全长为45480bp，和火鸡腺病毒的基因组结构特征类似。遗传进化分析发现，PiAd-1处于禽腺病毒属（Aviadenovirus）遗传进化分支。2017年，Teske等人（Identification of a novelaviadenovirus, designated pigeon adenovirus 2 in domestic pigeons (Columbalivia). Virus Res. 2017, 227:15-22.）报道了不同的鸽腺病毒1型（PiAd-1）和腺病毒2型（PiAd-2）的新型鸽腺病毒（PiAd-2 variant A和PiAd-2 variant B）（由于GenBank数据库中没有PiAd-2基因序列，作者为了论述严谨，将其命名为PiAd-2 variant A和PiAd-2variant B）。基于Hexon基因的遗传进化分析发现，新型鸽腺病毒（PiAd-2 variant A和PiAd-2 variant B）均处于禽腺病毒属（Aviadenovirus）遗传进化分支。2017年3月，本研究团队在对1例送检的病死鸽中，利用禽腺病毒的Hexon基因检测到阳性感染（命名为FJ2017株），并利用PCR技术获得其完整的Hexon基因序列（上传GenBank得到其登录号为MF576429）。其核苷酸序列和PiAd-1（GenBank号FN824512）同源性为35.2%、和PiAd-2variant A（GenBank号KX121164）同源性为34.1%、和PiAd-2 variant B（GenBank号KX164406）（说明，PiAd-2 variant B仅测定682bp的Hexon基因片段序列）同源性为83.9%。上述结果表明，我们获得鸽腺病毒为不同于经典鸽腺病毒的鸽新型腺病毒（N-PiAd）。

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高，目前常用的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标（molecular Beacon）。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC、ROX、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA等。实时荧光定量PCR技术在检测病原时不仅可以定性检测病原的有无，而且还可以定量分析病毒含量的多少，在病原核酸检测技术上被广泛使用。多重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测多种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。

当前，在鸽群中存在鸽TTV和鸽新型腺病毒（N-PiAd）感染，且2个病原的核酸类型均为DNA。因此，建立能够同时对鸽群中鸽TTV和鸽新型腺病毒的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，既可对鸽群中流行的2种核酸类型均为DNA的病原进行检测，又可简化操作程序、节约成本，十分有利于在鸽群中开展相关病原的分子流行病学调查研究。但是，当前国内外尚未见可同时对鸽TTV和鸽新型腺病毒进行检测双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的引物和探针的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域研究空白。

发明内容

本发明提供鸽TTV和鸽新型腺病毒双重TaqMan实时荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒, 建立能够同时对鸽群中鸽TTV和鸽新型腺病毒鉴别诊断的检测方法，操作程序简化、节约成本。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

鸽TTV和鸽新型腺病毒双重TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括以下引物和探针：

用于检测鸽TTV：

上游引物PiTTV-F：5’- GCATCTGAAATCAAGGTA -3’，

下游引物PiTTV-R：5’- TGTGGGATTCCTGAATAG -3’，

荧光探针PiTTV-P：5’- CTCATCAACAGCTTGACCATTCCAC -3’；

用于检测鸽新型腺病毒：

上游引物N-PiAd-F：5’- GGTGCTTTCTAGCGTATA -3’，

下游引物N-PiAd-R：5’- GTTGGTCGAAGTAATTGC -3’，

荧光探针N-PiAd-P：5’- TGTCCTCCTTGTTCATTCACTGGT -3’。

鸽TTV的荧光探针PiTTV-P的5′端标记有荧光报告基团ROX、鸽新型腺病毒的荧光探针N-PiAd-P的5′端标记有荧光报告基团FAM；鸽TTV的荧光探针PiTTV-P的3′端和鸽新型腺病毒的荧光探针N-PiAd-P的3′端均标记淬灭基团Eclipse。

双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系

*临床检测时，直接加入2μL待检测样品提取的核酸DNA。

结果：优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为： 95 ℃预变性60 s；95 ℃ 10s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40个循环。

本发明的优点在于：

1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。

2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中鸽TTV和鸽新型腺病毒的Ct值，直接对其感染鸽TTV和鸽新型腺病毒进行准确定量。

3、灵敏度高：检测鸽TTV最低检测限为17.2拷贝/μL、检测鸽新型腺病毒最低检测限为9.75拷贝/μL。

4、特异性强：和鸽群中的常见传染病（如鸽瘟病毒、鸽圆环病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒）均无反应信号，仅对鸽TTV和鸽新型腺病毒在特异性的荧光信号通道检测出现荧光信号。

附图说明

图1 鸽TTV TaqMan实时荧光定量PCR方法的扩增曲线。

图2 鸽TTV TaqMan实时荧光定量PCR方法的标准曲线。

图3 鸽TTV TaqMan实时荧光定量PCR方法的特异性试验。

图4 鸽新型腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的扩增曲线。

图5 鸽新型腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的标准曲线。

图6 鸽新型腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的特异性试验。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1 相关试验病原

试验用病原鸽TTV、鸽新型腺病毒、鸽圆环病毒、鸽瘟病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

引物和探针设计

根据GenBank中检索到的鸽TTV基因组序列和鸽新型腺病毒特异性Hexon基因编码区序列特征，设计特异性的针对鸽TTV和鸽新型腺病毒的引物和探针，其序列如下：

用于检测鸽TTV：

上游引物PiTTV-F：5’- GCATCTGAAATCAAGGTA -3’，

下游引物PiTTV-R：5’- TGTGGGATTCCTGAATAG -3’，

荧光探针PiTTV-P：5’- CTCATCAACAGCTTGACCATTCCAC -3’；

用于检测鸽新型腺病毒：

上游引物N-PiAd-F：5’- GGTGCTTTCTAGCGTATA -3’，

下游引物N-PiAd-R：5’- GTTGGTCGAAGTAATTGC -3’，

荧光探针N-PiAd-P：5’- TGTCCTCCTTGTTCATTCACTGGT -3’；

其中，鸽TTV的荧光探针PiTTV-P的5′端标记有荧光报告基团ROX、鸽新型腺病毒的荧光探针N-PiAd-P的5′端标记有荧光报告基团FAM；鸽TTV的荧光探针PiTTV-P的3′端和鸽新型腺病毒的荧光探针N-PiAd-P的3′端均标记淬灭基团Eclipse。

上述引物均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

鸽TTV和鸽新型腺病毒双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

3.1 鸽TTV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

3.1.1 核酸DNA的提取

用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Viral DNA/RNA Kit按照说明书方法进行操作提取鸽TTV（FJ17290株、GenBank登陆号MF576435）的DNA，并按照试剂盒的方法同时提取试验对照毒株的核酸DNA，均放置-20℃保存备用。

3.1.2 PCR扩增

根据鉴定的鸽TTV（FJ17290株、GenBank登陆号MF576435）基因组序列特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：PiTTV-F2：5′-CTCTTTCGTGCCAAGTTGTCCCT -3′和PiTTV-R2：5′- CGTCTGCGTTGTGGTGTAGT -3′，用于扩增约888 bp的鸽TTV基因片段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

以提取的鸽TTV（FJ17290株）核酸DNA为模板进行PCR扩增，使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液 25 μL、上下游引物（PiTTV-F2和PiTTV-R2）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸DNA 1 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5 min后进入循环，94℃变性50 s 、54℃退火30s、72 ℃延伸60 s，30个循环结束后，72℃终延伸10min。

PCR反应结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将鸽TTV基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（PiTTV-F2和PiTTV-R2）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- PiTTV2），分装后置于-20 ℃保存备用。

3.1.3 TaqMan实时荧光定量PCR反应条件优化和标准曲线的建立

按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书配制25 μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度（52、54、56、58、60、62和64 ℃）、引物浓度（2.5、5.0、10和20μmol/L）及探针浓度（1.25、2.5、5.0、10和20 μmol/L）下，对反应条件进行优化。分别以标准品（T-PiTTV2）不同稀释度标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）。

优化出最佳反应体系为：Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)混合液12.5 μL、上/下游引物（PiTTV-F和PiTTV-R）（5 μmol/L）各1 μL、探针（PiTTV-P）（5 μmol/L）2 μL、模板2 μL、灭菌双蒸水补足至25 μL。最佳反应条件为：95℃ 1 min预变性；95℃ 10 s、58℃ 10s、72℃ 15s，共40个循环。

从扩增动力学曲线（图1）可以看出，本研究建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为17.2拷贝/μL。以每个浓度标准品模板中拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸽TTVTaqMan实时荧光定量PCR标准曲线（见图2）的线性方程为y=－3.1791x+37.862，相关系数为0.997，扩增效率为100%，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。

3.1.4 特异性检测

用优化后的TaqMan实时荧光定量PCR条件分别对鸽源其他常见病原（如鸽瘟病毒、鸽圆环病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒）进行检测。

结果可见（图3），对鸽源其他常见病原（如鸽瘟病毒、鸽圆环病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒）均无反应信号，仅对鸽TTV检测出现荧光信号。

3.1.5 重复性试验

用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为1.72×10⁶、1.72×10⁵、1.72×10⁴、1.72×10³、1.72×10²和1.72×10¹拷贝/μL的标准品进行检测，每种质粒含量重复4次，计算组内（intra-group）变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于－20 ℃保存，每隔7 d取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测4次，计算组间（inter-group）变异系数。

结果可见（见表1），建立的TaqMan实时荧光定量PCR 方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.44-1.44%，组间变异系数0.59-2.07%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

表1实时荧光定量PCR变异系数

3.2 鸽新型腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

3.2.1阳性标准品的构建

根据鉴定的鸽新型腺病毒（FJ2017株，GenBank登录号为MF576429）六邻体蛋白蛋白（Hexon基因）序列特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：N-PiAd-F3：5′- CGACAATGGAACGACGTATGTGA -3′和N-PiAd-R3：5′-CATCGGGACTAAATGCGTATGT -3′，用于扩增约716 bp的Hexon基因片段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

以提取的鸽新型腺病毒（FJ2017株）核酸DNA为模板进行PCR扩增，使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液 25 μL、上下游引物（N-PiAd-F3和N-PiAd-R3）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5min后进入循环，94℃变性50 s 、55℃退火35s、72 ℃延伸50 s，30个循环结束后，72℃终延伸10 min。

PCR反应结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将鸽新型腺病毒的Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（N-PiAd-F3和N-PiAd-R3）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T-N-PiAd2），连续10倍稀释后，计算出对应的拷贝数，分装后置于-20 ℃保存备用。

3.2.3 TaqMan实时荧光定量PCR反应条件优化和标准曲线的建立

按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书配制25 μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度（52、54、56、58、60、62和64 ℃）、引物浓度（2.5、5.0、10和20μmol/L）及探针浓度（1.25、2.5、5.0、10和20 μmol/L）下，对反应条件进行优化。分别以标准品（T-N-PiAd2）不同稀释度的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）。

优化出最佳反应体系为：Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)混合液12.5 μL、上/下游引物（N-PiAd-F和N-PiAd-R）（10 μmol/L）各0.5 μL、探针（N-PiAd-P）（5 μmol/L）1 μL、模板2 μL、灭菌双蒸水补足至25 μL。最佳反应条件为：95℃ 1 min预变性；95℃ 10 s、62℃20s，共40个循环。

从扩增动力学曲线（图4）可以看出，本研究建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为9.75拷贝/μL。以每个浓度标准品模板中拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸽新型腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线（见图5）的线性方程为y=－3.3223x+37.335，相关系数为0.998，扩增效率为99%，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。

3.2.4 特异性检测

用优化后的TaqMan实时荧光定量PCR条件分别对鸽源其他常见病原（如鸽圆环病毒、鸽瘟病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒）进行检测。

结果可见（图6），对鸽源其他常见病原（如鸽圆环病毒、鸽瘟病毒、鸽源禽1型副粘病毒和鸽源禽甲肝病毒）均无反应信号，仅对鸽新型腺病毒检测出现荧光信号。

3.2.5 重复性试验

用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为9.75×10⁵、9.75×10⁴、9.75×10³、9.75×10²、9.75×10¹和9.75×10⁰拷贝/μL的标准品进行检测，每种质粒含量重复4次，计算组内（intra-group）变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20 ℃保存，每隔7 d取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测4次，计算组间（inter-group）变异系数。

结果可见（见表2），建立的TaqMan实时荧光定量PCR 方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.35-1.32%，组间变异系数0.56-1.77%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

表2实时荧光定量PCR变异系数

3.3 双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书配制25μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度（56、58、60、62和64 ℃）、引物（PiTTV-F/PiTTV-R、N-PiAd-F/ N-PiAd-R）浓度（1.25、2.5、5、10、20、40 μM）、探针（PiTTV-P、N-PiAd-P）浓度（1.25、2.5、5、10、20、40 μM）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。以鸽TTV阳性标准品（T-PiTTV2）和鸽新型腺病毒阳性标准品（T-N-PiAd2）为模板，在605nm处选择ROX通道，在520nm处选择FAM通道，观察双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的最适合引物浓度、探针浓度和反应条件。

结果：优化出的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法最佳反应体系（25 μL）如下表3。

表3 优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系

*注意：临床检测时，直接加入2μL待检测样品提取的核酸DNA。

结果：优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为： 95 ℃预变性60 s；95 ℃ 变性10s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。

实验结果的判定：

实时荧光定量PCR反应结束后，分析试验结果，在605nm处选择ROX通道见有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸽TTV感染；在520nm处选择FAM通道见有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸽新型腺病毒感染；若605nm处选择ROX通道和520nm处选择FAM通道均见有阳性扩增信号，表明样品中存在鸽TTV和鸽新型腺病毒感染。

4 临床样品的检测

对65份临床送检鸽源病料进行鸽TTV和鸽新型腺病毒感染的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测，用商品化病毒核酸提取试剂盒提取相应的DNA，按照建立双重TaqMan实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在605nm处选择ROX通道见有61份样品阳性扩增信号，表明61份检测样品中存在鸽TTV感染，阳性率为93.85%（61/65）；在520nm处选择FAM通道见有5份样品阳性扩增信号，表明5份检测样品中存在鸽新型腺病毒感染，阳性率为7.69%（5/65）；其中还有2份样品在605nm处选择ROX通道和520nm处选择FAM通道均有扩增信号，表明该2份样品中存在鸽TTV和鸽新型腺病毒感染，阳性率为3.08%（2/65）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鸽TTV和鸽新型腺病毒双重Real time PCR检测试剂盒

<130> 10

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcatctgaaa tcaaggta 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgtgggattc ctgaatag 18

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcatcaaca gcttgaccat tccac 25

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtgctttct agcgtata 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttggtcgaa gtaattgc 18

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtcctcctt gttcattcac tggt 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctctttcgtg ccaagttgtc cct 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgtctgcgtt gtggtgtagt 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgacaatgga acgacgtatg tga 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

catcgggact aaatgcgtat gt 22

Claims

1.鸽TTV和鸽新型腺病毒双重Real time PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下引物和探针：

用于检测鸽TTV：

上游引物PiTTV-F：5’- GCATCTGAAATCAAGGTA -3’，

下游引物PiTTV-R：5’- TGTGGGATTCCTGAATAG -3’，

荧光探针PiTTV-P：5’- CTCATCAACAGCTTGACCATTCCAC -3’；

用于检测鸽新型腺病毒：

上游引物N-PiAd-F：5’- GGTGCTTTCTAGCGTATA -3’，

下游引物N-PiAd-R：5’- GTTGGTCGAAGTAATTGC -3’，

荧光探针N-PiAd-P：5’- TGTCCTCCTTGTTCATTCACTGGT -3’。

2.根据权利要求1所述的鸽TTV和鸽新型腺病毒双重Real time PCR检测试剂盒，其特征在于：鸽TTV的荧光探针PiTTV-P的5′端标记有荧光报告基团ROX、鸽新型腺病毒的荧光探针N-PiAd-P的5′端标记有荧光报告基团FAM；鸽TTV的荧光探针PiTTV-P的3′端和鸽新型腺病毒的荧光探针N-PiAd-P的3′端均标记淬灭基团Eclipse。