CN107400736B

CN107400736B - 鸭2型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN107400736B
Application number: CN201710881240.0A
Authority: CN
Inventors: 万春和; 黄瑜; 程龙飞; 陈翠腾; 施少华; 傅光华; 傅秋玲; 陈红梅; 刘荣昌
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2037-09-26
Also published as: CN107400736A

Abstract

本发明属于动物传染病学检测领域，本发明公开了鸭2型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。该方法根据鸭2型腺病毒基因组保守序列设计引物组：外引物F3和B3；内引物FIP和BIP；环引物LB。具体序列分别见SEQ ID NO.1‑5。根据所设计的引物建立一种检测鸭2型腺病毒的环介导等温扩增方法。该检测方法与鸭常见传染病病原不发生交叉反应。本发明的检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高，无需昂贵仪器设备，便于基层临床现场使用，方便快速。

Description

鸭2型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种鸭2型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，属于动物传染病学检测领域。

背景技术

腺病毒基因组全长约为33 kd，基因组为线性双链DNA；该类病毒颗粒为无囊膜的核衣壳呈二十面体对称，其中腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白，分别为六邻体蛋白（Hexon）、纤维蛋白 (Fiber)和五邻体蛋白（Penton）。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。

鸭2型腺病毒（duck adenovirus 2，DAdV-2）是近年来利用病毒宏基因组学发现的一种鸭新型腺病毒（鸭2型腺病毒），该病主要发生在20～30日龄鸭中，以肝和脾肿大、出血为主要特征，死亡率约为7％。但是，核苷酸同源性分析比较发现，鸭2型腺病毒（GR株）和鸭腺病毒A型（duck adenovirus A，DAdV-A）分离株在Hexon基因的核苷酸同源性约为50.0%。通过对其基于Hexon蛋白的遗传进化分析发现，所有鸭腺病毒A型分离株在遗传进化上均处于相同的亚分支，且和绵羊腺病毒D型（OAV287株）均处于富AT腺病毒属遗传进化分支。但鸭2型腺病毒和禽腺病毒A型Phelps株（鸡源）与P29株（鹅源）处于同一遗传进化分支，均属于禽腺病毒属遗传进化分支。目前，关于鸭2型腺病毒致病性的研究较少，致病机理等相关研究还未见涉及。所以，建立一种简单实用的检测方法对鸭2型腺病毒的防控有着重要意义。

目前，在对新鉴定的传染病病原的检测方法主要是基于核酸水平的检测，如PCR方法、实时荧光定量PCR方法（real time PCR）和环介导等温扩增( loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)反应等方法。但是普通的PCR方法以及灵敏度更高的荧光定量PCR方法，均需要使用精密仪器，对实验人员有较高的技术要求等，无法在基层实验室广泛使用。

环介导等温扩增方法可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列。相对于现有的其他核酸扩增技术，LAMP具有许多独特的优点：①LAMP技术可以在等温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高。②LAMP技术扩增的特异性非常高，使用的特异性引物可以识别目的序列上特异性的区域，对目的序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响。③阳性扩增反应中会产生大量的类似花椰菜结构的产物和白色焦磷酸续沉淀，扩增产物的检测方法多样，可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加人染料，根据颜色的变化通过荧光照射装置进行紫外光照射检测；还可以利用浊度仪，根据扩增产物混浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析。此外，LAMP方法还具有特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度（60℃～65℃），大大降低了检测的费用，特别适合基层和现场使用。目前，还未见针对鸭2型腺病毒环介导等温扩增(LAMP)反应方法的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测鸭2型腺病毒的环介导等温扩增反应的引物组及其试剂盒。应用该引物组可为基层现场检测提供一种简便、快捷的检测鸭2型腺病毒的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

所述检测鸭2型腺病毒的环介导等温扩增方法的引物组，是由一对外引物、一对内引物和一条环引物组成，其中所述的外引物由F3和B3、内引物由FIP和BIP和环引物LB组成。上述3类引物的序列如下：

F3：5’- TGGTGTAGACCCATCGTCTT -3’，

B3： 5’- GCAGCAACAACAAGTTCTTGA -3’，

FIP：5’- ACCACCGAGCTCCAATATTTGTGA-TACATGAACAAGCGTGTTCCTC -3’，

BIP：5’- AATCACCACAGAAACTGGGGTCTC-ACTTGAATGTGGAACGGACAG -3’，

LB: 5’- TCTCAACTGTTAGGAAATAGCAGA -3’。

一种含所述引物组的检测试剂盒，所述试剂盒还包括：荧光目视检测试剂、2×反应缓冲液、所述的引物组、BstDNA聚合酶、超纯水。

所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

所述的2×反应缓冲液包括pH8.8 Tris-HCl为40 mM、KCl为20 mM、MgSO₄为16 mM、（NH₄）₂SO₄为20 mM、Tween20为0.2wt.%、Betaine为1.6 M、dNTPs mixture每种均为2.8 mM。

LAMP反应体系25μL：2×反应缓冲液 12.5μL，40 pmol FIP和BIP 各 1μL，40 pmolF3和B3 各 0.5 μL，5 pmol L B 1μL，BstDNA聚合酶1μL，荧光目视检测试剂1μL，待检样品DNA模板2μL，其余用超纯水补足至25μL。

说明：环引物LB也可以不加入反应体系（不加入时，使用超纯水补足反应体系），但加入环引物LB可节约LAMP的反应时间。若不加入环引物LB，最适反应时间需重新优化。此外，环引物有时可设计出一组（2条引物），分别为LB和LF。此时加入环引物组（LB和LF）可节约LAMP的反应时间。若不加入环引物组（LB和LF），最适反应时间需重新优化。

本发明还提供了所述的环介导等温扩增反应的引物组及其在制备鸭2型腺病毒快速诊断试剂中的用途。

本发明具有以下优点和效果：

1、特异性强、灵敏度高：本发明建立的LAMP方法检测出鸭2型腺病毒，所检测的阴性对照样品（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒）和水对照样品均无阳性结果出来，和PCR检测结果一致。但是LAMP方法较常规PCR灵敏度高100倍左右，最低检测限为84 copy/μL。

2、操作简便、快速：本发明建立的LAMP方法操作简便、无需复杂昂贵仪器。此外，建立的LAMP方法快速高效，从提取样品到结果判定可在1h内完成（时效性和TaqMan实时荧光定量PCR方法相当）。反应结果判定方法简单，在可见光下将阳性、阴性结果进行对比。肉眼可见阳性样品管反应液明显浑浊，阴性管样品管反应液颜色变化不大。经紫外线照射装置（波长240-260nm或350-370nm）照射可见，阳性样品发出翠绿色的荧光，阴性样品则没有。必要时，可进行常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性样品可见有不连续梯状电泳条带。

3、污染小：本试剂盒的荧光目视试剂（FD）在反应前加入，污染小。其含有的钙黄绿素起初与锰离子结合而处于荧光粹灭状态。但是随着LAMP反应的进行，被反应副产物中的焦磷酸根离子夺去结合的锰离子，钙黄绿素恢复游离态从而发出荧光，并进而与反应液中的镁离子相结合，使荧光信号得到增强。

附图说明

图1为鸭2型腺病毒LAMP特异性实验（直接观察），其中1：鸭2型腺病毒；针对性的病原对照6种，分别为：2：鸭瘟病毒；3：鸭腺病毒A型；4：番鸭细小病毒；5：鸭大肠杆菌；6：鸭疫里氏杆菌；7：鸭源禽多杀性巴氏杆菌。

图2 为鸭2型腺病毒LAMP方法敏感性试验（琼脂糖电泳）。其中1：DNA分子量标准2000；2：8.4×10⁵ copy/μL；3：8.4×10⁴ copy/μL；4：8.4×10³ copy/μL；5：8.4×10² copy/μL；6：8.4×10¹ copy/μL；7：8.4×10⁰ copy/μL；8：阴性对照。

具体实施方式

下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。

实施例1

一、实验方法

1 试验毒株和菌株

试验用病原鸭2型腺病毒、鸭瘟病毒、鸭腺病毒A型、番鸭细小病毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

2 核酸DNA的提取

用北京全式金生物技术有限公司（也可用其他商品化公司等效试剂盒）的EasyPure Viral DNA/RNA Kit按照说明书方法进行操作提取鸭2型腺病毒DNA，并按照试剂盒的方法同时提取试验对照毒株和菌株的DNA，均放置-20℃保存备用。

3 LAMP检测方法的建立

3.1 LAMP的引物设计

根据GenBank中登录的所有鸭2型腺病毒基因Hexon基因序列特征，利用分子生物学软件进行分析比较，选择鸭2型腺病毒（FJ2016/PT21株、GenBank登录号MF770575）Hexon基因组保守区域片段，利用LAMP引物设计的在线网站(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)设计引物，包括外引物1对（F3和B3）、内引物1对（FIP和BIP）和环引物一条（LB），具体序列见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5 。将设计好的相关引物，经NCBI数据库进行BLAST分析，符合试验预期。

利用设计的外引物（F3和B3）（内引物FIP和BIP在外引物扩增区域以内，条带较短，常规PCR检测易和引物二聚体混淆，故本发明仅进行引物BLSAT分析）对鸭2型腺病毒、鸭瘟病毒、鸭腺病毒A型、番鸭细小病毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌进行常规PCR扩增，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（F3和B3，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为：94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃35 s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。结果仅F3和B3对鸭2型腺病毒扩增出现特异性目的条带；对其他病原DNA（如鸭瘟病毒、鸭腺病毒A型、番鸭细小病毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）均未见特异性条带扩增。上述结果表明设计的相关引物无交叉干扰，特异性强。

3.2 LAMP方法的建立和优化

按照环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒（SLP204 Laoopamp DNA 扩增反应试剂盒）配置LAMP试验反应液，反应体系为25μL。每25μL反应体系中含有：2×反应液12.5μL、BstDNA大片段聚合酶1μL、F3和B3（浓度为40 pmol）各1μL、FIP和BIP（浓度为40 pmol）各0.5 μL、LB（浓度为5 pmol）1 μL、以提取的鸭2型腺病毒阳性标准品为模板2μL、Loopamp试剂1μL，补充超纯水至终体积25μL。实验不同温度（60℃、62℃、64℃、66℃）、不同时间（10min、20min、30min、40min、50min）检测引物组反应性能。优化后的反应条件为62℃反应30min。

3.3 LAMP检测方法的特异性试验

取鸭2型腺病毒、鸭瘟病毒、鸭腺病毒A型、番鸭细小病毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌提取的DNA，分别用优化后的LAMP条件进行检测。

3.4 LAMP检测方法的敏感性试验

3.4.1 阳性标准品的构建

设计引物针对鸭2型腺病毒的Hexon基因的用于制备标准品质粒的引物（DAV2-F2和DAV2-R2），其上游引物DAV2-F2（引物序列为：5’- TGAAGACTACACTGCATCTCT -3’）和下游引物DAV2-R2（引物序列为：5’- ATCAGTGTTGTCTATGCT -3’）进行PCR扩增含有靶序列的基因片段（目的片段大小为622bp）。

使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液 25 μL、上下游引物（DAV2-F2和DAV2-R2）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1μL、提取的核酸模板DNA 1 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5 min后进入循环，94℃变性50 s 、55℃退火30s、72 ℃延伸35s，30个循环结束后，72℃终延伸10 min。

PCR反应结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将鸭2型腺病毒的Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DAV2-F2和DAV2-R2）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T-DAV2-Hexon），分装后置于-20 ℃保存备用。

对鸭2型腺病毒Hexon基因片段构建的阳性标准品（T-DAV2-Hexon）进行连续稀释（质粒浓度分别为8.4×10⁵，8.4×10⁴，8.4×10³，8.4×10²，8.4×10¹和8.4×10⁰拷贝/μL），按照优化后的LAMP条件进行检测，获得其敏感性试验数据。

4 建立的LAMP检测方法的临床应用

对本研究室收集的112份鸭组织病料经研磨处理后，按照商品化试剂盒提取相应的基因组DNA，按照优化后的LAMP条件进行检测。

LAMP反应体系25μL：2×反应缓冲液 12.5μL，40 pmol FIP和BIP 各 1μL，40 pmolF3和B3 各 0.5 μL，5 pmol LB 1μL，BstDNA聚合酶1μL，荧光目视检测试剂1μL，待检测的样品DNA模板2μL，其余用超纯水补足至25μL。

二、实验结果

2.1 结果判定

经紫外线照射装置（350-370nm）照射可见，阳性样品（鸭2型腺病毒FJ2016/PT21株）发出翠绿色的荧光，阴性样品（鸭瘟病毒、鸭腺病毒A型、番鸭细小病毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）均未见可见荧光（见图1）。

2.2 敏感性试验判定

反应结束后，经紫外线照射装置（350-370nm）照射可见，鸭2型腺病毒的浓度在8.4×10¹ copy/μL（即84 copy/μL）（见图2）时为最低检测限。将结果进行常规琼脂糖凝胶电泳可见，在8.4×10⁵ copy/μL、8.4×10⁴ copy/μL、8.4×10³ copy/μL、8.4×10² copy/μL和8.4×10¹ copy/μL（即84 copy/μL）均可见有不连续梯状电泳条带。

2.3 临床样品的检测

对本研究室收集的112份鸭组织病料经研磨处理后，按照商品化试剂盒提取相应的基因组DNA，按照优化后的LAMP条件进行检测。结果可见，3份鸭2型腺病毒感染阳性，阳性率为2.68%（3/112）。

将112份LAMP样品利用报道的文献（陈亮，等。鸭2型腺病毒的分离鉴定及hexon基因的序列分析，中国兽医科学，2016，46（12）：1538-1542）的方法进行检测，结果和LAMP检测的结果一致，符合率为100%。将相关阳性样品利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收后克隆测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鸭2型腺病毒的hexon基因片段，核苷酸片段同源性在99.1%以上。在遗传进化上均处于鸭2型腺病毒hexon基因分支。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鸭2型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒

<130> 7

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggtgtagac ccatcgtctt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcagcaacaa caagttcttg a 21

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accaccgagc tccaatattt gtgatacatg aacaagcgtg ttcctc 46

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatcaccaca gaaactgggg tctcacttga atgtggaacg gacag 45

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctcaactgt taggaaatag caga 24

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgaagactac actgcatctc t 21

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atcagtgttg tctatgct 18

Claims

1.一种鸭2型腺病毒环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的引物由1对外引物F3和B3、1对内引物FIP和BIP和1条环引物LB组成，上述引物序列如下：

F3：5’- TGGTGTAGACCCATCGTCTT -3’，

B3： 5’- GCAGCAACAACAAGTTCTTGA -3’，

FIP：5’- ACCACCGAGCTCCAATATTTGTGA-TACATGAACAAGCGTGTTCCTC -3’，

BIP：5’- AATCACCACAGAAACTGGGGTCTC-ACTTGAATGTGGAACGGACAG -3’，

LB: 5’- TCTCAACTGTTAGGAAATAGCAGA -3’。

2.一种含权利要求1所述引物组的鸭2型腺病毒检测试剂盒。