CN113234862A

CN113234862A - 非洲猪瘟病毒lamp检测引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN113234862A
Application number: CN202110667279.9A
Authority: CN
Inventors: 俞国华; 杨小燕; 戴爱玲; 林楚云; 范克伟; 刘建奎; 黄翠琴; 杨守深; 尹会方; 李晓华; 王鑫; 包银莉
Original assignee: Longyan University
Current assignee: Longyan University
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2041-06-16
Also published as: CN113234862B

Abstract

本发明公开了非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组及试剂盒，非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组包括6条引物，具体核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒包含上述引物组外，还包含Bst DNA聚合酶、dNTP、MgSO₄、Betaine、10ＸLAMP反应缓冲液、HNB、阳性对照质粒等成分。本试剂盒具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点，不仅适用于大型养殖单位和高端实验室，也适用于广大中小养殖单位和普通实验室。

Description

非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组及试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种急性、烈性、高病死率的传染病。非洲猪瘟病毒(ASFV)是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，病毒颗粒呈二十面体，有囊膜，基因组为双股线状DNA，长度在170-190kB左右。

由于目前为止，非洲猪瘟没有有效的疫苗和治疗方法，自2018年8月首次传入我国后，迅速传遍我国的大江南北，给我国的生猪养殖业造成了巨大的损失。非洲猪瘟是一种毁灭性动物传染病，被称为养猪业的头号杀手，具有重大的政治、经济和社会影响。

目前，非洲猪瘟的防控主要依靠消灭传染源和切断传播途径两种方式。而要达到以上两个目的，传染源的快速确诊就是前提。由于荧光PCR具有灵敏度高、特异性好、检测时间短、检测通量高等优点，是非洲猪瘟病毒快速检测的主要方法。

但是，通过荧光PCR检测ASFV存在以下两个问题：(1)配套仪器成本高：要使用该产品，必须有配套的荧光定量PCR仪，而这些仪器都非常昂贵，至少是几万元，甚至几十万元，这大大增加了检测的成本；(2)使用范围受限：这些仪器必须由具有专业知识的技术人员才能操作，这也大大限制了产品的使用范围。这导致：目前，非洲猪瘟病毒的检测只能在大型养殖单位或高端实验室进行，而占市场主体的广大中小养殖单位和普通实验室无法自己进行检测，只能委托第三方检测。

LAMP(Loop Mediated Isothermal Amplification，环介导等温基因扩增技术)是一种新型的核酸扩增技术，在2000年由日本科学家发明。该技术具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点。利用该技术开发的产品，具有以下两个优点：(1)配套仪器成本低：一个普通水浴锅即可完成检测反应；(2)使用范围大大扩展：不仅大型养殖单位和高端实验室可以使用，广大中小养殖单位和普通实验室也可以使用。

发明内容

为了克服非洲猪瘟病毒荧光PCR检测方法固有的两个缺点(即配套仪器成本高和使用范围受限)，本发明的目的在于提供洲猪瘟病毒LAMP检测引物组及试剂盒，利用LAMP恒温扩增技术，结合指示剂HNB(Hydroxynaphthol blue,羟基萘酚蓝)，开发一款可视化的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，该产品具有灵敏度良好，配套仪器简单、结果可视化、操作容易等一系列优点。

本发明是通过如下技术方案实现的：

首先，选取ASFV的P72基因的保守序列，设计了针对P72基因的LAMP检测引物组，具体序列如下：

SEQ ID NO.1(P72-F3)：5′-ggatactgagggaatagcaag-3′

SEQ ID NO.2(P72-B3)：5′-gtgtagccataccaacccga-3′

SEQ ID NO.3(P72-FIP):5′-ttacagctgtaatggacctcaaacttagcgcaacttaatccagagc-3′

SEQ ID NO.4(P72-BIP):5′-cattacgtcttatgtccagatacgttatccaaacagcaggtaaacaag-3′

SEQ ID NO.5(P72-LF):5′-ctaaatactatcagccccctc-3′

SEQ ID NO.6(P72-LB):5′-tgcgtccgtgataggagtaat-3′

其次，将以上6条P72基因LAMP检测引物组与以下试剂组合即构成可以检测ASFV的试剂盒，具体该试剂盒包括以下成分：P72基因LAMP检测引物组2μL(其中P72-F3和P72-B3各20μM，P72-FIP和P72-BIP各160μM，P72-LF和P72-LB各80μM)、8Units/μL Bst DNA聚合酶2.4μL、25mM dNTP 3μL、150mM MgSO₄ 2μL、5M Betaine 10μL、10X LAMP反应缓冲液6μL、3mMHNB(Hydroxynaphthol blue,羟基萘酚蓝)2.4μL、用去离子水补足到40μL。检测时，加入DNA样品20μL，反应总体积为60μL。

试剂盒中的HNB也可以用其它对反应结果起指示作用的指示剂或荧光染料代替，比如：钙黄绿素、SYTO-9、SYBR Green、Eva Green等。

每次实验需要同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照加入含P72基因片段的质粒、阴性对照加入去离子水。

反应条件：62℃,75min。反应可以在普通PCR仪上进行，也可以在普通水浴锅内进行。

反应结果的判断：阳性对照的反应结果为深蓝色，阴性对照的反应结果为紫红色。如果待测样品反应管的颜色与阳性对照相同(呈深蓝色)，则说明待测样品ASFV的检测结果为阳性。如果待测样品反应管的颜色与阴性对照相同(呈紫红色)，则说明待测样品ASFV的检测结果为阴性。

含P72基因片段的质粒的制备：我们合成了ASFV P72基因LAMP扩增对应的DNA片段并将其连接到质粒pGH上，该质粒命名为pGH-P72(791)，用作ASFV P72 LAMP检测时的阳性对照，其具体序列如SEQ ID NO.7所示。

SEQ ID NO.7(ASFV P72基因部分片段)：

5’-cgcagcgaacgtgtagccataccaacccgaaatttctttcacagcattttcccgagaactctcacaatatccaaacagcaggtaaacaagatattactcctatcacggacgcaacgtatctggacataagacgtaatgttcattacagctgtaatggacctcaaacccctaaatactatcagccccctcttgcgctctggattaagttgcgcttttggtttaatgagaacgtgaaccttgctattccctcagtatccattcccttcggcg-3’

本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点，不仅适用于大型养殖单位和高端实验室可以使用，也适用于广大中小养殖单位和普通实验室。

附图说明

图1为非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测结果。结果显示：经62℃反应75min后，阳性对照反应管呈深蓝色(右侧两个反应管)，而阴性对照管呈紫红色(左侧两个反应管)。

图2为非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测试剂盒灵敏度测试结果。将pGH-P72(791)质粒做4倍系列稀释后，使用本试剂盒进行检测。测试结果显示：经62℃反应75min后，4^(0)-4^(-7)所有稀释度呈深蓝色而4^(-8)-4^(-11)呈紫红色。该结果说明：本试剂盒的最高灵敏度可以达到4^(-7)稀释度，经计算该稀释度含有的pGH-P72(791)质粒拷贝数为7.2个拷贝。

图3为非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测试剂盒对临床样品的检测结果，同时与普通PCR检测结果进行对比。LAMP结果中，“-”代表阴性结果，“+”代表阳性结果；而PCR结果中，“-”代表阴性结果，“+”代表弱阳性结果，“++”代表阳性结果，“+++”代表强阳性结果。结果显示：99个临床样品中，LAMP试剂盒检测出了44个阳性样品，检出率为45.8％；而普通PCR法检测出了36个阳性样品，检出率为38.3％。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步详细说明，但其内容不构成对本发明的限制。

实施例1

非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因LAMP检测引物组的设计

根据已公布的ASFV P72基因不同基因型的核酸序列，设计了针对非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测引物组，具体序列如下：

SEQ ID NO.1(P72-F3)：5′-ggatactgagggaatagcaag-3′

SEQ ID NO.2(P72-B3)：5′-gtgtagccataccaacccga-3′

SEQ ID NO.3(P72-FIP):5′-ttacagctgtaatggacctcaaacttagcgcaacttaatccagagc-3′

SEQ ID NO.4(P72-BIP):5′-cattacgtcttatgtccagatacgttatccaaacagcaggtaaacaag-3′

SEQ ID NO.5(P72-LF):5′-ctaaatactatcagccccctc-3′

SEQ ID NO.6(P72-LB):5′-tgcgtccgtgataggagtaat-3′

ASFV P72基因LAMP检测时的阳性对照质粒的制备:我们合成了ASFV P72基因LAMP扩增对应的DNA片段并将其连接到质粒pGH上，该质粒命名为pGH-P72(791)，用作ASFV P72LAMP检测时的阳性对照，其具体序列如SEQ ID NO.7所示。

SEQ ID NO.7(ASFV P72基因部分片段)：

非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因LAMP检测试剂盒组成如下：P72基因LAMP检测引物组2μL(其中P72-F3和P72-B3各20μM，P72-FIP和P72-BIP各160μM，P72-LF和P72-LB各80μM)、8Units/μL Bst DNA聚合酶2.4μL、25mM dNTP 3μL、150mM MgSO₄ 2μL、5M Betaine 10μL、10X LAMP反应缓冲液6μL、3mM HNB(Hydroxynaphthol blue,羟基萘酚蓝)2.4μL、用去离子水补足到40μL。检测时，加入DNA样品20μL，反应总体积为60μL。

阳性对照为pGH-P72(791)质粒而阴性对照为去离子水的ASFV P72基因LAMP检测结果如图1所示。结果显示：经62℃反应75min后，阳性对照反应管呈深蓝色，而阴性对照管呈紫红色。该结果说明：所设计P72基因LAMP检测引物组可以检测出含P72基因相应片段的样品。

实施例2

非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测试剂盒灵敏度测试。

将pGH-P72(791)质粒做4倍系列稀释，稀释度从4^(0)-4^(-11)，然后使用本试剂盒对各稀释度进行检测。

测试结果显示：经62℃反应75min后，从4^(0)-4^(-7)所有稀释度呈深蓝色，而4^(-8)-4^(-11)所有稀释度呈紫红色。该结果说明：本试剂盒的最高灵敏度可以达到4^(-7)稀释度，经计算该稀释度含有的pGH-P72(791)质粒拷贝数为7.2个拷贝。

以上结果说明：本发明公布的非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测试剂盒灵敏度良好，其最高检测灵敏度可达7.2个拷贝的目标分子。

实施例3

非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测试剂盒对临床样品的检测。

利用本发明的非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测试剂盒对94个临床样品进行检测，同时与普通PCR检测结果进行对比。

普通PCR检测引物为：(1)P72-PPA1(115f)：5’-agttatgggaaacccgaccc-3’；(2)P72-PPA2(371r)：5’-ccctgaatcggagcatcct-3’，扩增循环数为40个循环，样品DNA加入量为2μL。

结果显示：99个临床样品中，本发明的LAMP试剂盒检测出了44个阳性样品，检出率为45.8％；而普通PCR法检测出了36个阳性样品，检出率为38.3％。可见，本发明的非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测试剂盒的检出率已经超过普通PCR法(40个循环)的检出率，效果良好。

总之，本发明的非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点。该试剂盒不仅适用于大型养殖单位和高端实验室，也适用与广大中小养殖单位和普通实验室。

序列表

<110> 龙岩学院

<120> 非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组及试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggatactgag ggaatagcaa g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtgtagccat accaacccga 20

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttacagctgt aatggacctc aaacttagcg caacttaatc cagagc 46

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cattacgtct tatgtccaga tacgttatcc aaacagcagg taaacaag 48

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctaaatacta tcagccccct c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tgcgtccgtg ataggagtaa t 21

<210> 7

<211> 270

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cgcagcgaac gtgtagccat accaacccga aatttctttc acagcatttt cccgagaact 60

ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tatcacggac gcaacgtatc 120

tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct aaatactatc 180

agccccctct tgcgctctgg attaagttgc gcttttggtt taatgagaac gtgaaccttg 240

ctattccctc agtatccatt cccttcggcg 270

Claims

1.非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组，该引物组可以检测非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72的编码基因，其特征在于，该引物组包括6条引物，6条引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.6所示，具体如下所示：

SEQ ID NO. 1 (P72-F3)：5′ -ggatactgagggaatagcaag-3′

SEQ ID NO. 2 (P72-B3)：5′ -gtgtagccataccaacccga-3′

SEQ ID NO. 3 (P72-FIP): 5′ -ttacagctgtaatggacctcaaacttagcgcaacttaatccagagc-3′

SEQ ID NO. 4 (P72-BIP): 5′ -cattacgtcttatgtccagatacgttatccaaacagcaggtaaacaag-3′

SEQ ID NO. 5 (P72-LF): 5′ -ctaaatactatcagccccctc-3′

SEQ ID NO. 6 (P72-LB): 5′ -tgcgtccgtgataggagtaat-3′。

2.非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含Bst DNA聚合酶、dNTP、MgSO₄、Betaine、10Ｘ LAMP反应缓冲液、对反应结果起指示作用的指示剂或荧光染料。

4.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述对反应结果起指示作用的指示剂或荧光染料为HNB、钙黄绿素、SYTO-9、SYBR Green或Eva Green。

5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的各组分及其含量如下：引物组 2 μL，8 Units /μL Bst DNA聚合酶 2.4 μL、25 mM dNTP 3 μL、150 mM MgSO₄2 μL、5 M Betaine 10 μL、10Ｘ LAMP反应缓冲液 6 μL、3 mM HNB 2.4 μL、用去离子水补足到40 μL；

所述引物组中，各引物的摩尔浓度如下：P72-F3和P72-B3的摩尔浓度均为20 μM，P72-FIP和P72-BIP的摩尔浓度均为160 μM，P72-LF和P72-LB的摩尔浓度均为80 μM。

6.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阳性对照质粒。

7.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为：62 ℃, 75 min。